Summary
Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte dierlijke modellen. De mogelijkheid om individuele dieren te gebruiken over meerdere tijdstippen zorgt voor minder dierenbenodigdheden, kosten en de overall morbiditeit voor de dieren gebruikt zorgen voor een meer humane en meer wetenschappelijke middelen van de ziekte studie.
Abstract
Moderne ontwikkelingen in de imaging-technologie aan te moedigen verdere ontwikkeling en verfijning in de manier waarop virale onderzoek wordt uitgevoerd. In eerste instantie voorgesteld door Russel en Burch in Hume's 3 V's (vervanging, vermindering, verfijning), het gebruik van diermodellen in wetenschappelijk onderzoek is onder constante druk om nieuwe methoden te identificeren om het gebruik van dieren te verminderen, terwijl het verbeteren van de wetenschappelijke nauwkeurigheid en snelheid. Een belangrijke uitdaging om Hume's opdrachtgevers is echter hoe te zorgen voor de studies zijn statistisch nauwkeurige terwijl het verminderen van dierziekten morbiditeit en totale aantallen. Werkzaamheid studies vereisen momenteel een groot aantal dieren om te worden beschouwd als statistisch significant en leiden vaak tot hoge morbiditeit en mortaliteit eindpunten voor de identificatie van immuunbescherming. We gebruik in vivo imaging systemen (IVIS) in combinatie met een vuurvlieg bioluminescent enzym aan de invasie van het centraal zenuwstelsel (CNS) geleidelijk volgen door een lingenphalitic virus in een muizenmodel. Typisch, de ziekte relatief langzaam echter virusreplicatie is snel, vooral in de CNS en kan leiden tot een vaak fatale afloop. Na intranasale infectie van muizen met de TC83-Luc, een verzwakt Venezolaanse equine encephalitis virus stam aangepast voor expressie een luciferasegen, kunnen wij virusreplicatie visualiseren in de hersenen ten minste drie dagen vóór de ontwikkeling van klinische ziekteverschijnselen. Gebruik te maken van CNS invasie als een belangrijke encefalitisch ontwikkeling van de ziekte eindpunt zijn we in staat om snel therapeutische en vaccin bescherming te identificeren tegen TC83-Luc infectie voordat de klinische symptomen zich ontwikkelen. Met IVIS technologie zijn we in staat om de snelle en nauwkeurige testen van drugs therapeutica en vaccins te tonen terwijl het verminderen van het aantal dieren en morbiditeit.
Protocol
1. Animal Voorbereiding
- Animal aankomst: Bij aankomst in het dier bioveiligheid niveau 2 (ABSL2) faciliteiten, zodat de dieren een minimum van 2 dagen om te acclimatiseren aan hun nieuwe omgeving. Na deze rusttijd controleert de dieren voor hun gezondheid en algehele fysieke verschijning te evalueren.
- Bij het gebruik fluorescent reporters is het belangrijk om alle proefdieren op alfalfa dieet plaatsen om de hoeveelheid GI autofluorescentie en achtergrond signaal.
- Shave dieren: Om de bioluminescente signaal gedetecteerd van de schedel tijdens beeldvorming te verbeteren; scheren de hoofden van alle dieren. Verdoven dieren met een mengsel van zuurstof en isofluraan verdampt. Als de dieren zijn volledig verdoofd, gebruik maken van elektrische tondeuse om hun hoofd te scheren. Eenmaal klaar met scheren, de terugkeer van de dieren naar hun kooien en observeren volledig herstel van de gevolgen van de anesthesie.
- Bio Medic gegevensSystems (BMDS) transponder inbrengen (plaatsvinden na scheren van de muizen terwijl de dieren volledig verdoofd): Voor een minder invasieve middelen om de temperatuur implantaat subcutaan volgen een voorgeprogrammeerde BMDS draadloze transponder in de dorsale regio van elke muis. Deze transponders kunnen voor draadloze identificatie en temperatuurregistratie. Na implantatie van de transponder, toepassen veterinaire-grade weefselhechtmiddel op de wond.
