Summary
Använda luciferas och in vivo imaging system (IVIS) som ett nytt medel för att identifiera sjukdomar endpoints innan kliniska utveckling sker. IVIS har tillåtit oss att visualisera i realtid invasionen av encephalitic virus under flera dagar, vilket ger en mer exakt sjukdom modell för framtida studier. Det har också gjort det möjligt för oss att identifiera potentiella skyddande egenskaper antivirala läkemedel och vacciner snabbare än vad som nu används djurmodeller. Möjligheten att utnyttja enskilda djur över flera tidpunkter ger minskade djur krav, kostnader och övergripande sjuklighet till djuren utnyttjas säkerställa en mer human och mer vetenskapliga metoder av sjukdom studie.
Abstract
Moderna framsteg inom bildteknik uppmuntra till ytterligare utveckling och förfining i vägen virala forskningen sker. Ursprungligen föreslog Russel och Burch i Humes 3R (ersättning, begränsning och förbättring), är användningen av djurmodeller i vetenskaplig forskning under konstant press att identifiera nya metoder för att minska användningen av djur och samtidigt förbättra den vetenskapliga noggrannhet och hastighet. En stor utmaning för Humes huvudmän är dock hur man ska se till att studierna är statistiskt korrekta och samtidigt minska sjuklighet djursjukdomar och totala antalet. Vaccin effektivitetsstudier kräver för närvarande ett stort antal djur för att vara statistiskt signifikant och resulterar ofta i hög sjuklighet och dödlighet slutpunkter för identifiering av immunskydd. Vi utnyttjade avbildning in vivo-system (IVIS) i kombination med en firefly bioluminescent enzym att successivt spåra invasionen av det centrala nervsystemet (CNS) av en ENCEphalitic virus i en murin modell. Typiskt, fortskrider sjukdomen relativt långsamt, men virusreplikation är snabb, särskilt i CNS, och kan leda till en ofta, dödlig utgång. Efter intranasal infektion av mössen med TC83-Luc, ett försvagat venezuelansk hästencefalitvirus virusstam modifierad för att uttrycker en luciferasgen, har vi möjlighet att visualisera virusreplikation i hjärnan minst tre dagar före utvecklingen av kliniska sjukdomssymtom. Använda CNS invasion som en viktig encephalitic sjukdomsutveckling slutpunkt kan vi snabbt identifiera terapeutiska och vaccin skyddar mot TC83-Luc infektion innan kliniska symptom utvecklas. Med IVIS teknik vi kan visa en snabb och korrekt testning av narkotika terapi och vacciner samtidigt minska antalet djur och sjuklighet.
Protocol
1. Djurpreparering
- Djur ankomst: Vid ankomsten till djuret skyddsnivå 2 (ABSL2) anläggningar, tillåta att djur minst 2 dagar att acklimatisera sig till sin nya miljö. Efter denna vilotid undersöka djuren för att utvärdera deras hälsa och allmänt utseende.
- Vid användning av fluorescerande reportrar är det viktigt att placera alla djurförsök på en alfalfa diet för att begränsa mängden GI autofluorescens och bakgrund signal.
- Shave djur: Att förbättra självlysande signalen detekteras från Skallparti under avbildning, raka huvudet på alla djur. Söva djuren med en blandning av syrgas och förångas isofluran. När djuren är helt bedövad, använda elektriska Clippers att raka sina huvuden. När du är klar med rakning, återlämna djuren till sina burar och observera för fullständig återhämtning från effekterna av anestesi.
- Bio Medic DataSystem (BMDS) transponder insättning (att ske efter rakning av mössen medan djuren är fullt bedövad): För en mindre invasiv sätt att spåra temperatur implantat en förprogrammerad BMDS trådlös transponder subkutant i ryggen regionen varje mus. Dessa transpondrar möjliggör trådlös identifiering och temperatur inspelning. Efter implantation av transpondern, tillämpa en veterinär kvalitet vävnadsadhesiv till såret.
- Baseline samling: Innan infektion, spela in en baslinje temperatur och vikt för alla djur. Samla blod för plackreduktion neutralisationstest (PRNT) analys genom retro-orbital (RO) blöder medan mössen är under narkos. Efter blodtappning tillämpa veterinär antibiotika ögonsalva för att minska potentiell sekundär bakteriell infektion. Denna grundläggande samling bör kompletteras med hänsyn till det antal gånger djuren placeras under narkos på grund av stress på möss. Framtida RO samlingar should att avslutas efter avbildning medan musen är fortfarande under narkos. Den maximala blod uppsamlas från en RO bör vara cirka 200 pl.
