Summary
ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO ATPアーゼ複合体の活性の研究とその変調を可能にする。
Abstract
ミトコンドリア代謝、生存1、開発および、カルシウムシグナリング2を含む多くの重要な細胞機能に関与している。最も重要なミトコンドリア機能の二つはATP、酸化的リン酸化による細胞のエネルギー通貨、およびプログラムされた細胞死3つの信号の調停を効率よく製造に関連している。
ATPの生産を主に担当する酵素はまた、ATP合成酵素と呼ばれる4-5 F1FO-ATP合成酵素である。近年では、アポトーシスおよび壊死細胞死におけるミトコンドリアの役割は、かなりの注目を集めている。アポトーシス細胞死では、このようなBaxのようなBCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリア外膜を入力してオリゴマー化し、サイトゾル6にプロアポトーシス因子を放出し、外膜を透過性。古典的な壊死性細胞死で、このような神経細胞における虚血や興奮毒性、ラーグによって生成されるようにeは、マトリックスカルシウムに難規制増加は、内膜の細孔の開口部、ミトコンドリア透過性遷移孔またはMPTPに貢献しています。これは、内膜を脱分極と外膜の破裂、プロアポトーシス因子の放出、代謝機能不全に貢献する、浸透シフトを引き起こす。のBcl-xLの7を含む多くのタンパク質は、その機能を調節する、F1FO ATP合成酵素と相互作用する。 BCL-XLはF1FO ATP合成酵素のβサブユニットと直接相互作用し、この相互作用はF1FO ATPase活性8中F1FOによってH +の正味の輸送を増加させる、F1FOATPasecomplex内に漏れコンダクタンスを減少させ、それによってミトコンドリアの効率を高める。 ATP合成酵素の活性及び変調を研究するために、我々はF1FO ATPアーゼを含む齧歯類の脳亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）から分離された。 Alavian らに示されているようにSMVsはF1FO ATPアーゼの構造および機能の完全性を維持する。ここでは、方法が記載さ我々は、ラット脳からSMVsを単離するために正常に使用していると我々はSMVsのチャネル活性を分析するためのパッチクランプ法（イオンリークコンダクタンス）を描くこと。
Protocol
1。脳ミトコンドリア単離（ ブラウンMRらから適応。9）
- インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された方法を用いてラットを生け贄に捧げる。
- 断頭により、動物の頭をカットし、皮膚をカットし、頭蓋骨を公開します。
- はさみや骨鉗子で切断してそっと頭蓋骨を開きます。脳を取り外します。
- 分離バッファにおける小脳（ 表1を参照）することなく、細かく脳をミンチし、5ミリリットルガラス/テフロンホモジナイザー（機器リストを参照）に転送します。
- そっとティッシュをホモジナイズ10回（無気泡）、約5分。
- 4時10分°Cベンチトップ遠心分離機で用1,500×gでサンプルを遠心分離します。
- 上清を保存（ミトコンドリアとシナプトソーム）とペレット（核物質と細胞の破片）を捨てる。ベンチトップ遠心分離機で4℃で10分間、16,000×gで遠心分離します。
- 捨てるアイソレーションバッファー500μlの上清と再懸濁ペレット。細胞破砕容器（機器リストを参照）シナプトソームを乱す。急減圧が続く10分間のために1,200 PSIの圧力を適用します。
- 126500で層フィコール勾配上に混合物（ 表2参照）、SW-50.1ローターと遠心で行わ×gで4℃で20分間遠心°におけるC（機器リストを参照してください）。ペレットを精製ミトコンドリアで、フィコールの異なる密度の間の層は未破砕シナプトソームです。
- 4時10分°ベンチトップ遠心分離機でC用16,000×gで分離バッファに遠心分離によってペレットを洗浄。
2。亜ミトコンドリアの小胞（SMV）アイソレーション（チャンら 10から適応）
- 1％ジギトニン等量と組み合わせる200μlのアイソレーション·バッファ内のミトコンドリア再懸濁、15分間氷の上に座ることができます。
- より多くのアイソレーションバフを追加16,000でERと遠心×4 gで10分間°ベンチトップ遠心分離機でC。これを2回行う。
- 200μlのアイソレーションバッファーでペレットを再懸濁すると10％Lubrol PX（C12E9）2μlのを追加します。混ぜ、15分間氷上で座ることができます。
- 分離バッファ上に層混合物、182,000でSW-50.1ローター遠心×4のG℃で1時間で場所。
- 4℃で10分間16,000で分離バッファで卓上遠心×gでの遠心分離することにより最終的に得られたペレットを洗浄します
3。電気生理学的記録
- 典型的な電気生理学リグは、増幅器、pClamp10.0ソフトウェア、マニピュレータ、顕微鏡、防振台、ファラデーケージと一緒にDigidata 1440Aアナログ - デジタル変換器インタフェースを備えたPCのコンピュータを含む。
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブはフレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-87に挿入されます。ピペットプラープログラムに最適化されていますMΩ80〜100の間に抵抗とピペットを生成します。
- SMVs生理的細胞内液（ATP、記録中に適切な時間に加算されます）（ 表3）に配置されます。パッチクランプピペットは、同じ溶液（無ATP）が充填されている。レコーディングを室温でSMVsにギガオームシールを形成することによって作られる。小胞はニコン又はツァイス倒立顕微鏡と位相差顕微鏡によって可視化される。
- 膜電位は、-100 mVでから10秒の期間で+は100mVの範囲の電圧で維持される。録音はアンプ回路を使用して5 kHzでフィルタリングされます。 1未満の浮遊pAの電気的又は非特異的なノイズのレベルが成功記録のために望ましい。
