Summary
שיטה לבודד את שלפוחית submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.
Abstract
המיטוכונדריה הוא מעורב בפונקציות רבות תאיות חשובות, כולל חילוף חומרים, הישרדות 1, פיתוח ו, סידן איתות 2. שניים מתפקידיו החשובים ביותר המיטוכונדריה קשורים לייצור יעיל של ה-ATP, מטבע האנרגיה של התא, על ידי זרחון חמצוני, והגישור של אותות למוות תאים מתוכנת 3.
האנזים האחראי בעיקר לייצור של ה-ATP הוא synthase F1FO-ATP, המכונה גם ה-ATP synthase 4-5. בשנים האחרונות, את תפקידו של המיטוכונדריה במוות של תאים אפופטוטיים ונימקים קיבלה תשומת לב רבה. במוות של תאים אפופטוטיים, Bcl-2 חלבונים משפחתיים כגון Bax להזין את הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, oligomerize וpermeabilize קרום החיצוני, משחררים גורמים פרו אפופטוטיים ל6 cytosol. במוות של תאי נמקי קלאסי, כגון זה המיוצר על ידי איסכמיה או הפעלת יתר רעילה בתאי עצב, largהדואר, גידול מוסדר היטב בסידן מטריצה תורם לפתיחה נקבובית קרום פנימי, נקבובית מעבר חדירות המיטוכונדריה או MPTP. זה depolarizes הקרום הפנימי וגורם למשמרות אוסמוטי, תורם לקרע חיצוני קרום, שחרור של גורמים פרו אפופטוטיים, ובעיות בתפקוד מטבולי. חלבונים רבים, כולל Bcl-XL 7 אינטראקציה עם ה-ATP synthase F1FO, ויסות תפקודו. Bcl-XL אינטראקציה ישירות עם מקטע הבטא של ה-ATP synthase F1FO, ואינטראקציה זו מקטינה מוליכות דליפה בתוך F1FOATPasecomplex, הגדלת התחבורה הנקי של H + על ידי F1FO במהלך F1FO פעילות ATPase 8 ויעילות ובכך להגדיל המיטוכונדריה. כדי לחקור את הפעילות והאפנון של ה-ATP synthase, אנחנו מבודדים משלפוחית submitochondrial מכרסם במוח (SMVs) המכיל F1FO ATPase. את SMVs לשמר את השלמות המבנית ותפקודית של ATPase F1FO כפי שמוצג בAlavian et al. כאן, אנו מתארים שיטהשאנחנו השתמשנו בהצלחה לבידודה של SMVs ממוח חולדה ואנו להתוות את טכניקת מהדק התיקון לניתוח פעילות ערוץ (מוליכות דליפת יון) של SMVs.
Protocol
1. בידוד מוח מיטוכונדריאלי (מעובד מתוך בראון MR et al. 9)
- להקריב את העכברוש תוך שימוש בשיטות שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).
- חותכים את ראשו של בעל החיים על ידי עריפת ראש, לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת.
- פתח את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך עם מספריים או rongeur. הסר את המוח.
- ברר היטב את המוח בלי המוח הקטן במאגר הבידוד (ראה טבלת מס '1) ולהעביר אותו ל5 מיליליטר זכוכית / טפלון homogenizer (ראה רשימת ציוד).
- Homogenize רקמות בעדינות 10 פעמים (אין בועות), כ 5 דקות.
- צנטריפוגה מדגם ב 1,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.
- שמור את supernatant (המיטוכונדריה וsynaptosomes) וזורקים את הכדור (חומר גרעיני ותא פסולת). צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.
- להשליךsupernatant מחדש להשעות גלולה ב 500 μl של הצפת בידוד. לשבש synaptosomes עם כלי שיבוש תא (ראה רשימת ציוד). החל לחץ של 1200 psi במשך 10 דקות, ואחרי לחץ מהיר.
- שכבת תערובת על הדרגתיים Ficoll (ראה טבלה 2), המקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 126,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C בultracentrifuge (ראה רשימת ציוד). גלולה היא המיטוכונדריה מטוהרת, השכבה בין הצפיפויות של Ficoll השונים היא synaptosomes בלא הפרעה.
- לשטוף גלולה ידי צנטריפוגה במאגר הבידוד ב16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה.
2. בידוד Submitochondrial שלפוחית (SMV) (מעובד מתוך צ'אן et al. 10)
- Re-להשעות המיטוכונדריה במאגר 200 בידוד μl בשילוב עם נפח שווה של 1% digitonin ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות.
