Summary
En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles animaux actuellement utilisés. La capacité d'utiliser des animaux individuels sur plusieurs points temporels assure aux besoins des animaux réduits, des coûts et de la morbidité globale pour les animaux utilisés assurer un moyen plus humain et plus scientifique de l'étude des maladies.
Abstract
Avancées modernes dans la technologie d'imagerie encourager le développement et l'affinement de la façon dont la recherche virale est accompli. Initialement proposé par Russel et Burch en 3R Hume (remplacement, réduction, raffinement), l'utilisation de modèles animaux dans la recherche scientifique est sous pression constante afin d'identifier de nouvelles méthodes pour réduire l'utilisation des animaux, tout en améliorant la précision scientifique et de rapidité. Un défi majeur pour les directeurs de Hume cependant, est de savoir comment s'assurer que les études sont exacts, tout en réduisant la morbidité des maladies animales et chiffres globaux. Études sur l'efficacité des vaccins actuellement besoin d'un grand nombre d'animaux afin d'être considéré comme statistiquement significatif et entraînent souvent des taux élevés de morbidité et de mortalité critères d'évaluation pour l'identification de la protection immunitaire. Nous avons utilisé l'imagerie in vivo des systèmes (IVIS) en conjonction avec une enzyme bioluminescente luciole progressivement suivre l'invasion du système nerveux central (SNC) par un riencephalitic virus dans un modèle murin. En général, la maladie progresse relativement lentement, mais la réplication du virus est rapide, en particulier dans le système nerveux central, et peut conduire à une souvent une issue fatale. Suite à l'infection intranasale des souris avec TC83-Luc, une souche atténuée du Venezuela virus de l'encéphalite équine modifié pour exprime un gène de la luciférase, nous sommes en mesure de visualiser la réplication du virus dans le cerveau au moins trois jours avant l'apparition des symptômes cliniques de la maladie. Utilisant invasion du SNC comme un critère clé de la maladie encéphalitique développement, nous sommes en mesure d'identifier rapidement thérapeutique et la protection vaccinale contre TC83-Luc infection avant les symptômes cliniques. Grâce à la technologie IVIS nous sommes en mesure de démontrer le dépistage rapide et précis de la thérapeutique de médicaments et de vaccins, tout en réduisant le nombre d'animaux et la morbidité.
Protocol
1. Préparation des animaux
- L'arrivée des animaux: A votre arrivée à l'échelle de l'animal biosécurité 2 (ABSL2) les installations, permettre aux animaux un minimum de 2 jours pour s'acclimater à leur nouvel environnement. Après cette période de repos, inspecter les animaux pour évaluer leur état de santé et l'apparence physique.
- Lors de l'utilisation rapporteurs fluorescents, il est important de placer tous les sujets animaux sur un régime alimentaire de la luzerne libres de limiter la quantité d'autofluorescence et GI signal de fond.
- Rasage animaux: Pour améliorer le signal bioluminescent détecté à partir de la région crânienne lors de l'imagerie, raser les têtes de tous les animaux. Anesthésier les animaux avec un mélange de gaz oxygène vaporisé et l'isoflurane. Une fois que les animaux sont pleinement anesthésiés, utilisez une tondeuse électrique se raser la tête. Une fois terminé avec le rasage, renvoyer les animaux dans leurs cages et d'observer une récupération complète des effets de l'anesthésie.
- Bio Medic donnéesL'insertion des systèmes de transpondeur (BMDS) (qui aura lieu après le rasage de la souris alors que les animaux sont pleinement anesthésiés): Pour un moyen moins invasives pour suivre la température d'un implant préprogrammé BMDS sans fil transpondeur voie sous-cutanée dans la région dorsale de chaque souris. Ces transpondeurs permettent d'identifier sans fil et enregistrement de la température. Après l'implantation du transpondeur, appliquer un adhésif tissulaire vétérinaire de qualité de la plaie.
