Summary
Vi har udviklet en cellefusion assay, der kvantificerer SNARE-medierede membranfusionsteknikker begivenheder ved aktiveret ekspression af β-galactosidase.
Abstract
De interaktioner mellem SNARE (s oluble N-ethylmaleimid-følsom faktor en ttachment protein re ceptor) proteiner på vesikler (v-Snares) og på målgrupperne membraner (t-Snares) katalyserer intracellulære vesikelfusion 1-4. Rekonstitutionsanvisninger assays er afgørende for at dissekere mekanismen og reguleringen af SNARE-medieret membranfusion 5. I en cellefusion assay 6,7, er SNARE proteiner udtrykt ektopisk på celleoverfladen. Disse "vendt" SNARE proteiner drive celle-celle fusion, hvilket viser, at snarer er tilstrækkelige til at smelte cellemembraner. Fordi cellefusion assay er baseret på mikroskopisk undersøgelse, er mindre effektiv, når anvendt til at analysere multiple v-og t-SNARE interaktioner kvantitativt.
Her beskriver vi en ny assay 8, der kvantificerer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder med aktiveret ekspression af β-galactosidase. Tokomponenter i Tet-Off genekspressionssystem 9 anvendes som en tæller systemet: tetracyclin-reguleret transaktivator (tTA), og et reporterplasmid, der koder for LacZ-genet under kontrol af tetracyclin-responselement (TRE-LacZ). Vi transficere tTA i COS-7-celler, som udtrykker vippet v-SNARE proteiner på celleoverfladen (V-celler) og transficere TRE-LacZ i COS-7-celler, som udtrykker vippet t-SNARE proteiner på celleoverfladen (T-celler) . SNARE-afhængig fusion af V-og T-celler resulterer i binding af tTA til TRE, den transkriptionelle aktivering af LacZ og ekspression af β-galactosidase. Aktiviteten af β-galactosidase kvantificeres ved hjælp af en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm.
De vesikel-associerede membranproteiner (overlæder) er V-Snares, der bor i forskellige post-Golgi vesikulær rum 10-15. Ved at udtrykke Vamps 1, 3, 4, 5, 7 og 8 på samme niveau, sammenligne vi deres membran fusion, som anvender den enzymatiske cellefusion assay. Ud fra spektrometrisk måling, giver dette assay en kvantitativ fremgangsmåde til analyse SNARE-medieret membranfusion og for højt gennemløb undersøgelser.
Protocol
1. Celledyrkning og transfektion
- COS-7-celler dyrkes i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 4,5 g / l glucose og 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Plasmid transfektion udført med lipofectamin ifølge producentens instruktioner (Invitrogen).
2. Fluorescence mikroskopisk analyse af Cell Surface SNARE Expression
- Dagen før transfektion, 3 × 10 4 COS-7-celler podes på sterile 12-mm dækglas (Fisher Scientific) i 24-brønds plader.
- For v-cellerne i hver brønd, 0,25 ug af plasmidet, der koder for tTA (pTet-Off, CLONTECH) er cotransficeret med 0,25 ug af plasmiderne, der udtrykker vippet overlæder.
- For T-celler i hver brønd, er 0,25 ug af plasmidet kodende TRE-LacZ (pBI-G, CLONTECH) cotransficeret med 0,25 ug hvert af plasmiderne, som udtrykker vippet SNAP-25 og syntaxins 1 eller 4.
- 24 timer efter transfection, cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS + + (PBS suppleret med 0,1 g / l CaCl2 og 0,1 g / l MgCl2) i 10 min, og derefter blokeret i 10% FBS i PBS + + i 30 min.
- Cellerne inkuberes i 1,5 timer med anti-myc monoklonale antistof 9E10 (ren hybridomkultursupernatant).
- Efter fire vaske med PBS + +, cellerne inkuberes i 1 time med FITC-konjugerede sekundære antistoffer (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ved en fortynding på 1:500.
- Efter fire vaske med PBS + +, er de mærkede celler monteret i Forlæng Gold antiblegemiddel reagens (Invitrogen).
- Konfokale billeder indsamles på et Olympus laserscanning konfokal mikroskop. Billederne bearbejdes med Adobe Photoshop softwaren.
3. FACS-analyse af celleoverflade-SNARE Expression
- Dagen før transfektion 2 x 10 5 COS-7 celler podes i hver brønd i plader med 6 brønde.
- 24 timer efter transfection med det vendte SNARE, pTet-Off og pBI-G plasmider blev celler fikseret med 1% paraformaldehyd i PBS + + i 15 minutter, og derefter blokeret i 10% FBS i PBS + + i 15 min.
