Summary
쥐의 뇌에서 F1FO ATP 합성 효소 복합체 충실 submitochondrial 소포를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 소포는 F1FO ATPase의 복잡하고 패치 클램프 녹음의 기술을 사용하여 변조의 활동의 연구를 할 수 있습니다.
Abstract
미토콘드리아는 신진 대사, 생존 1, 개발 및 칼슘 2 신호 등 많은 중요한 세포 기능에 참여하고 있습니다. 가장 중요한 미토콘드리아 기능의 두 ATP, 산화 인산화에 의한 세포의 에너지 통화 및 프로그램 된 세포의 죽음 3 신호 조정의 효율적인 생산에 관련되어 있습니다.
ATP의 생산을 주로 담당하는 효소는 ATP 합성 효소 4-5이라는 F1FO-ATP 합성 효소이다. 최근 몇 년 동안, 세포 자멸사 및 괴사 세포 죽음에서 미토콘드리아의 역할은 상당한 주목을 받고있다. 사멸 세포 죽음, 이러한 백스 같은 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아 외막를 입력 올리고머 및 세포질 6에 직업 세포 사멸 인자를 방출, 외부 막을 permeabilize. 고전적인 괴사 된 세포의 죽음, 이러한 신경 세포의 허혈이나 excitotoxicity에,이 Larg에 의해 생성 된 것과매트릭스 칼슘 전자, 제대로 규제 증가는 내부 멤브레인 기공, 미토콘드리아 투과성 전이 기공 또는 MPTP의 개통에 기여하고 있습니다. 이 내부 막 탈분극 및 외부 막 파열, 직업 세포 사멸 인자의 릴리스 및 신진 대사 장애에 기여하고, 삼투압 변화가 발생합니다. BCL-XL 7을 (를) 포함하여 많은 단백질 F1FO ATP 합성 효소, 조절의 기능과 상호 작용합니다. BCL-XL은 F1FO ATP 합성 효소의 베타 소단위와 직접 상호 작용이 상호 작용 F1FO ATPase의 활성 8시 F1FO에 의한 H +의 그물 전송함으로써 증가하는 미토콘드리아의 효율성을 증가 F1FOATPasecomplex에서 누수가 전도성을 감소시킨다. ATP 합성 효소의 활동 및 변조를 연구하기 위해, 우리는 F1FO ATPase의를 포함한 설치류 뇌 submitochondrial의 소포 (연 소식 기화기)에서 분리. Alavian 등과 같이 연 소식 기화기는 F1FO ATPase의의 구조와 기능 무결성을 유지합니다. 여기, 우리는 방법을 설명우리는 쥐의 뇌에서 연 소식 기화기의 격리를 위해 성공적으로 사용하고 우리는 연 소식 기화기 (이온 누출 전도도) 채널의 활동을 분석 할 수있는 패치 클램프 기술을 묘사합니다.
Protocol
1. 뇌 미토콘드리아 절연 (브라운 MR 등에서 적응. 9)
- 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 방법을 사용하여 쥐를 희생.
- 잘린 동물의 머리를 잘라 피부를 잘라 두개골을 노출합니다.
- 가위 또는 rongeur로 절단하여 부드럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거합니다.
- 절연 버퍼에있는 소뇌 (표 1 참조)없이 정밀하게 뇌를 말하다 5 ML 유리 / 테프론 균질화 (장비 목록 참조)로 전송할 수 있습니다.
- 조직 가볍게 10 회 (거품 없음), 약 5 분 균질화.
- 4 10 분 ° C 벤치 탑 원심 분리기에서 1,500 × g에서 샘플을 원심 분리기.
- 상층 액을 저장 (미토콘드리아와 synaptosomes)와 펠렛을 (핵 물질 및 세포 파편) 폐기합니다. 벤치 탑 원심 분리기 ° C 4에서 10 분간 16,000 × g에서 원심 분리기.
- 폐기상층 액을 다시 중단 절연 버퍼 500 μL에 펠렛을. 세포 분열 용기 (장비 목록을 참조) synaptosomes을 방해. 빠른 압축 해제 한 다음 10 분, 1,200 PSI의 압력을 적용합니다.
- 126,500에서 레이어 Ficoll 그라디언트 위에 혼합물 (표 2 참조), SW-50.1 로터와 원심 분리기에서 개최 × g에서 4시 20 분 ° 원심 분리기에서 C (장비 목록을 참조). 펠렛 정제 미토콘드리아이며, Ficoll의 서로 다른 밀도 사이의 계층 undisrupted synaptosomes입니다.