- Collection de référence: Avant l'infection, enregistrer une température de référence et le poids de tous les animaux. Prélever du sang pour la réduction de neutralisation sur plaque d'essai (PRNT) l'analyse par rétro-orbitaires (RO) de fond perdu, tandis que les souris sont sous anesthésie. Après prélèvement de sang, vétérinaire pommade oculaire antibiotique pour réduire le potentiel infection bactérienne secondaire. Cette collection de référence devrait être complétée en tenant compte du nombre de fois où les animaux sont placés sous anesthésie à cause du stress sur les souris. Futures collections RO should être complété après l'imagerie, tandis que la souris est toujours sous anesthésie. Le sang prélevé sur un maximum de RO devrait être d'environ 200 pi.
- Infection: souris sous anesthésie comme décrit précédemment. Inoculer par voie intranasale à l'aide d'une dose de 5x10 6 à 5x10 7 pfu TC83-luciférase dans un volume total de 40 ul diluée par Phosphate Buffered Saline (PBS) à travers une infection intranasale. Après l'infection, placez la souris au sein de leur cage de logement et d'observer la récupération.
2. Imagerie des animaux
Avertissement: Gardez souris au sein de leur unité de logement, l'enceinte de sécurité biologique (ESB), ou la boîte de confinement XIC à tout moment. Les enceintes de sécurité biologique approuvés pour ce protocole sont de type B1 ou B2 de classe II.
- Injecter tous les animaux avec 10 pl par gramme de poids corporel de intrapéritonéale (IP) de la luciférine à une concentration de 15 mg / ml.
- Les souris ayant reçu Ampligen doivent être injecteIP d à une dose de 12,5 mg de poids corporel / kg lors de l'infection heures après -4 ou 48 h après l'infection en fonction de leur groupe.
- Avant l'injection avec la luciférine, séparer les souris en groupes de trois pour assurer un ajustement approprié dans la boîte de confinement XIC-3.
- Pour toutes les images, utiliser une pommade oculaire / lubrifiant pour empêcher le séchage de la cornée dans toute la procédure.
- Ouvrez le logiciel LivingImage et appuyez sur Initialiser pour préparer la boîte d'imagerie; économie d'auto ensemble, le temps d'exposition sur auto (temps d'exposition sur auto est une nouvelle fonctionnalité du logiciel LivingImage 3.2 et plus récent), voir le terrain à C, et le filtre à ouvrir; champ de vue est fondée sur le nombre de souris vous êtes imagerie; filtre et peut être optimisé en fonction des besoins pour des projets d'imagerie.
- Assurez-vous que les filtres à charbon air n'ont pas expiré, le réservoir d'oxygène est pleine, l'isoflurane et le réservoir est rempli. Placez de petites bandes de ruban électrique dans le XIC-3 iboîte de consolation qui aide à réduire le déplacement des animaux lors de l'imagerie.
- Injecter les souris avec la luciférine IP, comme décrit dans la section 2.1 et sa place dans la chambre d'induction isoflurane (avec couvercle ouvert) pendant 3-5 min.
- Après 5 minutes, fermez le couvercle de la chambre d'induction et démarrer le flux de l'isoflurane. L'anesthésique est actionné à environ 3-5% de l'ensemble de débits d'écoulement d'oxygène à environ 2,0 L / min. Une fois complètement inconscient attendre un autre 30 secondes et transférer les souris à la boîte d'isolation XIC-3. S'assurer que le poste de sécurité microbiologique étant utilisée permet le coffre-fort balayage de l'isoflurane que cette procédure implique la perte de l'isoflurane à partir de la chambre d'induction (l'unité IVIS contient ses propres passifs bidons équitable et la boîte de confinement XIC-3 se connecte directement à l'entrée / sortie prises pour assurer contenues flux anesthésique).
- Transférez les souris basés sur puce / numéro de groupe dans la boîte d'isolation XIC-3 avec le connecteur isoflurane ci-joint und ouvrir. Placez la souris de sorte qu'ils sont énoncés en décubitus sternal avec des têtes délicatement posées sur les rubans adhésifs.
