Summary
Vi har utvecklat en analys cellfusion som kvantifierar SNARE-medierade händelser membranfusion genom aktiverad expression av β-galaktosidas.
Abstract
Samspelet mellan SNARE (s oluble N-etylmaleimid-känslig faktor en ttachment protein re Ceptor) proteiner på vesiklar (v-Snares) och mål membran (t-Snares) katalyserar intracellulär vesikelfusion 1-4. Rekonstituering analyser är väsentliga för dissekera mekanismen och regleringen av SNARE-medierad membran fusion 5. I en cellfusion analys 6,7, är SNARE-proteiner uttrycks ektopiskt vid cellytan. Dessa "vänt" SNARE-proteiner drive cell-cellfusion, vilket demonstrerar att Snares är tillräckliga för att smälta cellmembran. Eftersom cellfusionen analys är baserad på mikroskopisk analys, är det mindre effektivt när det används för att analysera flera v-och t-SNARE interaktioner kvantitativt.
Här beskriver vi en ny analys 8 som kvantifierar SNARE-medierade händelser cellfusion genom aktiverad expression av β-galaktosidas. Tvåkomponenter Tet-Off genuttryck systemet 9 används som ett avläsningssystem: den tetracyklin-kontrollerad transaktivator (tTA) och en reporter-plasmid som kodar för LacZ-genen under kontroll av den tetracyklin-svarselementet (TRE-LacZ). Vi transfektera tTA in i COS-7-celler som uttrycker vänt v-SNARE proteiner vid cellytan (v-celler) och transfektera TRE-LacZ in i COS-7-celler som uttrycker vänt t-SNARE proteiner vid cellytan (t-celler) . SNARE-beroende fusion av V-och T-celler resulterar i bindning av tTA till TRE, den transkriptionella aktiveringen av LacZ och expression av β-galaktosidas. Aktiviteten av β-galaktosidas kvantifieras med användning av en kolorimetrisk metod genom absorbans vid 420 nm.
De vesikel-associerade membranproteiner (Vamps) är V-snaror som finns i olika post-Golgi vesikulära fack 10-15. Genom att uttrycka vamps 1, 3, 4, 5, 7 och 8 på samma nivå, jämför vi deras membranfusionaktiviteter med hjälp av enzymatisk analys cellfusion. Baserat på spektrometrisk mätning, erbjuder denna analys en kvantitativ metod för att analysera SNARE-medierad membran fusion och för hög kapacitet studier.
Protocol
1. Cellodling och transfektion
- COS-7-celler odlas i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 4,5 g / liter glukos och 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Plasmidtransfektion sker med Lipofectamine enligt tillverkarens anvisningar (Invitrogen).
2. Fluorescens mikroskopisk analys av cellyte SNARE Uttryck
- Dagen före transfektion, 3 x 10 4 COS-7-celler såddes på sterila 12-mm täckglas (Fisher Scientific) som ingår i 24-brunnars plattor.
- För v-celler i varje brunn, 0,25 pg av plasmiden som kodar för tTA (ptet-Off, CLONTECH) samtransfekteras med 0,25 pg av plasmiderna som uttrycker vänt vamps.
- För T-celler i varje brunn, är 0,25 | ig av plasmid som kodar TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) samtransfekterades med 0,25 pg vardera av plasmiderna som uttrycker vänt SNAP-25 och syntaxins 1 eller 4.
- 24 h efter transfection, celler fixerades med 4% paraformaldehyd i PBS + + (PBS kompletterad med 0,1 g / liter CaCb 2 och 0,1 g / liter MgCl 2) under 10 min, och sedan blockerades i 10% FBS i PBS + + för 30 minuter.
- Cellerna inkuberas under 1,5 h med anti-Myc monoklonal antikropp 9E10 (ren hybridom kultursupernatant).
- Efter fyra tvättar med PBS + +, cellerna inkuberas under 1 timme med FITC-konjugerade sekundära antikroppar (Jackson Immunoresearch Laboratories) vid en spädning av 1:500.
- Efter fyra tvättar med PBS + +, de märkta cellerna monterade i förlänga guld antifad reagens (Invitrogen).
- Konfokala bilder samlas på en Olympus laserskanning konfokalmikroskop. Bilderna bearbetas med Adobe Photoshop.
3. FACS-analys av cellyte SNARE Uttryck
- Dagen före transfektion, 2 x 10 5 COS-7-celler ympas i varje brunn i 6-brunnsplattor.
- 24 timmar efter transfection med vänt SNARE, ptet-Off och pBI-G plasmider, celler fixerades med 1% paraformaldehyd i PBS + + under 15 min, och sedan blockerades i 10% FBS i PBS + + under 15 min.