- הוסף יותר בידוד Buffאה ו צנטריפוגות ב 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל עליונה. לעשות את זה פעמיים.
- Re-להשעות גלולה ב 200 הצפת בידוד μl ולהוסיף 2 μl של 10% Lubrol PX (C12E9). לערבב ולאפשר לשבת על קרח במשך 15 דקות.
- תערובת שכבת בידוד על הצפת, מקום בSW-50.1 הרוטור צנטריפוגות ב 182,000 × גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לשטוף סופי גלולה ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה שולחן עליונה בבידוד במאגר 16,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. הקלטת אלקטרו
- אסדת electrophysiology טיפוסית כוללת מגבר, מחשב PC מצויד בממשק ממיר Digidata 1440A אנלוגי לדיגיטלי בשיתוף עם pClamp10.0 תוכנה, מניפולטורים, מיקרוסקופ, שולחן בידוד רעידות, כלוב פאראדיי.
- צינורות נימי התכה של זכוכית בורה מוכנסים לתוך Flaming / בראון Micropipette פולר דגם P-87. תכנית פיפטה-חולץ היא מותאמת לליצור pipettes עם התנגדויות בין 80 עד 100 MΩ.
- SMVs ממוקמים בפתרון תאי פיסיולוגי (ATP הוא הוסיף בזמן המתאים במהלך ההקלטה) (לוח 3). pipettes צמד תיקון מלא עם אותו הפתרון (לא ה-ATP). הקלטות נעשות על ידי יצירת חותם גיגה אוהם על SMVs בטמפרטורת חדר. שלפוחית הם דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד למיקרוסקופ הפוך ניקון או Zeiss.
- פוטנציאל הממברנה נשמר במתח הנע בין -100 mV ל+ 100 mV לתקופות של 10 שניות. הקלטות מסוננות ב5 קילוהרץ באמצעות מעגלי המגבר. רמת הרעש חשמלי או שאינם ספציפי התועה של הרשות הפלסטינית הן פחות מ 1 רצויה להקלטה מוצלחת.
- הנתונים מנותחים עם תוכנת Clampfit 10.0 למשל כדי לקבוע תדר ומשרעת של אירועי ערוץ אחד. תלות מתח נקבעה על ידי מתכנן מערכת יחסים מתח נוכחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד הראשון של הפרוטוקול שלנו מאפשר לבידוד של מטוהרים המיטוכונדריה, כפי שמוצג על ידי כתם מערבי באיור 1. באיור 2 מוצג דוגמה להקלטת תיקון שלפוחית submitochondrial מוח נגזרת. שימוש בתצורת התיקון מבפנים החוצה אנחנו מדגימים פעילות מווסתת על ידי ערוץ ה-ATP. השליטה (CTL) הקלטה (משמאל) מראה פעילות ערוץ רבת מוליכות עם מוליכות שיא של 600 נ"ב בממוצע. שירד מייד עם תוספת של 1 מ"מ ה-ATP לאמבטיה. ההשפעה הכוללת של ה-ATP היא להפחית את המוליכות של טלאי SMVs באופן ריכוז תלוי. כדי למדוד את היעילות של F1FO ATPase לאחר בידוד, מדדנו את תנועתם של יוני H + לSMVs בתגובה להידרוליזה ה-ATP, כפי שמוצג באיור 3, מדידת הירידה בעוצמת הקרינה של SMV-נשלל H + מחוון ACMA. H-ATP רגיש + קיבוע יון לSMVs מוגבר לאחר להוסיףition של ה-ATP. assay זה יכול לשמש גם כדי למדוד את היעילות של H + קיבוע יון. SMVs היעילה פחות יצבור H + יונים לאט יותר או לשווי שיא קטן יותר. לדוגמא H + קיבוע יון הוא מוחלש על ידי התוספת של Bcl-XL מעכבים וFCCP (Alavian et al., 2011).
| ריכוז סופי | |
| סוכרוז | 250 מ"מ |
| Hepes | 20 מ"מ |
| EDTA | 1 מ"מ |
| BSA | 0.5% |
טבלת מס '1. מאגר הבידוד.
| Ficoll | 20% 22 מ"ל> |
| סוכרוז | M 12 מ"ל 1 |
| EDTA | 0.1 מ 'μl 18.75 |
| טריס-HCl | 375 1 ז μl (pH 7.4) |
| שכבה עליונה 7.5% מFicoll | |
| Ficoll מניית | 10 מ"ל |
| מאגר הבידוד | 6 מ"ל |
| שכבה תחתונה 10% מFicoll | |
| Ficoll מניית | 15.5 מ"ל |
| מאגר הבידוד | 2.5 מ"ל |
טבלת 2. מאגר Ficoll.
| KCl | 120 מ"מ |
| NaCl | 8 מ"מ |
| EGTA | 0.5 מ"מ |
| Hepes | 10 מ"מ |
| pH | 7.3 |
לוח 3. הפנימי סולוtion.
