Summary
Используя люциферазы и в естественных систем визуализации (ИВИС) в качестве нового средства выявления заболевания до появления клинических конечных точках события происходят. ИВИС позволили нам визуализировать в реальном времени вторжения вирусов энцефалита в течение нескольких дней, обеспечивая более точное заболевание моделью для будущих исследований. Это также позволило нам выявить потенциальные защитные свойства противовирусных препаратов и вакцин быстрее, чем в настоящее время применяются животных моделях. Возможность использования отдельных животных в течение нескольких моментов времени обеспечивает уменьшить животное требований, затрат и общей заболеваемости на животных использовались обеспечения более гуманного и более научными средствами болезни исследовании.
Abstract
Современные достижения в области технологий визуализации способствовать дальнейшему развитию и совершенствованию на пути вирусных исследований выполнена. Первоначально предложенный Расселом и Burch в 3Rs Юма (замена, восстановление, уточнение), использование животных моделей в научных исследованиях находится под постоянным давлением для выявления новых методологий для уменьшения использования животных при одновременном повышении научной точностью и скоростью. Одна из основных задач для директора Юма, однако, в том, как обеспечить исследования являются статистически точным при одновременном снижении животных заболеваемости и общего числа. Исследования Эффективность вакцины в настоящее время требуют большого количества животных для того, чтобы считать статистически значимым и часто приводит к высокой заболеваемости и смертности конечные точки для определения иммунной защиты. Мы использовали в естественных систем визуализации (ИВИС) в сочетании с ферментом светлячков биолюминесцентного постепенно отслеживать вторжения в центральной нервной системе (ЦНС) по ENCEphalitic вируса в мышиной модели. Как правило, болезнь протекает относительно медленно, однако репликация вируса происходит быстро, особенно в ЦНС, и может привести к часто летальный исход. После интраназального заражения мышей с TC83-Luc, ослабленный венесуэльского конского энцефалита штамма вируса изменены, чтобы выражает гена люциферазы, мы находимся в состоянии представить себе репликации вируса в мозг по крайней мере за три дня до развития клинических симптомов заболевания. Используя CNS вторжением в качестве ключевой энцефалита конечной точкой развития болезни мы в состоянии быстро определить терапевтическую вакцину и защиты от TC83-Люк инфекции до появления клинических симптомов. С технологией ИВИС мы можем продемонстрировать быстрое и точное тестирование препарата терапии и вакцин при одновременном сокращении численности животных и заболеваемости.
Protocol
1. Подготовка животных
- Животное прибытия: По прибытию на уровень животного биобезопасности 2 (ABSL2) объектов, позволяют животным не менее 2 дней, чтобы привыкнуть к новой среде. После этого периода отдыха, осмотра животных, чтобы оценить их здоровья и общего физического облика.
- При использовании флуоресцентных журналистам важно, чтобы разместить всех животных предметов на люцерну бесплатно диету, чтобы ограничить количество GI автофлуоресценции и фонового сигнала.
- Бритье животных: Для улучшения биолюминесцентного сигнала обнаружено от черепно области во время съемки; брить головы всех животных. Anesthetize животных смесью кислорода и испаряется изофлурана. Как только животные полностью под наркозом, использовать электрические ножницы для бритья головы. После завершения бритья, вернуть животных в их клетки и наблюдать за полное восстановление от последствий наркоза.
- Bio Медик данныхСистемы (BMDS) транспондера вставки (состоится после бритья мышей, в то время как животные полностью под наркозом): Для менее инвазивные средства для отслеживания температуры имплантата запрограммированных BMDS беспроводной транспондер подкожно в область спины каждой мыши. Эти транспондеры позволяют беспроводной идентификации и регистрации температуры. После имплантации транспондера, применяются ветеринарно-класс ткани клеем к ране.
- Базовая коллекция: Перед инфекции, записывать температуру и вес базовой для всех животных. Сбор крови для уменьшения налета нейтрализации (PRNT) анализ через ретроорбитального (RO) кровотечение в то время как мыши под анестезией. После сбора крови, применяют ветеринарные мазь с антибиотиком глаза, чтобы уменьшить возможные вторичные бактериальные инфекции. Данная базовая коллекция должна быть завершена с учетом в несколько раз животные находятся под наркозом из-за стресса на мышах. Будущие коллекции RO сhould быть завершена после съемки, в то время как мыши все еще находится под наркозом. Максимальная крови, собранной из RO должно быть около 200 мкл.