- Cellerna inkuberas med anti-Myc monoklonal antikropp 9E10 för 60 minuter.
- Efter tre tvättningar med PBS + +, cellerna märks med FITC-konjugerade sekundära antikroppar (1:200 spädning) i 45 min.
- Efter tre tvättningar med PBS + +, cellerna skrapades bort från plattorna med en cellskrapa.
- 15.000 celler analyseras med användning av en FACSCalibur flödescytometer (BD Biosciences). Den genomsnittliga fluorescensintensiteten av varje prov erhålles genom att använda CellQuest Pro.
4. Enzymatisk Cellfusion Analys
- Dagen före transfektion, 1,2 x 10 6 COS-7-celler ympas i varje 100-mm vävnadsodlingsskål, och 2 x 10 5 COS-7-celler ympas i varje brunn i 6-brunnsplattor.
- För v-celler, från 0,5 till 5 pg vardera av Flipped VAMP plasmiden samtransfekteras med 5 pg ptet-Off in cellerna i varje 100-mm odlingsskål. Kontroll celler samtransfekteras med den tomma vektorn pcDNA3.1 (+) och ptet-Off. För att förhindra N-glykosylering av vamps 1, 4, 5, 7 och 8, tunikamycin (10 pg / ml) ingår i cellkulturmedium under transfektion.
- För T-celler i varje brunn i 6-brunnsplattor, vänt 1 pg av SNAP-25 plasmid och pBI-G samtransfekteras med 0,5 | ig av vänt syntaxin1 plasmid eller 0,05 ng vänt syntaxin4 plasmiden.
- 24 timmar efter transfektion, är v-cellerna lösgörs från odlingsskålar med enzymfri Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Lösgjorda celler räknas med en hemacytometer och resuspenderades i HEPES-buffrad DMEM kompletterat med 10% FBS, 6,7 pg / ml tunikamycin och 0,67 mM DTT.
- 4,8 x 10 5 återsuspenderades v-celler sätts till varje brunn som redan innehåller t-cellerna.
- Efter 6, 12 eller 24 tim råtta 37 ° C i 5% CO 2
- Efter 90 min, den kolorimetriska reaktionen avbröts genom tillsats av 1 karbonat M natriumklorid.
- Absorbans vid 420 nm mäts med användning av en HITACHI 100-40 spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att utveckla en kvantitativ analys cellfusion, tar vi fördel av den starka transkriptionsaktivering genom bindning av tTA till TRE. I frånvaro av tTA, är transkription av LacZ-genen i TRE-LacZ tyst. När tTA är närvarande, binder den till TRE och aktiverar transkriptionen av LacZ. Figur 1 visar ett flödesschema av den enzymatiska cellfusion analys. tTA transfekteras in v-celler som uttrycker v-SNARE proteiner vid cellytan, och TRE-LacZ transfekteras in i T-celler som uttrycker T-SNARE proteiner vid cellytan. Fusion av V-och T-celler resulterar i bindning av tTA till TRE, den transkriptionella aktiveringen av LacZ, och uttryck av β-galaktosidas.
Figur 2A illustrerar domänstrukturen av spegelvänd SNARE konstruktioner. Den preprolactin signalsekvensen är fuserad till N-terminalerna av snaror. Dessa konstruerade snaror kallas "vänt"Snaror eftersom orienteringen av deras SNARE motiv mot cellmembran vänds. När COS-7-celler transfekteras med vänt SNARE plasmider, bläddrade SNARE proteiner uttrycks vid cellytan (figur 2B). Flödescytometri användes för att mäta uttrycksnivåer av SNARE protein vid cellytan (figur 2C och D). För att jämföra deras kapacitet membranfusion, VAMPS måste uttryckas på samma nivå. Därför, titrerad vi och optimerat koncentrationen av varje vänt SNARE-plasmid användes i transfektion. Bläddrade SNARE plasmider transfekteras vid följande koncentrationer (per 10 cm 2 tillväxtområde, dvs per brunn i 6-brunnar): VAMP1, 0,2 pg, VAMP3, 0,5 pg, VAMP4, 0,5 pg, VAMP5, 0,05 pg; VAMP7, 1,0 pg; VAMP8, 0,1 pg; syntaxin1, 0,5 pg; syntaxin4, 0,05 pg. TTA, TRE-LacZ och vänt SNAP-25 samtransfekterades med 1 pg per 10 cm 2 tillväxtområde. Enligt framgångsrikah förhållanden, 1 Vamps, 3, 4, 5, 7 och 8 är uttryckta på samma nivå, medan syntaxins 1 och 4 uttrycks på samma nivå på cellytan (Figur 2D). Såsom visas genom konfokal och faskontrast bildanalys (figur 2E), är 80% av COS-7-celler transfekterade med spegelvänd SNARE plasmider. Dubbel märkning bildanalys (figur 2F) visar att 70% av de transfekterade v-celler uttrycker både tTA och vänt VAMP proteiner. Eftersom LacZ genen i TRE-LacZ inte uttrycks före cellfusion, kan vi inte avgöra andelen transfekterade T-celler som uttrycker både TRE-LacZ och vänt t-SNARE proteiner.