- Baseline collection: voor infectie opnemen basislijn temperatuur en het gewicht voor alle dieren. Verzamel bloed voor plaquereductieneutralisatietest (PRNT) analyse door middel van retro-orbitale (RO) bloeden, terwijl de muizen onder narcose. Na bloedafname, van toepassing veterinaire antibiotica oogzalf om potentiële secundaire bacteriële infectie te verminderen. Dit basislijn collection moet worden aangevuld met aandacht voor het aantal keren dat de dieren onder narcose gebracht door stress op de muizen. Toekomst RO collecties should worden afgerond na de belichting, terwijl de muis is nog steeds onder narcose. De maximum bloed vanuit een RO moet ongeveer 200 pl.
- Infectie: Place muizen verdoofd zoals eerder beschreven. Inoculeer via intranasale route met een dosis van 5x10 tot 5x10 6 7 pfu TC83-Luciferase in een totaal volume van 40 pl verdund fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door intranasale infectie. Na infectie, plaatst u de muizen in hun huisvesting kooi en observeer herstel.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Houd muizen binnen hun wooneenheid, de bioveiligheid kast (BSC), of de XIC insluiting doos te allen tijde. De goedgekeurde BSC's voor dit protocol zijn een klasse II Type B1 of B2.
- Injecteer alle dieren met 10 ui per gram lichaamsgewicht van intraperitoneale (IP) luciferin in een concentratie van 15 mg / ml.
- Ampligen muizen die moeten worden injected IP in een dosis van 12,5 mg / kg lichaamsgewicht bij -4 uur na infectie of +48 uur na infectie op basis van hun groep.
- Vóór injectie met luciferine, scheiden de muizen in groepen van drie om een juiste maat in de XIC-3 containment box waarborgen.
- Voor imaging gebruik maken van oculaire zalf / smeermiddel om het drogen van de cornea te voorkomen gedurende de procedure.
- Open de LivingImage software en druk op Initialiseren van het grafisch venster te bereiden; set automatische besparing, belichtingstijd op auto (belichtingstijd op auto is een nieuwe functie van de LivingImage software 3.2 en nieuwer), veld te bekijken naar C, en het filter te openen; veld gezien is gebaseerd op het aantal muizen u imaging en filter kan worden geoptimaliseerd desgewenst voor andere beeldbewerkingsprojecten.
- Controleer of de lucht koolstoffilters niet zijn verstreken, de zuurstof tank vol is, en de isofluraan reservoir gevuld is. Plaats smalle stroken van elektrische tape in de XIC-3 isolation box die helpt bij het verminderen van de verplaatsing van dieren tijdens het belichten.
- Injecteer de muizen met luciferine IP zoals beschreven in paragraaf 2.1 en plaats binnen de Isofluraan inductie kamer (met deksel open) gedurende 3-5 minuten.
- Na 5 min, het deksel van de inductiekamer en start de stroom van isofluraan. De verdoving werkt bij ongeveer 3-5% van de zuurstoftoevoer ingesteld op ongeveer 2,0 L / min. Eenmaal volledig onbewust wacht dan nog 30 sec en breng de muizen om de XIC-3 isolatie box. Zorg ervoor dat de bioveiligheid kast wordt benut zorgt voor het veilig opruimen van isofluraan als deze procedure zal omvatten het verlies van isofluraan van de inductie kamer (de IVIS apparaat bevat zijn eigen Passief Fair canisters en de XIC-3 containment box direct aangesloten op de in / uit-aansluitingen tot ingeperkt verdoving stroom te verzekeren).
- Breng de muizen op basis van chip / groepsnummer in de XIC-3 isolatie box met de isofluraan connector een aangeslotend te openen. Plaats de muizen, zodat ze zijn neergelegd in sternale decubitus met kop zachtjes rusten op de tape strips.