- Инфекция: Место мышей под наркозом, как описано выше. Инокулировать через интраназально с применением дозы 5х10 6 до 5x10 7 БОЕ TC83-люциферазы в общем объеме 40 мкл разбавляют фосфатным буферным раствором (PBS) посредством интраназального заражения. После инфекции, поместите мышь в пределах их жильем клетку и наблюдать восстановление.
2. Животное изображений
Предупреждение: Держите мышь в рамках своих жилищных единиц, шкаф биологической безопасности (BSC), или XIC окна сдерживания во все времена. Утвержденный БББ для этого протокола являются Тип Класс II B1 или B2.
- Inject всех животных с 10 мкл на грамм массы тела внутрибрюшинно (IP) люциферин в концентрации 15 мг / мл.
- Мышей, получавших Ampligen должны быть injecteIP D в дозе 12,5 мг / кг массы тела при -4 часа после инфицирования или +48 часа после инфицирования на основе их группы.
- До инъекции люциферин, отделить мышей на группы по три для обеспечения правильной посадки в XIC-3 сдерживания окно.
- Для всех изображений, использование глазных мазей / смазкой, чтобы предотвратить высыхание роговицы в течение всей процедуры.
- Откройте программу LivingImage и нажмите Initialize для подготовки изображений коробке; набор автоматически экономии, время экспозиции, чтобы автоматически (время экспозиции на авто это новая функция программного обеспечения LivingImage 3.2 и новее), просматривать поле C, и фильтр, чтобы открыть; поле зрения основана на количество мышей вы изображений и фильтр может быть оптимизирован, которые необходимы для других проектов визуализации.
- Убедитесь, что воздушный фильтр уголь еще не истек, кислородный бак полон, и изофлурана резервуар заполнен. Поместите небольшие полоски изоленты в XIC-3 яsolation ящик, который помогает с сокращением движения животных во время съемки.
- Inject мышей с IP люциферин, как описано в разделе 2.1 и место в Isoflurane камеры индукции (при открытой крышке) в течение 3-5 мин.
- Через 5 мин, закрыть крышкой индукции камеру и начать поток изофлурана. Анестетика работает на примерно 3-5%, при этом установленный расход кислорода при приблизительно 2,0 л / мин. После полного бессознательного ждать еще 30 сек и передачу мышей XIC-3 изоляции коробки. Убедитесь, что кабинет биобезопасности используются позволяет для безопасной очистки изофлюрана так как эта процедура будет включать в себя потерю изофлуран от индукции камеры (блок ИВИС содержит свой собственный пассивный ярмарка канистры и XIC-3 сдерживания окна напрямую подключается к в / из розетки для обеспечения содержащейся анестетика потока).
- Передача мышей основе чипа / номер группы в XIC-3 изоляции коробки с изофлуран разъем прилагаетсяг открыть. Установите мышей, чтобы они изложены в лежачем положении грудины с руководителями осторожно опираясь на полоски ленты.
- Протрите XIC окна сдерживания этанола, спрей руки и нижнюю часть XIC-3 с cavicide, и передать в камеру ИВИС изображения. Снова наркоз для сдерживания окно однажды внутри блока изображения.
- Через 10 мин после инъекции люциферин, изображения мышей через живой образ программного обеспечения.
- После первоначального изображения с открытым фильтром, инициировать DLIT 3-мерной визуализации с использованием анализа последовательностей изображений и мастер установки для люциферазы светлячка биолюминесцентного. Это изображение процесс займет 4-5 мин и должна быть завершена в поле зрения соответствующих по количеству мышей лучшего.
- Экс-анализ естественных условиях можно следующим вскрытия и сбор мозга. Поместите мозга на стерильную чашку Петри, капельно 50-100 мкл складе люциферин на вершине, и место в IMAненности ВИЧ варьируется окно.
- Завершение второго открытого фильтра изображение на 15-17 мин после инфицирования после завершения визуализации DLIT. Обеспечить анализ последовательности выключен, и в поле зрения настройки фильтров и возвращается к предыдущим настройкам.
3. Вернуться мышах и анализ данных
- Выключить изофлурана испаритель и передать XIC окна сдерживания обратно в шкаф биологической безопасности.
- Поместите мышь обратно в свою жилищную единицу, закрыть сверху, опрыскивать внешний вид с соответствующим дезинфицирующим средством и местом обратно на корпус стойки.
- Убедитесь, мыши полностью выздоровели от наркоза.
- Повторите описанную выше процедуру в качестве эксперимента требуется до визуализации завершен.
- Лечить BSC, выключить оборудование, и передать все данные за пределами расположения лабораторию для дальнейшего анализа.