De neuronala snaror (v-SNARE VAMP2 och t-Snares syntaxin1 och SNAP-25) som förmedlar synaptisk exocytos används för att testa genomförbarheten av analysen. Det är när de v-celler som uttrycker VAMP2 och T-celler som uttrycker syntaxin1/SNAP-25 kombineras, robusta β-galactosidase uttryck detekteras (figur 3). Emellertid, när antingen VAMP2 eller SNAP-25 inte uttrycks, är endast baslinje β-galaktosidasaktivitet detekterades, vilket indikerar att cellfusion och uttrycket av β-galaktosidas beroende interaktioner mellan V-och t-snaror. Dessa resultat indikerar att den enzymatiska cellfusion analys identifierar fusogena parningar mellan V-och t-snaror effektivt.
Genom att uttrycka VAMP proteiner på samma nivå på cellytan (Figur 2D), jämför vi deras verksamhet membranfusion. Med syntaxin1/SNAP-25 t-Snares, 1 Vamps, 3 och 8 har jämförbara och de högsta fusionsforskning, medan Vamps 4 och 7 har 50% och 30% lägre fusionsforskning respektive (Figur 4). När däremot VAMP5 kombineras med t-snaror, endast baslinje β-galaktosidasaktivitet detekterades (figur 4), vilket tyder på att VAMP5 inte driver membranfusion med Syntaxin1/SNAP-25.
Figur 1. Enzymatisk cellfusion analys. tTA samtransfekteras med spegelvänd v-SNARE plasmider, och TRE-LacZ samtransfekteras med vänt t-SNARE plasmider. Fusion av V-och T-celler leder till bindningen av tTA till TRE och uttrycket av β-galaktosidas, som mäts med en kolorimetrisk metod.
Figur 2. Uttryck av vänt snaror vid cellytan. (A) Domän struktur vänt snaror. Den preprolactin signalsekvensen (SS) är fusionerad till N-terminalerna av snaror, och en Myc-tag är införd mellan signalsekvensen och motiven SNARE (coiled-coil). (B) COS-7-celler samtransfekteras med tTA och den tomma vektorn pcDNA3.1 (+) eller vänt VAMP5 plasmiden. 24timmar efter transfektion, är unpermeabilized celler färgade med en anti-Myc monoklonal antikropp. Representativa singel-slice konfokala bilderna visas. (C och D) 24 timmar efter samtransfektion med tTA och pcDNA3.1 (+) eller vänd Vamps (v-celler), eller 24 timmar efter samtransfektion med TRE-LacZ, vänt SNAP-25 och syntaxins 1 eller 4 (t-celler ), är unpermeabilized celler färgade med anti-Myc-antikropp och analyserades genom flödescytometri. (C) Representativa FACS profiler av celler transfekterade med pcDNA3.1 (+) eller vänt VAMP1 plasmiden. Den genomsnittliga fluorescensintensitet för varje prov bestäms med hjälp av CellQuest Pro. (D) För att uttrycka vamps på samma nivå och uttrycka syntaxins 1 och 4 på samma nivå på cellytan, bläddrade SNARE plasmider transfekteras vid titrerade koncentrationer. Visas är de genomsnittliga fluorescensintensiteterna hos cellytan färgning av SNARE proteinerna. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 4 oberoende experiment. (E och F) 24 timmar efter cotransfe Insatser med tTA och vänt VAMP5 plasmiden celler permeablized med 0,2% Triton X-100 i PBS + + och (E) färgades med anti-Myc-antikropp, eller (F) dubbel färgades med anti-Myc monoklonal antikropp och en polyklonal antikropp till TET-repressorn (för att upptäcka tTA). (E) som visas är representativa konfokala och fas bilder kontrast. Antalet transfekterade celler som är märkta med anti-Myc-antikropp (VAMP5) och det totala antalet celler i faskontrast kanalen räknas (n = 60 celler), och transfektionseffektivitet beräknas (80%). (F) Antalet transfekterade celler som uttrycker både VAMP5 och tTA, och det totala antalet transfekterade celler som uttrycker VAMP5, tTA eller båda räknas (n = 75 transfekterade celler). Procentandelen av de transfekterade cellerna som uttrycker både VAMP5 och tTA beräknas sedan (70%). Skala barer, 20 um. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Cellfusion beror på växelverkan av v-och t-snaror. v-celler som uttrycker tTA och VAMP2 inkuberas med T-celler som uttrycker TRE-LacZ, syntaxin1 och SNAP-25. Efter 24 timmar, cellerna lyseras och aktiviteten av β-galaktosidas i cellysaten bestäms med användning av en kolorimetrisk metod genom absorbans vid 420 nm. Endast baslinje b-galaktosidas aktivitet upptäcks när antingen vänt VAMP2 eller SNAP-25-plasmiden utelämnas från transfektion.