- Infektion: Placera möss under anestesi såsom beskrivits tidigare. Inokulera genom den intranasala vägen med en dos på 5x10 6 till 5x10 pfu 7 TC83-luciferas i en total volym av 40 pl utspädd med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom intranasal infektion. Efter infektion, placera mössen i sitt boende bur och observera återhämtning.
2. Animal Imaging
Friskrivningsklausul: Håll möss inom sin bostad, om biosäkerhet skåp (BSC) eller XIC inneslutning rutan hela tiden. De godkända BSC för detta protokoll är en klass II typ B1 eller B2.
- Injicera alla djur med 10 | il per gram kroppsvikt av intraperitoneal (IP) luciferin vid en koncentration av 15 mg / ml.
- Möss som fick Ampligen ska vara injected IP i en dos av 12,5 mg / kg kroppsvikt vid -4 timmar efter infektion eller 48 timmar efter infektion baserat på deras grupp.
- Före injektion med luciferin, separera mössen i grupper om tre för att säkerställa en korrekt passning i XIC-3 inneslutning rutan.
- För alla avbildning, använda okulär salva / smörjmedel för att förhindra torkningen av hornhinnan under hela förfarandet.
- Öppna LivingImage programmet och tryck Initiera att förbereda avbildning rutan, set automatisk sparande, exponeringstid på auto (exponeringstid på auto är en ny funktion i LivingImage mjukvaran 3,2 och nyare), visa fält C och filter för att öppna, fält uppfattning baseras på antalet möss du avbildning, och filtret kan optimeras som behövs för andra avbildande projekt.
- Kontrollera att luften kolfilter inte har löpt ut, är syre tanken full, och isofluran reservoaren är fylld. Placera små remsor av eltejp i XIC-3 isolation låda som hjälper med att minska djurens rörelser under avbildning.
- Injicera möss med luciferin IP som beskrivs i avsnitt 2,1 och plats i Isofluran induktion kammaren (med lock öppnas) under 3-5 minuter.
- Efter 5 minuter, stänger locket på induktion kammaren och starta flödet av isofluran. Bedövningsmedlet drivs vid ungefär 3-5% med syre flödeshastigheten inställd på ungefär 2,0 liter / min. När helt medvetslös vänta ytterligare 30 sekunder och överföra mössen till XIC-3 isolering rutan. Se till att biosäkerhet skåp utnyttjas möjliggör säker eliminering av isofluran som detta förfarande innebär förlust av isofluran från induktion kammaren (den IVIS enheten innehåller sin egen Passiva Fair kapslar och den XIC-3 inneslutningslåda direkt ansluter till in / ut uttagen att säkerställa innehöll bedövningsmedel flöde).
- Överför mössen baserade på chip / gruppnummer i XIC-3 isolering låda med isofluran kontakten bifogas ettD Öppna. Placera möss så att de som anges i sternala VILA med huvud försiktigt vilande på bandet band.
- Torka av XIC inneslutning rutan med etanol, spray händer och botten av XIC-3 med cavicide och överföra till IVIS avbildning kammare. Återanslut anestesi till inneslutningslåda gång inuti bildenheten.
- Efter 10 minuter efter injektion av luciferin, bild mössen genom den levande bildbehandlingsprogram.
- Efter inledande avbildning med en öppen filter inleda en DLIT 3-dimensionell avbildning med Sekvensanalys och Image Wizard setup för självlysande eldflugeluciferas. Denna avbildning process kommer att ta 4-5 min och bör kompletteras med ett synfält relevant för önskat antal möss.
- Ex vivo analys är möjlig efter obduktion och insamling av hjärnan. Placera hjärnan på en steril petriskål, droppa 50-100 ul lager luciferin på toppen, och placera i imaging låda.
- Slutföra en andra öppen filter bild vid 15-17 min efter infektion efter avslutad DLIT avbildning. Se till sekvensanalys är avstängd och synfältet och filterinställningar återgår till tidigare inställningar.
3. Return Möss och dataanalys
- Stäng av isofluran förångaren och överföra XIC inneslutning rutan tillbaka till biosäkerhet skåpet.
- Placera mössen tillbaka inom sin bostad, stäng den övre, spraya utsidan med lämpligt desinfektionsmedel och plats tillbaka på huset rack.
- Se till möss har återhämtat sig helt från anestesi.
- Upprepa ovanstående procedur eftersom experimentet kräver tills avbildning är klar.
- Desinficera BSC, stänga av utrustningen, och överför alla data till en extern laboratorium plats för ytterligare analys.