- Анализ данных и создания 3-мерных изображений, основанные на результатах ИВИС ИМПлизинг LivingImage программного обеспечения.
- Убедитесь, что изображение в правильной ориентации и освещенности / цветовой баланс установлен. В палитре инструментов варианты включают настройки изображения, исправительных учреждений, изображения информации и ROI Tools.
- Использование ROI формы для определения конкретных уровней сигналов основан на месте.
- Реконструкция рельефа поверхности, чтобы выделить корпуса мыши, инициализировать 3D-реконструкция DLIT, а также использовать линейную подходят для установки органа карты топографические реконструкции.
- Далее вирусного анализа титрования может быть завершена путем сбора крови и органов. Титрование в этом исследовании была выполнена путем гомогенизации тканей головного мозга в модифицированной орлов среде (MEM). Гомогенат серийно разводили и мы инфицированы 6 хорошо пластину Vero клеток в течение 1 часа. Клетки были покрыты 1,5% agarose/2xMEM наложения и инкубировали в течение 2 дней при температуре 37 градусов. Клетки фиксировали 10% формалином в течение 30 мин и окрашиваликристаллический фиолетовый.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С генетически модифицированный вирус, TC83-люциферазы, мы увидели увеличение биолюминесцентного сигнала, как репликация вируса перемещается из области носа в центральной нервной системы (рис. 1). В связи с высокой вирусной скоростью репликации, мы ожидаем, что высокие уровни биолюминесцентного сигнала (рис. 2A) зависит от вектора и животных иммунный ответ на вектор. Мы ожидаем, что этот сигнал увеличение продолжать пик, между 5-7 дней после заражения, в сочетании с вирусной репликации пика в ЦНС (рис. 2В). После сигнала и вирусных пика, мы ожидаем увидеть снижение сигнала как за счет снижения вирусной репликации и в связи с потерей гена люциферазы. С помощью этих значений сигналов мы ожидаем, чтобы иметь возможность количественно вирусной нагрузки основаны на силу сигнала, обеспечивая в естественных методов, чтобы точно вычислить постепенное увеличение вирусной нагрузки у одного животного задаваемым микросхемы для TC83-люциферазы.
Используя эту модель в качестве средства для анализа вакцин и противовирусных лечения, мы ожидаем, чтобы быть в состоянии обнаружить разницу между эффективностью лечения, основанные на сокращение биолюминесцентного сигнала. В нашем случае, в отношении TC83-люциферазы, мы можем использовать IP Ampligen (Toll-подобный рецептор 3 агонист) или вакцинации за три недели до инфекции, значительно снизить вирусную инфекцию и биолюминесцентного сигнала на протяжении всего исследования (рис. 3). Это сокращение может быть напрямую связано с уменьшением вирусной нагрузки в ЦНС (данные не показаны). Для того, чтобы полностью разработать и представить себе технологии, программное обеспечение ИВИС LivingImage способен делать 3-мерных изображений биолюминесцентного сигнала (рис. 4), которая позволяет легко идентифицировать местах с высокой вирусной репликации основан на глубину ткани и композиции.
/ 4429/4429fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "FO: содержание ширина =" 5 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. ИВИС Визуализация TC83-люциферазы Три C57BL / 6, были инфицированы через интраназального заражения TC83-люциферазы и отображаемого на 2, 4, 6 и 8 дней после заражения (DPI). Изображения были сделаны следующие IP инъекции люциферин с длиной автоэкспозиции и открытым фильтром. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Обе линии мышей имели схожие биолюминесцентного сигнала после введения IP люциферин с задержкой 10 минут после инъекции перед изображениями была завершена (A). Вирусная нагрузка в мозге (БОЕ / г ткани) показывает сильную корреляцию по всему инфекции biolumiescent сигнала (B).
Рисунок 3. Лечение сравнения Используя ИВИС. Лечение comarison после TC83-люциферазы инфекции у мышей C3H/HeN. Мышей иммунизировали подкожной TC83 23 дней до заражения TC83-люциферазы представлены не биолюминесцентного сигнала (A). Мышей, получавших IP Ampligen при -4 и +48 инфекции сообщению ч (B) показал снижение уровней по сравнению с мышами, не получавших лечения (C).