- Cellerne inkuberes med anti-myc monoklonalt antistof 9E10 for 60 min.
- Efter tre gange vask med PBS + +, cellerne mærket med FITC-konjugerede sekundære antistoffer (1:200 fortynding) i 45 minutter.
- Efter tre gange vask med PBS + +, cellerne skrabes af pladerne med en celleskraber.
- 15.000 celler analyseres under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver prøve opnået under anvendelse af CellQuest Pro software.
4. Enzymatisk Cell Fusion Assay
- Dagen før transfektion, 1,2 x 10 6 COS-7 celler podes i hver 100 mm vævsdyrkningsskål, og 2 x 10 5 COS-7 celler podes i hver brønd i plader med 6 brønde.
- For v-celler, 0,5-5 ug af hver af Flipped VAMP plasmid cotransficeret med 5 ug pTet-Off i cellerne i hver 100 mm dyrkningsskål. Kontrolceller cotransficeres med tom vektor pcDNA3.1 (+) og pTet-Off. For at forhindre N-glycosyleringen af overlæder 1, 4, 5, 7 og 8, tunicamycin (10 ug / ml) er inkluderet i celledyrkningsmedium under transfektion.
- For T-celler i hver brønd i plader med 6 brønde, vendt 1 ug af SNAP-25-plasmidet og pBI-G cotransficeres med 0,5 pg af vendt syntaxin1 plasmid eller 0,05 ug vendt syntaxin4 plasmid.
- 24 timer efter transfektion er de v-celler adskilt fra dyrkningsskåle med enzymfri Cell Dissociation Buffer (Invitrogen). Løsnede celler tælles med hæmacytometer og resuspenderet i HEPES-bufret DMEM suppleret med 10% FBS, 6,7 ug / ml tunicamycin og 0,67 mM DTT.
- 4,8 x 10 5 resuspenderet v-celler tilsættes til hver brønd, der allerede indeholder T-cellerne.
- Efter 6, 12 eller 24 hr rotte 37 ° C i 5% CO2
- Efter 90 minutter er den kolorimetriske reaktion standses ved tilsætning af 1 M natriumcarbonat.
- Absorbans ved 420 nm måles ved anvendelse af et Hitachi 100-40 spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At udvikle en kvantitativ cellefusion assay udnytter vi den stærke transkriptionel aktivering ved binding af tTA til TRE. I fravær af tTA, er transskription af lacZ-genet i TRE-LacZ tavse. Når tTA er til stede, bindes den til TRE og aktiverer transkriptionen af LacZ. Figur 1 viser et rutediagram af den enzymatiske cellefusion assay. tTA transficeres ind v-celler, som udtrykker v-SNARE proteiner på celleoverfladen, og TRE-LacZ-transficeres ind i T-celler, der udtrykker t-SNARE proteiner på celleoverfladen. Fusion af V-og T-celler resulterer i binding af tTA til TRE, den transkriptionelle aktivering af LacZ, og ekspressionen af β-galactosidase.
2A illustrerer domænestrukturen af vippet SNARE konstruktioner. Den preprolactin signalsekvens fusioneret til N-termini i snarer. Disse manipulerede Snares kaldes 'vendt'Snarer fordi orienteringen af deres SNARE motiver mod cellemembraner vippes. Når COS-7-celler blev transficeret med vendt SNARE plasmider, vendt SNARE proteiner udtrykkes på celleoverfladen (figur 2B). Flowcytometri anvendes til at måle ekspressionsniveauerne af SNARE proteiner på celleoverfladen (figur 2C og D). For at kunne sammenligne deres membranfusionsteknikker kapacitet, overlæder skal udtrykkes på samme niveau. Vi derfor titreres og optimeret koncentrationen af hver vendt SNARE plasmid anvendes i transfektion. Vendt SNARE plasmider transfekteres ved følgende koncentrationer (per 10 cm2 vækstområde, dvs per brønd i plader med 6 brønde): VAMP1, 0,2 ug, VAMP3, 0,5 ug, VAMP4, 0,5 ug, VAMP5, 0,05 ug; VAMP7, 1,0 ug; VAMP8, 0,1 ug, syntaxin1, 0,5 ug, syntaxin4, 0,05 ug. tTA, TRE-LacZ og vendt SNAP-25 blev cotransficeret med 1 ug pr 10 cm 2 vækstområde. Under such betingelser, overlæder 1, 3, 4, 5, 7 og 8 er udtrykt på samme niveau, mens syntaxins 1 og 4 er udtrykt på samme niveau på celleoverfladen (figur 2D). Som vist ved konfokal og fasekontrast billedanalyse (fig. 2E), er 80% af COS-7 celler transficeret med vippet SNARE plasmider. Dobbelt mærkning imaging analyse (figur 2F) viser, at 70% af de transficerede v-celler udtrykker både tTA og vendt vamp proteiner. Da LacZ-genet i TRE-LacZ ikke udtrykkes inden cellefusion, vi ikke i stand til at bestemme procentdelen af transficerede T-celler, der udtrykker både TRE-LacZ og vendt t-SNARE proteiner.