- Veeg de XIC insluiting doos met ethanol, spray handen en onderkant van de XIC-3 met CaviCide, en over te dragen aan de IVIS beeldvorming kamer. Sluit de anesthesie op de insluiting box eenmaal in de beeldeenheid.
- Na 10 min na de injectie van luciferine, het imago van de muizen door het levende beeld software.
- Na de eerste beeldvorming met een open filter, start een DLIT 3-dimensionale beeldvorming met behulp van de sequentie-analyse en Image Wizard setup voor bioluminescente vuurvlieg luciferase. Dit proces zal imaging 4-5 min en moet ten een gezichtsveld relevant voor het aantal gewenste muizen.
- Ex-vivo analyse mogelijk na autopsie en verzameling van de hersenen. Plaats de hersenen op een steriele petrischaal, druppelen 50 tot 100 ul van voorraad luciferine op de top, en de plaats binnen het imaGing doos.
- Finalize een tweede open filter beeld op 15 tot 17 minuten na infectie na voltooiing van DLIT beeldvorming. Zorg ervoor dat sequentie-analyse is uitgeschakeld en het gezichtsveld en filter instellingen worden teruggezet naar de vorige instellingen.
3. Terug Muizen en data-analyse
- Schakel de isofluraan vaporizer en terug over te dragen van de XIC insluiting in om de bioveiligheid kast.
- Plaats de muizen in hun wooneenheid, sluit de top, spuit de buitenkant met geschikt desinfectiemiddel, en plaats terug op de behuizing rek.
- Zorg ervoor dat muizen zijn volledig hersteld van anesthesie.
- Herhaal de bovenstaande procedure als het experiment vereist tot beeldvorming is voltooid.
- Desinfecteer de BSC, het afsluiten van de apparatuur, en de overdracht van alle data naar een extern laboratorium locatie voor verdere analyse.
- Analyseer de gegevens en het genereren van 3-dimensionale beelden op basis van IVIS resultaten utilizing de LivingImage software.
- Zorg ervoor dat het beeld in de juiste richting en verlichting / kleurbalans is ingesteld. Binnen de Tool Palette de opties omvatten Beeld aanpassen, Correcties, Image Information en ROI Tools.
- Maak gebruik van ROI vormen om specifieke signaalsterkte op basis van locatie te identificeren.
- Reconstructie van de oppervlakte topografie om de muis lichaam te markeren, te initialiseren 3D DLIT reconstructie, en het gebruik van lineaire fit aan het orgel kaart ingesteld op de topografische reconstructie.
- Verdere virale titratie analyse kan worden uitgevoerd door middel van inzameling van bloed en organen. Titratie in deze studie werd afgerond door middel van homogenisatie van hersenweefsel in gemodificeerde adelaars medium (MEM). Het homogenaat werd serieel verdund en we besmet een plaat met 6 putjes van Vero cellen gedurende 1 uur. De cellen werden bedekt met een overlay agarose/2xMEM 1,5% en gedurende 2 dagen bij 37 °. Cellen werden gefixeerd met 10% formaline gedurende 30 min en gekleurd metkristalviolet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Van een genetisch gemodificeerde virus, TC83-Luciferase zagen we een toename bioluminescent signaalsterkte als de virus replicatie beweegt van de nasale regio in de centrale CNS (figuur 1). Door de hoge virale replicatie rate verwachten we hoge bioluminescent signaal (figuur 2A) afhankelijk van de vector en het dier immuunrespons op de vector zien. We verwachten dat dit signaal verhoging blijven een piek tussen dagen 5-7 na infectie in combinatie met virale replicatie piek in het CNS (Figuur 2B). Na het signaal en virale piek verwachten we een afname in signaal zowel door een afname in virale replicatie en door een verlies van het van het luciferasegen zien. Met deze signaalwaarden verwacht kunnen viral load gebaseerd op de sterkte van het signaal kwantificeren, die een in vivo methode nauwkeurig te berekenen progressief toenemende viral load in een dier spe ic te TC83-Luciferase.
