Summary
利用荧光素酶和体内成像系统（IVIS）作为一种新型的装置，以确定疾病临床发展发生之前的端点。 IVIS使我们能够实时的可视化入侵的脑炎病毒多天，为今后的研究提供了更精确的疾病模型。它也使我们能够找出潜在的抗病毒药物和疫苗的保护功能，速度比目前使用的动物模型。利用动物个体在多个时间点的能力，确保减少动物的要求，成本和总体发病率疾病的研究更人性化，更科学的方法确保使用的动物。
Abstract
现代影像技术的进步，鼓励进一步发展和完善的方式来完成病毒的研究。最初提出的罗素和伯奇在休谟的3R原则（替代，减少，细化），利用动物模型，在科学研究上不断的压力，寻找新的方法来减少动物的使用量，同时提高科学性，准确性和速度。然而，休谟的校长面临的一个主要挑战是如何确保统计准确，同时减少动物疾病的发病率和总人数的研究。目前疫苗的药效学研究需要大量的动物才能被认为有统计学显着性，往往导致高发病率和高死亡率的端点识别的免疫保护。我们利用在体内成像系统（IVIS）一并萤火虫生物发光酶逐步跟踪由ENCE的中枢神经系统（CNS）的入侵小鼠模型中phalitic病毒。通常情况下，疾病的进展相对缓慢，但病毒复制是快速的，尤其是在中枢神经系统内，并且可以导致一个经常，致命的结果。 TC83 - 吕克·鼻内感染的小鼠后，委内瑞拉马脑炎病毒株的减毒修改，以表达荧光素酶基因，我们能够可视化的大脑内的病毒复制前至少3天的临床疾病症状的发展。脑炎病的一个关键发展端点，我们能够迅速地确定治疗和疫苗的保护，对TC83 - 吕克感染临床症状之前，利用CNS入侵的。通过IVIS技术，我们是能够表现出快速，准确的检测，药物治疗和疫苗，同时减少动物的数量和发病率。
Protocol
1。动物准备
- 动物到达：到达后的动物生物安全2级（ABSL2）设施，让动物至少2天，新的环境适应。在此之后的休息时间，检查动物，以评估他们的健康和整体的物理外观。
- 利用荧光记者时，重要的是把所有的动物主题上苜蓿免费饮食，以限制GI量的自体荧光和背景信号。
- 剃须动物：为了提高从颅地区发现的生物发光信号，在成像过程中，所有的动物剃了头。麻醉的动物与氧气的混合物，并蒸发异氟醚。 ，一旦动物是完全麻醉，使用电推剪剃光头。一旦完成剃须，回到笼子里的动物，完全恢复的麻醉效果观察。
- 生物军医数据系统（BMDS）转发器插入（后剃须的小鼠的动物完全麻醉）：对于微创的方法来跟踪温度的预编程的BMDS无线转发器，皮下植入每个鼠标的背部区域。这些转发器允许无线识别和温度记录。植入的应答之后，应用兽医级组织粘合剂到伤口上。
- 基线集合：所有的动物，感染前，记录的基准温度和重量。采集血液的蚀斑减少中和试验（PRNT）分析，通过复古轨道（RO）出血，而老鼠是在麻醉状态下。采血后，申请兽用抗生素眼膏，以减少潜在的继发性细菌感染。考虑应该完成与此基准线集合动物被放置在麻醉下，由于应力对小鼠的数目的次数。未来的RO收藏小号hould完成后成像，而鼠标仍然是麻醉状态下。从RO的最大收集血液，应该是约200微升。
- 感染：将小鼠麻醉下，如前面所述。接种通过鼻内途径，使用剂量为5×10 6至5×10 7 pfu的TC83-萤光素酶中的总体积为40微升稀释的磷酸缓冲盐水（PBS）中，通过鼻内感染。感染后，将老鼠他们的住房笼子内，观察复苏。
2。动物影像
免责声明：在他们的住房单元，生物安全柜（BSC），或者的XIC遏制框在任何时候都养老鼠。此协议经批准的BSC是一类II型B1或B2。
- 注入所有动物用10微升的15毫克/毫升的浓度在每克体重腹腔内（IP）的萤光素。
- 小鼠接受Ampligen是injecteD IP剂量为12.5毫克/千克体重-4小时后感染或感染后48小时，根据他们的小组。
- 在注射之前，与荧光素，分离成三个一组的小鼠XIC-3遏制方块内，以确保一个适当的配合。
- 对于所有的成像，利用眼软膏/润滑剂，以防止整个手术过程中的干燥的角膜。
- 打开LivingImage软件，然后按初始化准备的成像盒，设置自动保存为自动，曝光时间（汽车的LivingImage软件3.2和更高版本的新功能，曝光时间），视场为C，打开过滤器;领域根据小鼠的数目，你是成像视图和过滤器可以被优化，如所需的其他成像项目。
- 确认没有过期的空气活性炭过滤器，氧气罐是满的，充满异氟醚水库。在XIC-3我将一小条一小条的电工胶带溶胶箱，有助于减少动物的运动，在成像过程中。