- Essuyez la zone de confinement XIC avec les mains éthanol de pulvérisation, et le fond du XIC-3 avec CaviCide, et transférer à la chambre d'imagerie IVIS. Rebranchez l'anesthésie de la zone de confinement fois à l'intérieur de l'unité d'imagerie.
- Après 10 minutes après l'injection de luciférine, l'image des souris via le logiciel vivante image.
- Suite à l'imagerie initiale avec un filtre ouvert, lancez une DLit 3-Dimensional imagerie utilisant l'analyse de la séquence et la configuration Assistant Image de bioluminescence luciférase de luciole. Ce processus d'imagerie prendra 4-5 min et devrait être achevée dans un champ de vue pertinent pour le nombre de souris souhaités.
- Ex-vivo analyse est possible autopsie suivante et la collecte du cerveau. Placez le cerveau sur une boîte de Pétri stérile, goutte à goutte 50-100 ul de stock luciférine sur le dessus, et sa place dans l'imaGing boîte.
- Finaliser une seconde image ouverte filtre à 15-17 min après l'infection à la fin de l'imagerie DLit. Assurer une analyse de séquence est éteint et le champ de vision et les paramètres de filtre sont retournés à la configuration précédente.
3. Souris de retour et d'analyse de données
- Éteignez le vaporisateur isoflurane et le transfert de la zone de confinement XIC retour à l'enceinte de sécurité biologique.
- Placez les souris de retour au sein de leur unité de logement, fermer le haut, vaporiser l'extérieur avec un désinfectant approprié et remettez le casier de stockage.
- Veiller à ce que les souris ont complètement récupéré de l'anesthésie.
- Répétez la procédure ci-dessus jusqu'à ce que l'expérience nécessite d'imagerie est terminée.
- Désinfecter le BSC, arrêtez l'appareil et transférer toutes les données vers un emplacement en dehors de laboratoire pour une analyse ultérieure.
- Analyser les données et de générer des images en 3 dimensions basées sur les résultats IVIS utiliser le logiciel LivingImage.
- S'assurer que l'image est correctement orientée et l'éclairage / balance des couleurs est réglé. Dans la palette d'outils des options incluent Réglage de l'image, les services correctionnels, Informations sur l'image et les outils de ROI.
- Utiliser des formes ROI d'identifier les forces de signaux spécifiques sur la base de l'emplacement.
- Reconstruire la topographie de la surface pour mettre en évidence le corps de la souris, initialiser la reconstruction 3D DLit, et utiliser un ajustement linéaire pour définir la carte d'organes à la reconstruction topographique.
- Une analyse plus titrage viral peut être complété par la collecte de sang et les organes. Le titrage dans cette étude a été réalisée par l'homogénéisation du tissu cérébral dans aigles modifié moyenne (MEM). L'homogénat a été dilués en série et nous avons infecté une plaque à 6 puits de cellules Vero pendant 1 heure. Les cellules ont été recouvertes d'une superposition agarose/2xMEM 1,5% et incubées pendant 2 jours à 37 degrés. Les cellules ont été fixées avec 10% de formol pendant 30 min et colorées aveccristal violet.
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Representative Results
Avec un virus génétiquement modifié, TC83-luciférase, nous avons vu une augmentation de la puissance du signal bioluminescent que la réplication du virus se déplace de la région nasale dans le SNC centrales (figure 1). En raison du taux élevé de réplication virale, nous nous attendons à de hauts niveaux de signal bioluminescent (figure 2A) dépendant du vecteur et de la réponse immunitaire des animaux au vecteur. On s'attendre à ce signal d'augmentation de continuer jusqu'à un sommet, entre infection jours après 5-7, en combinaison avec un pic de réplication virale dans le SNC (Figure 2B). Après le signal et pic viral, nous nous attendons à une diminution du signal à la fois en raison d'une diminution de la réplication virale et en raison d'une perte de la du gène de la luciférase. Avec ces valeurs de signal, nous espérons être en mesure de quantifier la charge virale en fonction de la force du signal, fournissant une méthode in vivo de calculer avec précision en augmentant progressivement la charge virale chez un seul animal spéci ic à TC83-luciférase.