- Analysera data och skapa 3-dimensionella bilder baserade på IVIS resultat utiLizing av LivingImage programvara.
- Se till att bilden är korrekt orienterad och belysning / färgbalans ställs in. Inom verktygspaletten alternativen inkluderar Bildjustering, korrigeringar, bildinformation, och ROI verktyg.
- Utnyttja ROI former för att identifiera specifika signalstyrkor baserat på plats.
- Rekonstruera yttopografi att markera med musen kroppen initiera 3D DLIT rekonstruktion och använda linjär anpassning för att ställa orgeln kartan till topografiska återuppbyggnaden.
- Ytterligare viral titrering analys kan ske genom insamling av blod och organ. Titrering i denna studie genomfördes genom homogenisering av hjärnvävnad i Modified Eagles Medium (MEM). Homogenatet serieutspäddes och vi infekterade en 6 brunnsplatta av Vero-celler under 1 timme. Cellerna täcktes med en 1,5% agarose/2xMEM overlay och inkuberades under 2 dagar vid 37 grader. Cellerna fixerades med 10% formalin under 30 minuter och färgades medkristallviolett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med en genetiskt modifierat virus, TC83-Luciferas, såg vi en ökning i bioluminescent signalstyrka som virusreplikationen flyttas från den nasala regionen i de centrala CNS (Figur 1). På grund av den höga virusreplikation takt, förväntar vi oss att se höga bioluminescent signal (figur 2A) beroende på vektorn och djuret immunsvaret till vektorn. Vi förväntar oss denna signal ökar fortsätter till en topp, mellan dagar 5-7 efter infektion, i kombination med virusreplikation topp i CNS (Figur 2B). Efter signalen och virala topp, förväntar vi oss att se en minskning i signal både till följd av en minskning i viral replikation och på grund av en förlust av av luciferasgenen. Med dessa signalvärden vi räknar med att kunna kvantifiera virusmängden baserat på styrkan hos signalen, vilket ger en in vivo-metod för att exakt beräkna progressivt ökande viral belastning i ett enda djur särskil IC till TC83-Luciferas.
Utnyttja denna modell som ett sätt att analysera vaccin och antivirala behandlingar, räknar vi med att kunna upptäcka en skillnad mellan effektiva behandlingar baserade på en minskning av bioluminescent signal. I vårt fall, mot TC83-luciferas, kan vi använda IP-Ampligen (en Toll-like receptor 3-agonist) eller vaccinering tre veckor före infektion, att avsevärt minska virusinfektion och självlysande signal under hela studien (Figur 3). Denna minskning kan direkt korreleras till en minskning i virusmängd i CNS (data ej visade). Som ett sätt att till fullo utveckla och visualisera teknik är IVIS programvara LivingImage kan göra 3-dimensionella bilder av självlysande signalen (Figur 4), som ger oss möjlighet att enkelt identifiera platser med hög virusreplikation baserad på vävnad djup och sammansättning.
/ 4429/4429fig1.jpg "alt =" Bild 1 "FO: content-width =" 5in "FO: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Figur 1. IVIS avbildning av TC83-luciferas Tre C57BL / 6 möss infekterades genom intranasal utmaning med TC83-luciferas och avbildas på 2, 4, 6 och 8 dagar efter infektion (DPI). Bilder gjordes efter IP-luciferin injektion med en exponeringsautomatiken längd och öppen filter. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Båda stammar av möss hade liknande självlysande signalstyrka efter IP-injektion av luciferin med en fördröjning på 10 minuter efter injektionen innan avbildning slutfördes (A). Viral belastning i hjärnan (pfu / g vävnad) visar en stark korrelation hela infektionen till biolumiescent signalen (B).
Figur 3. Behandling Jämförelse Använda IVIS. Behandling comarison efter TC83-Luciferas infektion i C3H/HeN-möss. Möss immuniserades med subkutan TC83 23 dagar före utmaning med TC83-Luciferas presenteras med någon bioluminiscerande signalen (A). Möss som fick IP-Ampligen vid -4 och +48 timmar efter infektion (B) visade reducerade nivåer jämfört med möss som inte fick någon behandling (C).