- 注入小鼠荧光素的IP在2.1节和地方3-5分钟内异氟醚诱导室（盖打开）。
- 5分钟后，关上盖子的感应室和异氟醚的流动。麻醉操作与氧流量设定在约3-5％，在约2.0升/分钟。一旦完全无意识再等待30秒，将小鼠的XIC-3的隔离箱。确保所使用的生物安全柜可清除异氟醚的安全，此过程将涉及损失的异氟醚的感应室（IVIS包含它自己的无源公平罐和XIC-3围堵箱/插座直接连接以确保载流）麻醉。
- 根据芯片/组号码的小鼠转移到XIC-3的异氟醚连接器连接的隔离箱D打开。位置的小鼠，使他们在胸骨斜卧头轻轻地搭在带。
- 用乙醇，喷雾的手和底部的XIC-3与cavicide擦拭XIC遏制框中，并转移到IVIS成像室。重新连接的麻醉遏制盒里面的成像单元。
- 10分钟后的萤光素的注射后，图像小鼠通过生物体的图像处理软件。
- 在最初的影像以开放的过滤器，启动DLIT的3维成像，生物发光的萤火虫荧光素酶的序列分析和图像向导设置。这种成像过程将需要4-5分钟，并应完成的观点相关的所需的小鼠数目的字段。
- 离体分析以下剖检和收集的大脑。将大脑在无菌培养皿中，滴50-100μl的股票萤光素之上，而在IMA晋框。
- 最后完成第二次公开滤波器图像DLIT成像完成后，在15-17分钟后感染。确保序列分析和领域的视图和过滤器设置恢复到以前的设置。
3。返回老鼠和数据分析
- 关闭异氟醚蒸发器和传输XIC遏制框生物安全柜。
- 他们的住房单元内，将小鼠背部，合上，喷洒适当的消毒剂并放回外壳上的机架外部。
- 确保小鼠从麻醉中完全康复。
- 重复上述步骤，直到完成成像的实验需要。
- 消毒BSC，关闭设备，将所有数据传输到外部实验室的位置，作进一步的分析。
- 的数据进行分析，并生成IVIS结果利用率根据3维图像lizing LivingImage软件。
- 确保图像的正确导向，照明/色彩平衡设置。在工具选项板的选项包括影像调整，修正，图像信息，和投资回报率的工具。
- 利用ROI的形状，以确定具体的基于位置的信号强度。
- 突出的鼠身的表面形貌重建，初始化3D DLIT重建，并使用线性适合器官地图，地形重建。
- 通过收集的血液和器官，就可以完成进一步的病毒滴定分析。在这项研究中的滴定完成通过同质化改性的鹰培养基（MEM）中的脑组织。将匀浆液连续稀释，我们感染6孔板Vero细胞1小时。将细胞用1.5％的agarose/2xMEM重叠覆盖，在37℃孵育2天。 30分钟，用10％福尔马林固定细胞，染色结晶紫。
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Representative Results
的基因修饰的病毒，TC83荧光素酶，我们看到在生物发光信号强度的增加，作为病毒的复制移动到中央的中枢神经系统（ 图1），从鼻区域。由于高的病毒的复制率，我们期望看到的生物发光信号（ 图2A）的高浓度的取决于载体和动物的免疫反应的载体。我们预计这个信号的增加继续到了顶峰，感染后5-7天之间，在中枢神经系统内的病毒复制高峰（ 图2B）的组合。信号和病毒的高峰期，我们希望看到一个下降的信号，由于在病毒复制减少，由于亏损的荧光素酶基因。与这些信号值，我们期望能够量化的病毒载量，根据信号的强度，提供了一个在体内方法来准确地计算出逐渐增加的病毒载量在一个单一的动物具体芯片TC83荧光素酶。
利用该模型作为一种手段来分析疫苗和抗病毒治疗，我们期望能够检测之间的差根据减少在生物发光信号的有效的治疗方法。在我们的情况下，对TC83-萤光素酶中，我们可以利用IP Ampligen（Toll样受体3激动剂）或疫苗接种3周的感染前，以显着降低病毒感染和生物发光信号（ 图3）在整个研究。中枢神经系统内的（数据未示出），这种减少可以直接关联到病毒载量下降。 IVIS软件LivingImage的方式，充分开发和可视化技术，能够使生物发光信号（ 图4），这使我们能够很容易地识别高病毒复制的位置，根据组织的深度和组成的3维图像的。
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图1。 IVIS成像TC83荧光素酶的三C57BL / 6小鼠进行感染通过鼻内挑战TC83-萤光素酶和成像在2，4，6和8天感染后（DPI）的。图像自动曝光长度和开放的过滤器的IP萤光素注射后， 点击此处查看大图 。