- データは、単一チャネル·イベントの周波数と振幅を決定するために、例えばClampfit 10.0ソフトウェアを使用して分析される。電圧依存性は、直流電圧の関係をプロットすることによって決定される。
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Representative Results
我々のプロトコルの最初のステップは、 図1のウェスタンブロットにより示されるようにミトコンドリアの単離精製を可能にする。 図2に脳由来亜ミトコンドリアのベシクルパッチ記録の一例を示している。インサイドアウトパッチ構成を用いて、我々は、ATPによって変調されたチャネルの活性を示す。コントロール（CTL）記録（左）は平均で600 psのピークコンダクタンスを持つマルチコンダクタンスチャネル活性を示す。それはすぐにお風呂に1mMのATPを添加すると低下した。 ATPの全体的な効果は、濃度依存的にSMVsパッチのコンダクタンスを減少させることである。 SMV-除外H +インジケータACMAの蛍光強度の減少を測定し、 図3に示すように、単離後F1FO ATPアーゼの効率を測定するために、我々はATP加水分解に応答してSMVsへのH +イオンの移動を測定した。 ATP感受性H + SMVsへのイオンの隔離は、追加した後に強化されていATPのition。このアッセイは、H +イオン封鎖の効率を測定するために使用することができる。あまり効率SMVsはH +イオンよりゆっくり以下ピーク値を蓄積します。例えば、H +イオン隔離はのBcl-xLの阻害とFCCP（Alavian ら 、2011）を添加することによって減衰される。
| 最終濃度 | |
| 蔗糖 | 250mmの |
| HEPES | 20mmの |
| EDTA | 1mmの |
| BSA | 0.5％ |
表1。分離バッファ。
| フィコール | 22ミリリットルの20％> |
| 蔗糖 | 12ミリリットル1 M |
| EDTA | 18.75μlの0.1 M |
| トリス-HCl | 375μlの1 M（pH7.4）で |
| 7.5％フィコールの最上層 | |
| フィコール株式 | 10ミリリットル |
| 分離バッファ | 6ミリリットル |
| 底層フィコールの10％ | |
| フィコール株式 | 15.5ミリリットル |
| 分離バッファ | 2.5ミリリットル |
表2。フィコールストック。
| 塩化カリウム | 120mMの |
| NaClを | 8 mMの |
| EGTA | 0.5mMの |
| HEPES | 10mMの |
| pHは | 7.3 |
表3。内部ソルる。
図1。細胞質とミトコンドリアから精製ライセートの代表的イムノブロット。上部パネルは、細胞質タンパク質GAPDHに対する抗体を用いたイムノブロットを示しています。下のパネルは、ミトコンドリア中わたの膜タンパク質CoxIVに対する抗体を用いたイムノブロットを示す。
図2。 1mMのATPの添加前後の2つの代表的なパッチクランプ記録。潜在能力を保持することは+70 mVです。破線は0 pAのを表しています。各トレースを10秒間記録し、トレース間の10秒がありますされています。
図3。蛍光強度の変化の一例トレースSMVsの存在下および非存在下（黒のトレース）とATPの存在（赤のトレース）の経時ACMAインジケータ。
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Discussion
この方法によってphenotypes.SMVspurified細胞の区別なく全脳から、手順2の後にここに、ステップ1の終了時に純粋なミトコンドリアの分離を可能にし、亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）に記載された方法は、に示されているように他の細胞内小器官による汚染の本質的に自由である図1に、私たちの前の仕事（Alavian KN ら 8）、凍結前にその構造と機能の整合性を保持します。凍結融解後、孤立したミトコンドリアやSMVsはレコーディングや生化学的アッセイのためにではなく、呼吸器の研究に使用されています。
この方法は、さらに、同じ手順を使用して肝臓からミトコンドリアを単離することができる。ミトコンドリアとSMVsは電気生理学的記録室に播種したときにクラスターを形成する傾向があるため、注意が過剰凝集や過度の希釈として、サンプルのロードに与えられるべきでpossibiliを減少させることができるシール形成のTY。また、注意が分離を開始する前に、いくつかの技術的な詳細に与えられるべきである。それはきれいなツールを使用すると、氷の上でそれらを保つことが重要です。すべての手順は、氷の上で実行され、すべての遠心分離機で4℃に設定をすべきであるフィコール勾配を準備する適切に成功した実験のために重要である。フィコールの2つの濃度の間の完全な分離を作成すると、細胞内画分の純度を向上させます。
この手法の限界は、特定の脳領域からのサンプルは、黒質緻密部又は線条体からミトコンドリア例えば、所望される場合に小さくすることができるタンパク質の最終的な量によって課される。いくつかの動物からプールしたサンプルを採取したタンパク質の総量を増強する必要があるかもしれない。
彼らは数ヶ月間安定である録画ミトコンドリア又はSMVsを1 mg / mlのアリコートに分け、-80℃で保存するCと、しかし、それはpreferablある解凍後ミトコンドリアのサンプルを再凍結しないようにメール。この方法で精製小胞は、そのようなパッチクランプ記録など、さまざまなアプローチが、生化学的手法やその他の機能の研究を使用して、ATP合成酵素を研究するのに有用である。この準備で一薬やF1FO ATPase活性と構造上の小分子の影響を分析することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L.