Gebruik dit model als een middel om vaccins en antivirale behandelingen analyseren we verwachten kunnen een verschil tussen afdoende behandelingen gebaseerd op een vermindering van bioluminescent detecteren. In ons geval tegen TC83-Luciferase kunnen we IP Ampligen (a Toll-like receptor 3 agonist) of vaccinatie drie weken gebruiken voor infectie aanzienlijk verminderen virale infectie en bioluminescente signaal gedurende de studie (figuur 3). Deze daling kan direct worden gecorreleerd tot een daling van de virale lading in het CNS (data niet getoond). Als een manier om volledig te ontwikkelen en te visualiseren technologie IVIS software LivingImage in staat is drie-dimensionale beelden van de bioluminescent signaal (figuur 4) waardoor we gemakkelijk identificeren plaatsen van hoge virale replicatie basis weefseldiepte en samenstelling.
/ 4429/4429fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "fo: inhoud-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. IVIS Imaging van TC83-Luciferase Three C57BL / 6 muizen werden geïnfecteerd door intranasale challenge met TC83-Luciferase en afgebeeld op 2, 4, 6 en 8 dagen na infectie (DPI). Beelden werden gemaakt naar aanleiding IP luciferine injectie met een automatische belichting lengte en open filter. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Beide stammen van muizen die vergelijkbare bioluminescent signaalsterkte na IP injectie van luciferin met een vertraging van 10 minuten na injectie voor imaging voltooid (A). Virale lading in de hersenen (pfu / gram weefsel) toont een sterke correlatie gehele infectie de biolumiescent signaal (B).
Figuur 3. Behandeling ten Gebruikmakend IVIS. Behandeling comarison na TC83-Luciferase infectie in C3H/HeN-muizen. Muizen geïmmuniseerd met subcutane TC83 23 dagen voorafgaand aan provocatie met TC83-Luciferase gepresenteerd zonder bioluminescent signaal (A). Muizen die IP Ampligen bij -4 en +48 uur na infectie (B) verlaagde niveaus toonden in vergelijking met muizen die geen behandeling (C).
Figuur 4. 3-dimensionale reconstructie beeldvorming. Gebruik te maken van 3-dimensionale reconstructie we gevisualiseerd de top locatie van TC83-Luciferase infectie gebruik te maken van DLIT reconstructie LivingImage's tool. We kunnen lokaliseren de diepte en locatie van het primaire signaal binnen het CZS gebruik van deze technique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel dit protocol omvat de aspecten imaging in vivo analyse is belangrijk om de bioluminescent vector herkennen als een sleutelfactor voor toekomstige studies. Onze gebruik van TC83, een verzwakte vaccinstam VEEV als vector voor expressie van luciferase zodat grote hoeveelheden van het enzym worden geproduceerd door de hoge replicatie van het virus in het CNS zoals eerder beschreven 1-4. Terwijl de toevoeging van een tweede subgenome promotor en het luciferase gen resulteert in verdere verzwakking van het recombinante virus in vergelijking met wildtype TC83, deze verzwakking niet tot het klinische verloop van de ziekte veranderen binnen de eerste 6 dagen van infectie 5. We verwachten een verlies van het luciferasegen zien door replicatie van het virus in de tijd, maar ook dit is pas later zichtbaar in de ontwikkeling van ziekte. Ontwikkeling van andere pathogene vectoren, virale en bacteriële, bevestigt het potentieel en efficiëntievan IVIS en luciferase over meerdere gebieden van pathogeen onderzoek 6-9.