图2，这两个菌株的小鼠有类似的生物发光信号的强度在成像之前完成（A）与10分钟后喷射延迟IP注射后的萤光素。在大脑中的病毒载量（pfu的/克组织）显示了很强的相关性在整个感染的biolumiescent信号（的B）。
图3。治疗方法比较利用IVIS。TC83-荧光素酶在C3H/HeN小鼠感染后的治疗comarison。免疫小鼠皮下TC83 23天前，挑战与TC83-荧光素酶没有生物发光信号（A）。小鼠在10-4和48小时后的感染接受IP Ampligen的（B）相比，小鼠接受任何治疗（C）的水平降低。
图4。我们的三维重建成像。利用三维重建可视化的峰值位置TC83-荧光素酶感染利用LivingImage的DLIT的重建工具。我们能够利用这种特中枢神经系统内的本地化的深度和位置的主信号chnique。
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Discussion
虽然该协议涵盖了成像方面， 在体内分析，为今后的研究中的一个关键因素，重要的是要认识到生物发光的矢量。我们利用TC83，作为表达的荧光素酶的载体的减毒疫苗株VEEV确保正在生产大量的酶，由于如先前描述的1-4在中枢神经系统中的病毒的高复制率。虽然除了一个第二次基因组启动子和荧光素酶基因的重组病毒进一步衰减结果相比，野生型TC83，这种衰减不出现感染5的第6天之内改变的疾病的临床病程。我们期望看到的荧光素酶基因的损失，通过随着时间的推移，但再次复制的病毒还没有看到，直到后来在疾病的发展。其他病原载体，病毒和细菌，确认开发的潜力和效率IVIS和荧光素酶在多个领域的病原体研究6-9。
成像过程本身所具有的一些关键步骤之前，必须完成一个完整的研究可以实现。应该完成的载体的生物发光强度的初步分析，在一个含有最小的动物试验研究。预期的位置在体内的荧光素酶的积累，事先应该知道，由于利用的载体，但预期的信号强度前应确定发起了一项大型研究。随着新软件的曝光长度分析是没有必要的，因为自动曝光检测功能，内置的软件，但基于荧光素注射时间延迟仍然需要确定。即使所有这些信号的计算，生物发光检测仍然是有限的，由于向深度和整体动物的颜料和毛皮。我们强烈建议剃须动物之前打Ë成像开始获得最强的信号。
即使占矢量衰减和产酶，我们相信我们已经设计了一个精确和更有效的模型，然后利用荧光素酶可以产生一个标准的荧光分子在体内分析系统。并不限于生物发光通过具有启动光源，它最初组织导致信号丢失，必须通过。它也没有后台自动荧光看到它们的皮毛，甚至从他们的饮食的小鼠的问题。萤光素底物的毒性风险容易控制，通过适当的过滤和剂量，使生物发光的动物一样安全。荧光和生物发光系统可以显着减少动物使用量由于体内分析，为今后的研究将是重要的，由于不断变化的政治态度动物研究，进一步坚持嗡嗡声e的3R原则（替代，减少，细化）对动物使用10。
病毒的发病机制及抗病毒疗效分析对于我们的应用， 在体内造型更有效11,12比目前的系统因多种原因。我们能够探测到特定的关键步骤疾病的发展，CNS入侵的情况下，TC83，之前任何临床疾病的发展。从最初的入侵检测，我们能够反复想象在一个单一的动物传播病毒的复制提供更准确的方法，研究疾病进展5。我们设计的模型，也更安全的研究人员的牺牲和器官的收集，探测能力的主要病情恶化点在临床疾病可导致动物烦躁不安，具体到我们的系统，由于需求减少，我们可以完成这些研究中的减毒病毒载体中而不是ABSL3 ABSL2利用一个选择代理。
未来的疾病的研究将越来越多地利用生物发光IVIS建模。现代分子生物学技术和克隆的进步，在允许迅速和廉价地到这两个病毒和细菌的载体的荧光素酶基因的插入。开发能力表达启动子依赖的荧光素酶基因的转基因小鼠，系统还提供了另一种生物发光研究。最后，新开发的生物发光探头，如的卡尺RediJect炎症探头与髓过氧化物酶在体内的巨噬细胞炎症反应的可视化允许。这些新技术相结合，与提高效率的相机和软件，使生物发光IVIS为今后的研究在许多不同研究领域的一个可行的制度。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
转化科技UTMB-NIH授予1UL1RR029876，01和艾丽莎普拉瑟她的协助与视频编辑这篇稿子。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
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