- 16,000 절연 버퍼에서 원심 분리 × g을 4시 10 분 ° C에 대한 벤치 탑 원심 분리기에 의해 펠렛을 씻으십시오.
2. Submitochondrial 소포는 (SMV) 절연 (장 등. 10에서 발췌)
- 1 % digitonin의 동일한 볼륨과 함께 200 μL 절연 버퍼에 미토콘드리아 다시 중단하고 15 분 동안 얼음에 앉아 할 수 있습니다.
- 더 격리 버프 추가16,000 어 원심 분리 × 4시 10 분 g ° 벤치 탑 원심 분리기 C. 두 번이 작업을 수행합니다.
- 200 μL 절연 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지하고 10 % Lubrol PX (C12E9) 2 μl를 추가합니다. 혼합하고 15 분 동안 얼음에 앉아 할 수 있습니다.
- 182,000에 절연 버퍼, SW-50.1 회에서 장소와 원심 분리기 위에 레이어 혼합 × 4에서 g ℃에서 1 시간 동안 C.
- 4 ℃에서 10 분 동안 16,000에서 절연 버퍼의 탁상용 원심 분리기 × g에서 원심 분리하여 최종 펠렛을 씻으십시오
3. 전기 생리학 기록
- 전형적인 전기 생리학 장비는 증폭기, pClamp10.0 소프트웨어, 매니퓰레이터, 현미경, 진동 절연 테이블, 패러데이 케이지와 함께 Digidata 1440A 아날로그 - 디지털 컨버터 인터페이스가 장착 된 PC 시스템을 포함하고 있습니다.
- 붕규산 유리 모세관 튜브는 불타는 / 브라운 micropipette의 풀러 모델 P-87에 삽입됩니다. 피펫 풀러 프로그램에 최적화되어 있습니다MΩ 80-100 사이의 저항과 피펫을 생성합니다.
- 연 소식 기화기는 생리 세포 내 용액 (ATP를 촬영하는 동안 적절한시기에 추가됩니다) (표 3)에 배치됩니다. 패치 클램프 피펫은 동일한 솔루션 (아무 ATP)로 채워집니다. 녹음은 상온에서 연 소식 기화기 위에 기가 옴 실을 형성하여 만들어집니다. 소포는 니콘 자이스 거꾸로 현미경과 위상차 현미경에 의해 시각입니다.
- 막 전위는 -100 MV ~ 10 초 동안 + mV에서 100 mV까지 전압으로 유지됩니다. 녹음은 앰프 회로를 사용하여 5 kHz에서 필터링됩니다. 이하 연평균 길잃은 전기 또는 비 특정 소음 수준은 레코딩하는 것이 바람직합니다.
- 데이터 주파수 단일 채널 이벤트의 진폭을 결정하는 예를 들어 Clampfit 10.0 소프트웨어와 분석됩니다. 전압 의존성 전류 전압 관계를 플롯에 의해 결정됩니다.
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Representative Results
우리의 프로토콜의 첫 번째 단계는 그림 1과 서양 얼룩에 의해 그림과 같이 미토콘드리아 정제 분리 할 수 있습니다. 그림 2에서 두뇌 파생 submitochondrial 소포 패치 기록의 예를 보여줍니다. 내부 아웃 패치 구성을 사용하여 우리는 ATP에 의해 변조 채널 활동을 보여줍니다. 제어 (CTL) 녹음 (왼쪽) 평균 600 P의 최대 전도도와 멀티 전도성 채널 활동을 보여줍니다. 그 즉시 화장실에 ATP 1 ㎜의 추가에 따라 감소 하였다. ATP의 전반적인 효과는 농도 의존적으로 연 소식 기화기 패치의 전도성을 감소하는 것입니다. SMV 별도 H + 표시 ACMA의 형광 강도의 감소를 측정 그림 3과 같이 F1FO ATPase의의 효율성을 측정하기 위하여 차단 후, 우리는 ATP 가수 분해에 대한 응답으로 연 소식 기화기에 H + 이온의 움직임을 측정 하였다. ATP에 민감한 H + 연 소식 기화기에 이온 격리를 추가 한 후 향상ATP의 ition. 이 분석은 H + 이온 격리의 효율성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 효율성 연 소식 기화기는 + 이온이 더 느리게 또는 작은 피크 값 H를 축적합니다. 예를 들어 H + 이온 격리는 BCL-XL 억제제와 FCCP (Alavian 외., 2011)의 추가에 의해 감쇠됩니다.