Рисунок 4. 3-мерная реконструкция изображения. Используя 3-мерной реконструкции мы визуализировали пик расположение TC83-люциферазы инфекции использованием DLIT инструмент реконструкции LivingImage автора. Мы можем локализовать глубины и локализации первичного сигнала в ЦНС использования этой теchnique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот протокол охватывает аспекты изображений для прижизненного анализа, важно признать биолюминесцентного вектор как ключевой фактор для будущих исследований. Наши использования TC83, ослабленный штамм вакцины VEEV, в качестве вектора для экспрессии люциферазы гарантирует, что большое количество фермента производятся в связи с высокой скоростью репликации вируса в ЦНС, как описано ранее 1-4. В то время как добавление второго субгеномный промотора и гена люциферазы результаты в дальнейшем ослабление рекомбинантного вируса по сравнению с диким типом TC83, это ослабление, кажется, не изменяет клиническое течение заболевания в течение первых 6 дней после заражения 5. Мы ожидаем, чтобы увидеть потерю гена люциферазы с помощью репликации вируса в течение долгого времени, но снова это не видно позже в развитии заболевания. Развитие других векторов патогенные, вирусные и бактериальные, подтверждает потенциал и эффективностьиз ИВИС и люциферазы в нескольких областях исследований возбудителя 6-9.
Визуализации процесса само по себе имеет несколько важных шагов, которые должны быть завершены до полного исследования могут быть реализованы. Первоначальный анализ биолюминесцентного силы вектора должна быть завершена в пилотном исследовании, содержащий минимальную группы животных. Ожидается место в естественных условиях люциферазы накопления должны быть известны заранее, в связи с вектором использованы, но ожидать сигнала должны быть определены до начала большого исследования. С новым программным обеспечением анализа воздействия длина не столь необходимо в связи с обнаружением автоэкспозиции функция теперь встроена в программное обеспечение, но задержка основан на инъекции люциферин все еще должны быть определены. Даже с учетом всех этих сигналов расчеты, биолюминесцентные обнаружения еще может быть ограничено в связи с глубиной и общий вектор пигмента животных и меха. Мы настоятельно рекомендуем бритья ДО животныхэлектронной визуализации начинает набирать самый сильный сигнал возможным.
Даже с учетом ослабления вектор и производства ферментов, мы считаем, мы разработали точные и более эффективной модели использования люциферазы, то может быть сгенерирован с помощью стандартных люминесцентных системе молекул в естественных анализ. Биолюминесценция не ограничивается наличием начала источником света, который первоначально должен пройти через ткани приводит к потере сигнала. Он также не имеют высокого фона авто флуоресцентные проблем, как с мышами на их мех и даже из своего рациона. Риск токсичности от подложки люциферин легко управлять с помощью надлежащей фильтрации и дозировки, делая биолюминесцентного так же, как безопасно для животного. Оба люминесцентных и биолюминесцентных систем может существенно сократить использование животных в связи с в естественных условиях анализа, который будет иметь важное значение для будущих исследований из-за изменения политического отношения к исследованиям животных и дальнейшего присоединения к Humе '3Rs (замена, восстановление, уточнение) к использованию животных 10.
Для нашего приложения вирусного патогенеза и противовирусного анализа эффективности, моделирование в естественных условиях является более эффективным, чем существующие системы 11,12 по нескольким причинам. Мы можем обнаружить специфические ключевые шаги для развития болезни, CNS вторжение 1 в случае TC83, перед любым клиническое заболевание развивается. От первоначального обнаружения вторжения, мы можем повторно визуализировать в одно животное распространение и размножение вируса обеспечивая более точное средство изучения прогрессирования заболевания 5. Модель, которую мы разработали также является более безопасным для исследователей в связи с снижением потребности жертвы и органа сбора, возможность определения ключевых моментов прогрессирования заболевания до клинической картины заболевания может привести к животным раздражительность, и, характерных для нашей системы, мы можем завершить эти исследования В ослабленные вирусные вектора в ABSL2 вместо ABSL3использования выберите агента.
Будущие исследования болезни будут все больше использовать биолюминесцентного моделирования ИВИС. Достижения в области современных методов молекулярной биологии и клонирования позволит введение гена люциферазы быстро и дешево в обе вирусные и бактериальные векторы. Способность к развитию трансгенных мышей, экспрессирующих промоутер зависимых генов люциферазы также предоставляет другую систему для биолюминесцентного исследования. Наконец, недавно разработанный биолюминесцентного зондов, таких как Штангенциркули RediJect зонд Воспаление реагирует с миелопероксидазы позволяет в естественных условиях визуализации фагоцитарной реакции воспаления. Эти новые технологии в сочетании с увеличением эффективности камер и программного обеспечения делает биолюминесцентного ИВИС жизнеспособной системы для будущих исследований в различных областях знаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Институт Поступательное наук UTMB-NIH грант 1UL1RR029876-01 и Алиша Пратер за ее помощь в редактировании видео для этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