איור 1. immunoblot נציג lysate מטוהר מCytosol ומיטוכונדריה. הפנל העליון מראה immunoblot באמצעות נוגדן נגד חלבון GAPDH cytosolic. הפנל התחתון מראה immunoblot באמצעות נוגדן נגד CoxIV חלבון קרום innner המיטוכונדריה.
איור 2. הקלטת שתי נציג תיקון מהדק לפני ואחרי תוספת של 1 מ"מ ה-ATP. מחזיק פוטנציאל הוא +70 mV. הקו המקווקו מייצג 0 הרשות הפלסטינית. כל זכר מתועד עבור 10 שניות ויש 10 שניות בין עקבות.
איור 3. דוגמא עקבות של שינויי עוצמת הקרינה שלמחוון ACMA לאורך זמן בנוכחות SMVs ובהעדר (קו שחור) והנוכחות (עקבות אדומות) של ה-ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו במסמך זה יאפשר את בידודה של המיטוכונדריה טהורה בסוף השלב 1 ושלפוחית submitochondrial (SMVs) אחרי שלב 2 מהמוח כולו, ללא הבחנה של תא phenotypes.SMVspurified בשיטה זו בעצם נקיה מזיהום על ידי אברונים subcellular אחרים כפי שמוצג ב איור 1 והעבודה הקודמת שלנו (Alavian KN et al. 8) ולשמור על השלמות המבנית ותפקודית שלהם לפני ההקפאה. לאחר הקפאה והפשרה, מבודד המיטוכונדריה או SMVs משמשים להקלטות ומבחני ביוכימיים, אבל לא ללימודים בדרכי הנשימה.
יתר על כן שיטה זו ניתן להשתמש כדי לבודד המיטוכונדריה מכבד תוך שימוש באותן פעולות. בגלל המיטוכונדריה וSMVs נוטות ליצור אשכולות, כאשר מצופים לתוך תא הקלטת אלקטרו, תשומת לב צריך להינתן לטעינת המדגם, כפי שדילול מוגזם או הצטברויות מוגזמות עלולים להפחית possibiliטיי של היווצרות חותם. יתר על כן, תשומת לב צריכה להינתן לכמה פרטים טכניים לפני שמתחילה את הבידוד. זה חיוני כדי להשתמש בכלים נקיים ולשמור אותם על קרח. כל הנהלים צריכים להתבצע על קרח ואת כל הצנטריפוגות להגדיר עד 4 ° C. הכנת שיפוע Ficoll כראוי היא קריטית עבור ניסוי מוצלח. יצירת הפרדה מושלמת בין שני הריכוזים של Ficoll משפרת את הטוהר של שברים subcellular.
מגבלה של שיטה זו היא שהטילה את הסכום הסופי של חלבון, אשר יכול להיות קטן אם מדגם מאזור מסוים במוח הוא רצוי למשל המיטוכונדריה מsubstantia nigra pars compacta או סטריאטום. איגום דגימות מכמה בעלי חיים עשוי להיות נחוץ כדי לשפר את הכמות הכוללת של חלבון שנקטפו.
המיטוכונדריה או SMVs הם aliquoted ב1 מ"ג / מ"ל ולאחסן ב -80 ° C, והם יציבים להקלטות לכמה חודשים, לעומת זאת, זה preferablדואר לא מחדש להקפיא מדגם המיטוכונדריה לאחר ההפשרה. שלפוחית מטוהרים על ידי שיטה זו שימושיות כדי ללמוד את ה-ATP synthase, תוך שימוש בגישות שונות, כגון הקלטת תיקון מהדק, טכניקות ביוכימיות ומחקרים פונקציונליים אחרים. עם הכנה זו ניתן לנתח את ההשפעות של תרופות או מולקולות קטנות על פעילות F1FO ATPase ומבנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
