Summary
En fremgangsmåde til at isolere submitochondrial vesikler beriget i F1FO ATP synthase komplekser fra rottehjerne er beskrevet. Disse vesikler tillader undersøgelse af aktiviteten af F1FO ATPase kompleks og dets modulation ved hjælp af teknikken af patch clamp optagelse.
Abstract
Mitokondrier er involveret i mange vigtige cellulære funktioner, herunder metabolisme, overlevelse 1, udvikling og, calcium signalering 2.. To af de vigtigste mitokondrie funktioner er relateret til den effektive produktion af ATP, energi valuta af cellen, ved oxidativ phosphorylering, og formidling af signaler for programmeret celledød 3..
Enzymet primært ansvarlige for produktionen af ATP er den F1FO-ATP syntase, også kaldet ATP syntase 4-5. I de senere år har den rolle mitokondrier i apoptotisk og nekrotisk celledød genstand for betydelig opmærksomhed. I apoptotisk celledød, indtaste BCL-2 familie proteiner, såsom Bax den mitokondriske ydre membran, oligomerisering og permeabilisere ydre membran, frigiver pro-apoptotiske faktorer i cytosolen 6.. I klassisk nekrotisk celledød, som sådan, der produceres af iskæmi eller excitotoxicity i neuroner, en large, dårligt reguleret stigning i matrix calcium bidrager til åbningen af en indre membran pore, mitokondrie permeabilitetsovergang pore eller MPTP. Dette depolariserer den indre membran og forårsager osmotiske skift, der bidrager til ydre membran brud, frigivelse af pro-apoptotiske faktorer, og metabolisk dysfunktion. Mange proteiner, herunder Bcl-xL 7 interagerer med F1FO ATP syntase, modulerende funktion. Bcl-xL interagerer direkte med betaunderenhed af F1FO ATP syntase, og dette samspil nedsætter en lækage ledningsevne i F1FOATPasecomplex, øge netto transport af H + ved F1FO under F1FO ATPaseaktivitet 8 og dermed øger mitokondrie effektivitet. At studere aktivitet og modulation af ATP syntase, vi isoleret fra gnaverhjerne submitochondrial vesikler (SMVs) indeholdende F1FO ATPase. De SMVs bevarer den strukturelle og funktionelle integritet F1FO ATPase som vist i Alavian et al. Her beskriver vi en metodeat vi har anvendt med succes til isolering af SMVs fra rottehjerne og vi afgrænse patch-clamp-teknik til at analysere kanal aktivitet (ion lækage konduktans) af SMVs.
Protocol
1.. Brain Mitochondrial Isolation (Tilpasset fra Brown MR et al. 9)
- Sacrifice rotter ved hjælp af metoder, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
- Skær hovedet af dyret ved halshugning, skære huden og eksponere kraniet.
- Åbn kraniet forsigtigt ved at skære med en saks eller rongeur. Fjern hjernen.
- Hakkekød fint hjernen uden lillehjernen i Isolation Buffer (se tabel 1), og overføre det til en 5 ml glas / teflon homogenisator (se udstyrsliste).
- Homogenisere væv forsigtigt 10 gange (ingen bobler), ca 5 min.
- Centrifuger prøven ved 1.500 x g i 10 minutter ved 4 ° C i en bench-top centrifuge.
- Gem supernatanten (mitokondrie og synaptosomerne), og kassér pellet (nukleart materiale og celle debris). Centrifugeres ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C i en bench-top centrifuge.
- Kassérsupernatant og re-suspendere pellet i 500 ul Isolation Buffer. Sprænges synaptosomerne med cellesprængning fartøj (se udstyrsliste). Påføre et tryk på 1.200 psi i 10 minutter, efterfulgt af hurtig dekompression.