De imaging proces zelf heeft een paar kritische stappen die moeten worden voltooid voordat een volledige studie kan worden uitgevoerd. Een eerste analyse van de bioluminescente kracht van de vector moet worden afgewerkt in een pilot-studie met een minimale groep dieren. De verwachte locatie in vivo van luciferase accumulatie moet van te voren te wijten aan de gebruikte vector, maar de verwachte signaalsterkte bekend zijn moeten vóór het starten van een grote studie. Met de nieuwe software een blootstelling lengte analyse is niet zo noodzakelijk is als gevolg van de automatische belichting detectie functie nu ingebouwd in de software, maar een vertraging op basis van de injectie van luciferine zal nog moeten worden bepaald. Zelfs met al deze signalen berekeningen, kan bioluminescente detectie nog steeds beperkt door vector diepte en de algehele dier pigment en bont. We raden het scheren van de dieren before beeldvorming begint te krijgen het sterkste signaal mogelijk te maken.
Zelfs goed voor vector demping en de productie van enzymen, we geloven dat we een preciezere en beter presterende model, gebruik makend luciferase vervolgens kan worden gegenereerd met een standaard TL-molecuul voor in vivo analyse ontworpen. Bioluminescentie is niet beperkt door een initiërende lichtbron, die aanvankelijk moet door het weefsel resulteert in een verlies van signaal. Het maakt ook niet de hoge achtergrond auto fluorescerende problemen gezien met muizen op hun vacht en zelfs uit hun dieet. Het risico van toxiciteit van het substraat luciferine wordt bediend door een goede filtratie en dosering, waardoor bioluminescent even veilig voor het dier. Zowel fluorescerende en bioluminescente systemen kunnen drastisch verminderen het gebruik van dieren als gevolg van in vivo analyse die belangrijk zijn voor toekomstig onderzoek worden veroorzaakt door de veranderende politieke houding ten opzichte van dieren onderzoek en verdere naleving van Hume's 3 V's (vervanging, vermindering, verfijning) in de richting van het gebruik van dieren 10.
Voor onze toepassing van virale pathogenese en antivirale werkzaamheid analyse in vivo modellering is efficiënter dan huidige systemen 11,12 om verschillende redenen. Wij zijn in staat om specifieke belangrijke stappen voor de ziekte van ontwikkeling, CNS invasie 1 in het geval van TC83, op te sporen voordat een klinische ziekte zich ontwikkelt. Van de eerste invasie detectie, zijn we in staat om herhaaldelijk te visualiseren in een enkel dier de verspreiding en de replicatie van het virus met een nauwkeuriger middel van het bestuderen van progressie van de ziekte 5. Het model dat we hebben ontworpen is ook veiliger voor onderzoekers te wijten aan de verminderde eis van het offer en orgel collectie, de mogelijkheid om belangrijke progressie van de ziekte punten te detecteren voordat de klinische ziekte kan leiden tot dieren prikkelbaarheid, en, specifiek voor ons systeem, kunnen we vullen deze studies in een verzwakte virale vector in de plaats van de ABSL2 ABSL3toepassing van een select agent.
Toekomstige ziekte studies zullen in toenemende mate gebruik maken van lichtgevende IVIS modellering. Verbeteringen in moderne moleculaire biologie en klonen kunnen het inbrengen van een luciferasegen snel en goedkoop in zowel virale als bacteriële vectoren. De mogelijkheid om transgene muizen die een promoter afhankelijk luciferasegen ontwikkelen dit ook een systeem voor bioluminescente studie. Tenslotte nieuw ontwikkelde bioluminescent probes zoals Beugels RediJect ontsteking probe reageert met myeloperoxidase waardoor in vivo visualisatie van fagocyt ontstekingsreactie. Deze nieuwe technologieën in combinatie met de verhoging van de efficiëntie van de camera's en software maakt bioluminescente IVIS een levensvatbaar systeem voor toekomstig onderzoek in veel verschillende vakgebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Instituut voor Translational Sciences UTMB-NIH subsidie 1UL1RR029876-01 en Alisha Prather voor haar hulp bij videobewerking voor dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