De neuronale snarer (v-SNARE VAMP2, og t-Snares syntaxin1 og SNAP-25), som medierer synaptisk exocytose anvendes til at vise, om assayet. Faktisk, når v-celler, der udtrykker VAMP2 og T-celler, der udtrykker syntaxin1/SNAP-25 kombineres, robust β-galactosidase ekspression detekteres (figur 3). Når enten VAMP2 eller SNAP-25 ikke udtrykkes, kun baseline β-galactosidase-aktivitet påvises, hvilket viser, at cellefusion og ekspressionen af β-galactosidase er afhængige af interaktioner af V-og t-snarer. Disse resultater viser, at den enzymatiske cellefusion assay identificerer fusogene bindinger mellem v-og t-snarer effektivt.
Ved at udtrykke vamp proteiner på samme niveau på celleoverfladen (figur 2D), sammenligner vi deres membranfusionsteknikker aktiviteter. Med t-Snares syntaxin1/SNAP-25, vampyrer 1, 3 og 8 har sammenlignelige og de højeste fusionsaktiviteterne, hvorimod overlæder 4 og 7 har 50% og 30% lavere fusionsaktiviteterne, henholdsvis (Figur 4). I modsætning hertil, når VAMP5 kombineres med t-snarer kun baseline β-galactosidase-aktivitet detekteres (figur 4), hvilket antyder, at VAMP5 ikke resulterer membranfusion med SYNTaxin1/SNAP-25.
Fig. 1. Enzymatisk cellefusion assay. tTA er cotransficeret med vippet v-SNARE plasmider, og TRE-LacZ er cotransficeret med vippet t-SNARE plasmider. The fusion af V-og T-celler fører til binding af tTA til TRE og ekspressionen af β-galactosidase, som måles ved en kolorimetrisk fremgangsmåde.
Figur 2. Ekspression af vendt snarer ved celleoverfladen. (A) Domain struktur af vendt snarer. The preprolactin-signalsekvens (SS) er fusioneret til den N-terminale ender af snarer, og et Myc-mærke er indsat mellem signalsekvensen og SNARE motiver (coiled-coil). (B) COS-7-celler cotransficeret med tTA og tom vektor pcDNA3.1 (+) eller omvendt VAMP5 plasmid. 24timer efter transfektion, er unpermeabilized celler farvet med et anti-Myc monoklonalt antistof. Repræsentative single-slice konfokale billeder vises. (C og D) 24 timer efter cotransfektion med tTA-og pcDNA3.1 (+) eller omvendt overlæder (v-celler) eller 24 timer efter cotransfektion med TRE-LacZ, vendt SNAP-25 og syntaxins 1 eller 4 (T-celler ) er unpermeabilized celler farvet med anti-Myc-antistof og analyseret med flowcytometri. (C) Repræsentative FACS-profiler af cellerne transficeret med pcDNA3.1 (+) eller omvendt VAMP1 plasmid. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af hver prøve bestemmes ved anvendelse af CellQuest Pro software. (D) For at udtrykke overlæder på samme niveau og udtrykke syntaxins 1 og 4 på samme niveau på celleoverfladen, vendt SNARE plasmider transfekteres med titrerede koncentrationer. Vist er de gennemsnitlige fluorescensintensiteter af celleoverfladefarvning af SNARE proteiner. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse for fire uafhængige forsøg. (E og F) 24 timer efter cotransfe Indsatsen med tTA og vendt VAMP5 plasmid, celler permeablized med 0,2% Triton X-100 i PBS + + og (E) farvet med anti-Myc-antistof, eller (F) dual farvet med anti-Myc-monoklonalt antistof og et polyklonalt antistof mod Den tet-repressoren (til påvisning af tTA). (E) vist er repræsentative konfokal og fase kontrastrige billeder. Antallet af transficerede celler, der er mærket med anti-Myc-antistof (VAMP5) og det totale antal celler i fasekontrast kanal tælles (n = 60 celler), og transfektionseffektivitet er beregnet (80%). (F) Antallet af transficerede celler, som udtrykker både VAMP5 og tTA, og det samlede antal af transficerede celler, som udtrykker VAMP5, tTA eller begge tælles (n = 75 transficerede celler). Procentdelen af de transficerede celler, som udtrykker både VAMP5 og tTA beregnes derefter (70%). Scale barer, 20 um. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Cellefusion afhænger af interaktioner mellem v-og t-snarer. v-celler, som udtrykker tTA og VAMP2 inkuberes med T-celler, som udtrykker TRE-LacZ, syntaxin1 og SNAP-25. Efter 24 timer lyseres cellerne, og aktiviteten af β-galactosidase i cellelysaterne bestemmes ved anvendelse af en kolorimetrisk metode ved absorbans ved 420 nm. Kun baseline B-galactosidase-aktivitet påvises ved enten vendt VAMP2 eller SNAP-25 plasmid udeladt fra transfektionen.