En utilisant ce modèle comme un moyen d'analyser les vaccins et les traitements antiviraux, nous nous attendons à être en mesure de détecter une différence entre les traitements efficaces basés sur une réduction du signal de bioluminescence. Dans notre cas, contre TC83-luciférase, nous pouvons utiliser Ampligen IP (Toll-like receptor 3 agoniste) ou trois semaines avant la vaccination infection, de réduire considérablement l'infection virale et signal bioluminescent tout au long de l'étude (figure 3). Cette diminution peut être directement corrélée à une diminution de la charge virale dans le SNC (données non présentées). Comme une façon de développer pleinement et de visualiser la technologie, IVIS logiciel LivingImage est capable de faire en 3 dimensions des images du signal de bioluminescence (figure 4), qui nous permet d'identifier facilement les emplacements de la réplication virale élevée basée sur la profondeur des tissus et de la composition.
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Figure 1. IVIS imagerie du TC83-luciférase souris C57BL / 6 Trois ont été infectés par voie intranasale avec défi TC83-luciférase et imagé à 2, 4, 6, et 8 jours après l'infection (DPI). Les images ont été faites suite à l'injection luciférine IP avec une longueur exposition automatique et filtre ouvert. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Les deux souches de souris ont même la force du signal de bioluminescence après injection IP de la luciférine avec un retard de 10 minutes avant après l'injection d'imagerie a été achevée (A). La charge virale dans le cerveau (pfu / gramme de tissu) montre une corrélation forte tout au long de l'infection au signal biolumiescent (B).
Figure 3. Comparaison du traitement utilisant IVIS. Traitement comarison après TC83-luciférase infection chez les souris C3H/HeN. Les souris immunisées avec sous-cutanée TC83 23 jours avant de contester avec TC83-luciférase présenté aucun signal de bioluminescence (A). Les souris ayant reçu Ampligen IP lors de l'infection heures après -4 et +48 (B) ont montré des niveaux réduits par rapport à des souris n'ayant pas reçu de traitement (C).
Figure 4. Imagerie de reconstruction en 3 dimensions. Utilisant la reconstruction 3-Dimensional nous avons visualisé l'emplacement pic de l'infection TC83-luciférase en utilisant l'outil de reconstruction LivingImage DLit. Nous sommes en mesure de localiser la profondeur et l'emplacement du signal primaire dans le SNC utilisant ce technique.
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Discussion
Bien que ce protocole couvre les aspects d'imagerie pour l'analyse in vivo, il est important de reconnaître le vecteur bioluminescente comme un facteur clé pour de futures études. Notre utilisation de TC83, une souche vaccinale atténuée de VEEV, comme un vecteur d'expression de la luciférase en sorte que de grandes quantités de l'enzyme sont produites en raison du taux élevé de réplication du virus dans le SNC, comme décrit précédemment 1-4. Bien que l'ajout d'un second promoteur subgénomique et les résultats gène de la luciférase dans l'atténuation du virus recombinant par rapport au type sauvage TC83, cette atténuation ne semble pas modifier l'évolution clinique de la maladie dans les 6 premiers jours de l'infection 5. Nous nous attendons à pour voir une perte de gène de la luciférase grâce à la réplication du virus au fil du temps mais encore une fois ce n'est pas vu que plus tard dans le développement de la maladie. Développement de vecteurs pathogènes autres, virales et bactériennes, confirme le potentiel et l'efficacitéIVIS et de la luciférase dans de multiples domaines de recherche sur les pathogènes 6-9.