Figur 4. Jämförelse av fusion verksamhet vamps. Under optimerade betingelser transfektion, 1 Vamps, 3, 4, 5, 7 och 8 är uttryckta på samma nivå vid cellytan hos v-celler. 24 timmar efter att kombinera v-cellerna med T-celler som exTryck syntaxin1/SNAP-25 är cellfusion kvantifieras med hjälp av enzymatisk analys cellfusion. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 4 oberoende experiment. ** P <0,01, *** P <0,001 vs VAMP1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ursprungliga cellfusion analys 6 bestämmer SNARE-medierade händelser cellfusion genom fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi en innovativ analys som kvantifierar SNARE-medierade händelser cell fusion genom aktivt uttryck av β-galaktosidas och spektrometrisk mätning. Med användning av denna analys, analyserar vi rutinmässigt 15 till 20 V-och t-SNARE kombinationer i ett enda experiment. Med flödescytometri för att mäta SNARE uttryckning vid cellytan, titreras vi expressionsnivåerna av VAMPS och jämföra deras kapacitet membranfusion (fig 2 och 4). Vidare, med hjälp av enzymatisk analys cellfusion, bestämde vi beroendet av cellfusion aktivitet på cellytan densitet VAMP1 protein och observerade ingen kooperativitet av VAMP1 protein i cellfusionen reaktionen 8, vilket tyder på att samordning av flera SNARE-komplex inte krävs att smälta cellmembran.
Det finns förmodade N-glykosylering motivationfs (Asn-X-Ser/Thr) i SNARE-proteiner. Eftersom N-glykosylering hämmar fusion verksamhet bläddrade SNARE proteinerna 6 har två tillvägagångssätt använts för att förhindra glykosylering av spegelvänd SNARE proteiner. Först är glykosylering plats mutationer introduceras i bläddrade SNARE konstruerar 6. Andra, som beskrivs i det nuvarande protokollet är N-glykosylering hämmare tunikamycin (6,7 ng / ml) som ingår i cellfusion reaktionen. Dessutom, är 0,67 mM DTT tillsatt i cellfusion reaktionen för att förhindra bildningen av disulfidbindningar mellan vänt SNARE-proteiner, som skulle hämma SNARE fusion aktiviteter. Våra experiment visar att tillsats av 6,7 pg / ml tunikamycin och 0,67 mM DTT i cellodlingsmedium inte stör proliferationen och överlevnaden av COS-7-celler. Vi avsluta rutinmässigt reaktionen cellfusion vid 24 h efter kombinera V-och T-celler. Dock betydande SNARE-medierad cellfusion upptäckt 6 timmar efter att kombinera v-and t-celler 8. Eftersom den enzymatiska cellfusion reaktionen beror på uttrycket av β-galaktosidas efter cellfusion, släpar tidsförloppet för denna avläsningssystemet tidsförloppet för membranfusion medieras av spegelvänd SNARE-proteiner.
Den enzymatiska cellfusion analys ger en kvantitativ beredning analys för att undersöka verksamheten membranfusion potentiella V-och t-SNARE interaktioner i däggdjursceller. Av samuttrycker reglerande proteiner (t.ex. Munc18) och snaror vid cellytan eller genom att inkludera rekombinanta regulatoriska proteiner i cellfusion reaktionen, kan denna analys användas för att belysa de reglerande mekanismerna för SNARE-medierad membranfusion. Dessutom bör denna analys har tillämpningar inom high-throughput screening för hämmare eller aktivatorer av SNARE-medierad membran fusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av start medel från University of Louisville och CA135123 från National Institutes of Health (till CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E.
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C.
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H.
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