- Layer blandingen på Ficoll gradienter (se tabel 2), sted i SW-50.1 rotor og centrifugeres ved 126.500 x g i 20 min ved 4 ° C i en ultracentrifuge (se udstyrsliste). Pelleten er mitokondrier, laget mellem de forskellige tætheder af Ficoll er uafbrudt synaptosomer.
- Vask pellet ved centrifugering i Isolation Buffer ved 16.000 x g i 10 min ved 4 ° C i en bench-top centrifuge.
2.. Submitochondrial Blærer (SMV) Isolation (Tilpasset fra Chan et al. 10)
- Resuspender mitokondrier i 200 pi Isolation buffer kombineret med et lige så stort volumen 1% digitonin og tillade at sidde på is i 15 min.
- Tilsæt mere Isolation Buffis og centrifugeres ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C i en bench-top centrifuge. Gør dette to gange.
- Genopslæmmes pellet i 200 ul Isolation Buffer og tilsættes 2 pi 10% Lubrol PX (C12E9). Bland og lad det sidde på is i 15 min.
- Lag blandingen på Isolation Buffer, sted i SW-50.1 rotor og centrifugeres ved 182.000 x g ved 4 ° C i 1 time.
- Vask endelige pellet ved centrifugering i en desk-top centrifuge Isolation Buffer ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
3.. Elektrofysiologiske optagelse
- En typisk elektrofysiologi riggen omfatter en forstærker, en PC computer udstyret med en Digidata 1440A analog-til-digital konverter grænseflade i forbindelse med pClamp10.0 software, manipulatorer, et mikroskop, en vibration isolation tabel, Faradays bur.
- Borsilicatglashulsfærer kapillarrørene er indsat i en Flaming / Brown Mikropipette Puller Model P-87. En pipette-puller program er optimeret tilgenerere pipetter med modstande mellem 80 til 100 MOhm.
- SMVs er placeret i en fysiologisk intracellulært løsning (ATP tilsættes på et passende tidspunkt under optagelse) (tabel 3). Patch clamp pipetter er fyldt med den samme opløsning (ingen ATP). Optagelser fremstilles ved at danne en giga-ohm tætningen på SMVs ved stuetemperatur. Vesikler visualiseres med fasekontrast mikroskopi med et Nikon eller Zeiss inverteret mikroskop.
- Membranpotentialet holdes ved fra spændinger mellem -100 mV til + 100 mV i perioder på 10 sekunder. Optagelser filtreres ved 5 kHz med forstærkerkredsløbet. Niveau for omstrejfende elektriske eller ikke-specifik støj på mindre end 1 pA er ønskelige for en vellykket optagelse.
- Data analyseres med Clampfit 10,0 software for eksempel at bestemme frekvens og amplitude af enkelt kanal begivenheder. Spænding afhængighed er bestemt ved at plotte en aktuel spænding forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første trin af vores protokol muliggør isolering af mitokondrier, som vist ved Western blot i figur 1. I figur 2 er vist et eksempel på en hjerne-afledt submitochondrial vesikel patch optagelse. Brug af inside-out patch konfiguration, vi demonstrere kanalaktivitet moduleres af ATP. Styringen (CTL) optagelse (venstre) viser multi-ledningsevne-kanal aktivitet med et højdepunkt ledningsevne på 600 pS i gennemsnit. der blev straks reduceret ved tilsætning af 1 mM ATP til badet. Den samlede virkning af ATP er at nedsætte ledningsevnen af SMVs plastre i en koncentrationsafhængig måde. At måle effektiviteten af F1FO ATPase efter isolering, målte vi bevægelse af H +-ioner ind i SMVs i respons på ATP hydrolyse som vist i figur 3, måle faldet i fluorescensintensitet SMV udstødte H + indikator ACMA. ATP-følsomme H + ion binding til SMVs forstærkes efter addition af ATP. Dette assay kan anvendes til at måle effektiviteten af H +-ion binding. Mindre effektive SMVs vil akkumulere H +-ioner langsommere eller til en mindre top værdi. For eksempel H +-ion binding dæmpes ved tilsætning af Bcl-xL-inhibitorer og FCCP (Alavian et al., 2011).