Le processus d'imagerie lui-même a quelques critiques qui doivent être accomplies avant une étude complète peut être mis en œuvre. Une première analyse de la force bioluminescente du vecteur doit être terminé dans une étude pilote contenant un groupe minimal d'animaux. L'emplacement attendue in vivo de l'accumulation de la luciférase devraient être connues à l'avance en raison de la vecteur utilisé, mais la force du signal attendu devrait être déterminée avant de lancer une étude de grande envergure. Avec le nouveau logiciel une analyse durée d'exposition n'est pas aussi nécessaire en raison de la fonction de détection automatique de l'exposition désormais intégrées dans le logiciel, mais un temps de retard basé sur l'injection de luciférine aurez toujours besoin d'être déterminée. Même avec tous ces calculs de signaux, la détection de bioluminescence peut encore être limitée en raison de la profondeur des vecteurs et pigment animal global et de la fourrure. Nous recommandons fortement le rasage de befor animauxe d'imagerie commence à prendre le meilleur signal possible.
Même en tenant compte de l'atténuation vecteur et la production d'enzymes, nous croyons que nous avons conçu un modèle précis et plus efficace en utilisant la luciférase pourrait alors être générée par un système molécule fluorescente standard pour l'analyse in vivo. Bioluminescence ne se limite pas en ayant une source qui a déclenché la lumière, qui, initialement, doit passer à travers le tissu résultant en une perte de signal. Il n'a pas non plus les problèmes automobiles de forte fluorescence de fond observés avec la souris sur leur fourrure et même de leur régime alimentaire. Le risque de toxicité du substrat luciférine est facilement contrôlée par filtration et un dosage appropriés, ce qui bioluminescente tout aussi sûr pour l'animal. Les deux systèmes fluorescents et bioluminescent peut considérablement réduire l'utilisation des animaux en raison de l'analyse in vivo qui sera important pour la recherche future en raison du changement d'attitude politique envers la recherche animale et davantage conformes aux Hume du principe des 3R (remplacement, réduction, raffinement) vers 10 l'utilisation des animaux.
Pour notre application de la pathogenèse virale et analyse de l'efficacité antivirale, la modélisation in vivo est plus efficace que les systèmes actuels 11,12 pour plusieurs raisons. Nous sommes en mesure de détecter certaines étapes clés du développement de la maladie, l'invasion du système nerveux central 1 dans le cas du TC83, avant tout clinique de la maladie se développe. De la détection de l'invasion initiale, nous sommes en mesure de visualiser plusieurs reprises chez un seul animal de la propagation et la réplication du virus de fournir un moyen plus précis de l'étude 5 progression de la maladie. Le modèle que nous avons conçu est également plus sûr pour les chercheurs en raison de l'exigence de diminution du sacrifice et de la collecte d'organes, la capacité de détecter les principaux points de progression de la maladie avant que la maladie clinique peut mener à l'irritabilité des animaux, et, spécifique à notre système, nous pouvons compléter ces études dans un vecteur viral atténué dans la ABSL2 au lieu de la ABSL3en utilisant un agent de sélection.
Études sur les maladies futures utilisent de plus en bioluminescente modélisation IVIS. Les progrès réalisés dans les techniques modernes de la biologie moléculaire et le clonage permettant l'insertion d'un gène de la luciférase rapidement et à moindre coût dans les deux vecteurs viraux et bactériens. La capacité à développer des souris transgéniques exprimant un gène de la luciférase promoteur dépendant fournit également un autre système pour l'étude de bioluminescence. Enfin, récemment mis au point des sondes bioluminescentes comme sonde étriers inflammation RediJect réagit avec de la myéloperoxydase permettant la visualisation in vivo de phagocyte réaction inflammatoire. Ces nouvelles technologies associées à l'efficacité croissante des caméras et des logiciels rend bioluminescente IVIS un système viable pour de futures recherches dans de nombreux domaines d'études différents.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Institut des sciences translationnelle UTMB-NIH 1UL1RR029876-01 et Alisha Prather pour son aide avec le montage vidéo pour ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
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