Figur 4. Sammenligning af fusionsaktiviteterne af vampyrer. Under optimerede transfektion betingelser, overlæder 1, 3, 4, 5, 7 og 8 er udtrykt på samme niveau på celleoverfladen af V-celler. 24 timer efter at kombinere de v-celler med T-celler, extryk syntaxin1/SNAP-25 er cellefusion kvantificeres ved anvendelse af den enzymatiske cellefusion assay. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelse for fire uafhængige forsøg. ** P <0,01, *** p <0,001 vs VAMP1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den oprindelige cellefusion assay 6 bestemmer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder ved fluorescensmikroskopi. Her beskriver vi en innovativ assay, der kvantificerer SNARE-medierede celle fusionsbegivenheder med aktiveret ekspression af β-galactosidase og spektrometrisk måling. Anvendelse af dette assay, vi rutinemæssigt analyseres 15-20 v-og t-SNARE kombinationer i et enkelt eksperiment. Ved anvendelse af flowcytometri til måling SNARE ekspression på celleoverfladen, vi titreres ekspressionsniveauerne af overlæder og sammenlign membranfusionsteknikker kapacitet (fig. 2 og 4). Under anvendelse af den enzymatiske cellefusion assay, vi bestemt afhængighed af cellefusion aktivitet på celleoverfladen densitet på VAMP1-protein, og de observerede ingen kooperativitet af VAMP1 protein i cellen fusionsreaktion 8, hvilket antyder, at samordning af flere SNARE komplekser ikke kræves at fusionere cellemembranerne.
Der er putative N-glycosylering motiverefs (Asn-X-Ser/Thr) i SNARE proteiner. Fordi N-glycosylering inhiberer fusionsaktiviteterne af vendt SNARE proteinerne 6 er to fremgangsmåder blevet anvendt til at forhindre glycosyleringen af vippet SNARE proteiner. Først glycosylering-site mutationer indført i vendt SNARE konstruerer 6. For det andet, som beskrevet i den nuværende protokol, er den N-glycosylering inhibitor tunicamycin (6,7 mg / ml) indeholdt i cellefusion reaktionen. Desuden er 0,67 mM DTT tilsat i cellefusionen reaktionen for at forhindre dannelsen af disulfidbindinger mellem vippet SNARE-proteiner, som ville inhibere SNARE fusionsaktiviteter. Vores eksperimenter viser, at tilsætningen af 6,7 ug / ml tunicamycin og 0,67 mM DTT i cellekulturmedium ikke interfererer med proliferationen og overlevelsen af COS-7 celler. Vi rutinemæssigt afslutte cellefusion reaktionen ved 24 timer efter kombinere v-og T-celler. Imidlertid signifikant SNARE-medieret cellefusion detekteret 6 timer efter kombination v-and t-cellerne 8. Fordi den enzymatiske cellefusion reaktion afhænger af ekspressionen af β-galactosidase efter cellefusion, tidsforløbet for denne tæller systemet halter tidsforløbet for membranfusion medieret af vippet SNARE proteiner.
Den enzymatiske cellefusion assay giver en kvantitativ rekonstituering assay til analyse af de membranfusionsteknikker aktiviteter af potentielle v-og t-SNARE interaktioner i pattedyrceller. Ved at co-udtrykke regulatoriske proteiner (f.eks Munc18) og snarer på celleoverfladen eller ved at indbefatte rekombinante regulatoriske proteiner i cellefusion reaktionen kan dette assay anvendes til at belyse de regulatoriske mekanismer SNARE-medieret membranfusion. Desuden bør dette assay finde anvendelse i high-throughput screening for inhibitorer eller aktivatorer af SNARE-medieret membranfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af startup midler fra University of Louisville og CA135123 fra National Institutes of Health (til CH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