| Slutkoncentration | |
| Saccharose | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
Tabel 1. Isolation Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Saccharose | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18,75 gl 0,1 M |
| Tris-HCI | 375 gl 1 M (pH 7,4) |
| Top Layer 7,5% af Ficoll | |
| Ficoll lager | 10 ml |
| Isolation Buffer | 6 ml |
| Bundlag 10% Ficoll | |
| Ficoll lager | 15,5 ml |
| Isolation Buffer | 2,5 ml |
Tabel 2. Ficoll lager.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabel 3. Intern Solution.
Figur 1. Repræsentativ immunblot lysat oprenset fra cytosolen og mitokondrier. Den øvre panel viser et immunblot anvendelse af et antistof mod cytosolprotein GAPDH. Det nederste panel viser et immunblot anvendelse af et antistof mod mitokondrier innner membranprotein CoxIV.
Figur 2. To repræsentative patch clamp optagelse før og efter tilsætning af 1 mM ATP. Holding potentiale er +70 mV. Den stiplede linie repræsenterer 0 pA. Hvert spor er indspillet i 10 sek, og der er 10 sek mellem spor.
Figur 3. Eksempel spor af fluorescensintensitets ændringerDen ACMA indikatoren over tid i overværelse af SMVs og i fravær (sorte trace) og nærvær (rød trace) i ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De heri beskrevne fremgangsmåder muliggøre isoleringen af ren mitokondrier ved afslutningen af trin 1 og submitochondrial vesikler (SMVs) efter trin 2 fra hele hjernen uden skelnen mellem celle phenotypes.SMVspurified ved denne fremgangsmåde er i det væsentlige fri for kontaminering med andre subcellulære organeller, som vist i Figur 1 og vores tidligere arbejde (Alavian KN et al. 8) og bevarer deres strukturelle og funktionelle integritet inden frysning. Efter nedfrysning og optøning, isolerede mitokondrier eller SMVs anvendes til optagelser og biokemiske assays, men ikke for respiratoriske studier.
Denne fremgangsmåde kan der i øvrigt anvendes til at isolere mitokondrier fra leveren ved hjælp af de samme trin. Fordi mitokondrier og SMVs tendens til at danne klynger ved udpladningen ind i det elektrofysiologiske optagelse kammer bør man være opmærksom på indlæsning af prøven, som en overdreven sammenklumpning eller overdreven fortynding kan nedsætte muligheTY segl dannelse. Endvidere bør man være opmærksom på flere tekniske detaljer, før du starter isolation. Det er afgørende at bruge rene redskaber og holde dem på is. Alle procedurer bør udføres på is og alle centrifuger indstillet til 4 ° C. Forberedelse af Ficoll gradient ordentligt er afgørende for et vellykket eksperiment. Oprettelse af en perfekt adskillelse mellem de to koncentrationer af Ficoll øger renheden af subcellulære fraktioner.
En begrænsning af denne teknik er pålagt af den endelige mængde af protein, som kan være små, hvis prøve fra en bestemt område af hjernen der ønskes for eksempel mitokondrier fra substantia nigra pars compacta eller striatum. Pooling prøver fra flere dyr kan være nødvendigt at øge den samlede mængde protein høstes.
Mitokondrier eller SMVs der afmåles ved 1 mg / ml og opbevaret ved -80 ° C, og de er stabile til optagelser i flere måneder, men det er preferable ikke at re-fryse mitokondrie prøve efter optøning. Vesikler oprenset ved denne metode er nyttige til at studere ATP syntase ved hjælp af forskellige metoder såsom patch clamp optagelse, biokemiske teknikker og andre funktionelle undersøgelser. Med dette præparat kan man analysere virkningerne af narkotika eller små molekyler på F1FO ATPase-aktivitet og struktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