Figur 4. 3-dimensionell rekonstruktion avbildning. Använda 3-dimensionell rekonstruktion vi visualiseras toppen läge TC83-Luciferase infektion använder LivingImage s DLIT rekonstruktion verktyg. Vi kan lokalisera djup och lokalisering av den primära signalen i CNS utnyttjar denna technique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även detta protokoll omfattar imaging aspekterna för in vivo-analys är det viktigt att erkänna bioluminescerande vektorn som en nyckelfaktor för framtida studier. Vår användning av TC83, en försvagad vaccinstam av VEEV, som en vektor för expression av luciferas säkerställer att stora mängder av enzymet produceras på grund av den höga hastigheten replikation av viruset i CNS såsom tidigare beskrivits 1-4. Medan tillsatsen av ett andra subgenoma promotor och luciferas resultaten genen i ytterligare attenuering av det rekombinanta viruset jämfört med vild typ TC83, förefaller denna dämpning inte att ändra det kliniska förloppet av sjukdomen inom de första 6 dagarna av infektion 5. Vi förväntar att se en förlust av luciferasgenen genom replikation av viruset över tiden men återigen detta inte syns förrän senare i utvecklingen av sjukdomen. Utveckling av andra patogena vektorer, virala och bakteriella, bekräftar potentialen och effektivitetav IVIS och luciferas över flera områden patogener forskning 6-9.
Avbildningsprocessen själv har några viktiga steg som måste slutföras innan en fullständig undersökning kan genomföras. En första analys av självlysande styrka vektorn bör vara klar i en pilotstudie med en minimal grupp av djur. Den förväntade läget in vivo av luciferas ackumulation skall vara kända i förväg på grund av vektorn används, men den förväntade signalstyrkan bör bestämmas innan behandling en stor studie. Med den nya mjukvaran en exponering längd analys är inte lika nödvändigt på grund av automatisk exponering upptäckt funktionen nu inbyggd i mjukvaran, men en tidsfördröjning baserat på injektion av luciferin fortfarande måste fastställas. Även med alla dessa signaler beräkningar kan bioluminescerande upptäckt fortfarande begränsad på grund av vektor djup och övergripande djur pigment och päls. Vi rekommenderar starkt att rakning av djur aktuellte avbildning börjar få den starkaste signalen möjligt.
Även redovisning av vektor dämpning och enzymproduktion, tror vi att vi har utformat en noggrann och effektivare modell använder luciferas sedan kunde genereras med en vanlig fluorescerande molekyl för in vivo-analys. Bioluminescens är inte begränsad genom att ha en initierande ljuskälla, som inledningsvis måste passera genom vävnad resulterar i en förlust av signal. Det skall heller inte har de höga bakgrunden auto fluorescerande problem ses med möss på sin päls och även från sin kost. Risken för toxicitet från luciferin substratet styrs enkelt genom rätt filtrering och dosering, gör bioluminiscent lika säkert för djuret. Både lysrör och självlysande system kan drastiskt minska användningen av djur på grund av in vivo-analys som kommer att vara viktigt för framtida forskning på grund av den förändrade politiska inställning till djurförsök och ytterligare anslutning till Hume s 3R (ersättning, begränsning och förbättring) mot djuranvändning 10.
För vår tillämpning av viral patogenes och antiviral effekt analys in vivo modellering är effektivare än dagens system 11,12 för flera skäl. Vi kan påvisa specifika viktiga steg för sjukdomsutveckling, CNS-invasion 1 i fallet med TC83, innan någon klinisk sjukdom utvecklas. Från första invasionen upptäckt, kan vi gång på gång visualisera i ett enda djur spridningen och replikering av viruset ger en mer exakt sätt studera sjukdomsutveckling 5. Den modell vi har utformat är också säkrare för forskare pga minskad kravet på offer och orgel samling, förmågan att upptäcka viktiga punkter sjukdomsprogression innan klinisk sjukdom kan leda till djur irritabilitet och specifika för vårt system, kan vi slutföra dessa studier i en försvagad viral vektor i ABSL2 stället för ABSL3utnyttjande en utvald medel.
Framtida sjukdom studier kommer alltmer använda självlysande IVIS modellering. Framsteg inom modern molekylärbiologiska tekniker och kloning tillåter insättning av en luciferasgen snabbt och billigt i både virala och bakteriella vektorer. Förmågan att utveckla transgena möss som uttrycker en promotor beroende luciferasgen tillhandahåller även ett annat system för självlysande studie. Slutligen reagerar nyutvecklade självlysande sonder som Skjutmått RediJect inflammation sond med myeloperoxidas möjliggör in vivo-visualisering av fagocyter inflammation reaktion. Den nya tekniken i kombination med den ökande effektiviteten av kameror och programvara gör bioluminescent IVIS ett hållbart system för framtida forskning inom många olika ämnesområden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Institutet för translationell vetenskaper UTMB-NIH bidrag 1UL1RR029876-01 och Alisha Prather för hennes hjälp med videoredigering för detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