| 최종 농도 | |
| 자당 | 250 음 |
| HEPES | 20 음 |
| EDTA | 1 음 |
| BSA | 0.5 % |
표 1. 절연 버퍼.
| Ficoll | 22 ML 20 %> |
| 자당 | 12 ML 1 M |
| EDTA | 20,625 ㎕의 0.1 M |
| 트리스 - 염산 | 375 μL 1 M (산도 7.4) |
| 탑 레이어 Ficoll의 7.5 % | |
| Ficoll 주식 | 10 ㎖ |
| 절연 버퍼 | 6 ML |
| Ficoll의 하층 10 % | |
| Ficoll 주식 | 15.5 ML |
| 절연 버퍼 | 2.5 ML |
표 2. Ficoll 주식입니다.
| KCl을 | 120 밀리미터 |
| 염화나트륨 | 8 밀리미터 |
| EGTA | 0.5 mM의 |
| HEPES | 10 MM |
| 산도 | 7.3 |
표 3. 내부 솔루션TION.
그림 1. 해물 대표적인 면역 블롯은 세포질과 미토콘드리아에서 정제. 상단 패널 세포질 단백질 GAPDH에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯을 보여줍니다. 하단 패널은 미토콘드리아 innner 막 단백질 CoxIV에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯을 보여줍니다.
그림 2. 1 mM의 ATP를 첨가 전후의 두 가지 대표적인 패치 클램프 녹음. 잠재력을 들고 +70 MV입니다. 점선 0 연평균 나타냅니다. 각 추적 10 초 동안 기록과 흔적을 사이에 10 초가 있습니다.
그림 3. 의 형광 강도의 변화의 예 흔적연 소식 기화기의 존재와 ATP의 부재 (블랙 추적)와 존재 (빨간색 추적)에서 시간이 지남에 따라 ACMA 표시.
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Discussion
방법에서와 같이 본 발명이 방법으로 phenotypes.SMVspurified 세포의 구별없이 뇌 전체에서 2 단계 이후 단계 1 submitochondrial 소포 (연 소식 기화기)의 끝에서 다른 세포 내 소기관에 의한 오염이 필수적으로 순수 미토콘드리아의 분리를하는 수 기술 그림 1과 우리의 이전 작업 (Alavian KN 등. 8)와 이전의 동결 구조적 및 기능적 무결성을 유지합니다. 냉동 및 해동 후, 미토콘드리아 격리 또는 연 소식 기화기는 녹음 및 생화학 분석하는 데 사용됩니다,하지만 호흡 연구에.
이 방법은 또한 동일한 단계를 사용하여 간에서 미토콘드리아 분리 할 수 있습니다. 미토콘드리아와 연 소식 기화기는 전기 생리학 녹음 챔버에 도금 할 때 클러스터를 형성하는 경향이 있기 때문에,주의가 과도한 응집 과도한 희석로 샘플을로드하는 주어져야한다는 possibili을 줄일 수 있습니다인감 형성의 타이. 또한, 관심의 분리를 시작하기 전에 몇 가지 기술적 인 세부 사항을 제공해야한다. 그것은 청소 도구를 사용하여 얼음에 그들을 유지하기 위해 매우 중요합니다. 모든 절차는 얼음을 수행하고 모든 원심 분리기는 4 ° C.로 설정해야 Ficoll 기울기를 준비 제대로 실험 성공에 중요합니다. Ficoll의 두 농도 사이의 완벽한 분리를 만드는 세포 내 분획의 순도를 향상시킵니다.
이 방법의 한계는 특정 뇌 영역의 샘플이 흑질 갈 거예요 compacta 또는 선조체 (striatum)에서 미토콘드리아 예를 들어, 필요한 경우 작은 수 있습니다 단백질의 최종 금액이 부과됩니다. 여러 동물에서 샘플을 풀링 수확 단백질의 총량을 강화해야 할 수도 있습니다.
미토콘드리아 또는 연 소식 기화기는 1 밀리그램 / ML에 분주 -80에 저장됩니다 ° C와 그들이 몇 달 동안 녹음을 위해 안정, 그러나, 그것은 preferabl입니다E는 해동 후 미토콘드리아 샘플을 다시 동결하지. 이 방법에 의해 정제 된 소포는 패치 클램프 녹음 등 다양한 접근 방법, 생화학 기술 및 기타 기능 연구를 사용하여 ATP 합성 효소를 연구하는 데 유용합니다. 이러한 준비와 함께 하나의 약물이나 F1FO ATPase의 활성과 구조에 작은 분자의 효과를 분석 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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