Summary
Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de utilizar animais individuais sobre múltiplos pontos temporais garante condições de polícia reduzidos, custos e morbidade global para os animais utilizados garantir um meio mais humanas e mais científica do estudo da doença.
Abstract
Os avanços modernos em tecnologia de imagem estimular o desenvolvimento eo aperfeiçoamento da forma de pesquisa viral é realizado. Inicialmente proposto por Russel e Burch em 3Rs Hume (substituição, redução, refinamento), a utilização de modelos animais na pesquisa científica está sob constante pressão para identificar novas metodologias para reduzir o uso de animais, melhorando a precisão científica ea velocidade. Um grande desafio para diretores de Hume no entanto, é a forma de garantir os estudos são estatisticamente preciso, reduzindo a morbidade das doenças animais e números totais. Estudos de eficácia de vacinas actualmente requerem um grande número de animais, a fim de ser considerado estatisticamente significativo e muitas vezes resultam em morbidade e mortalidade terminais para a identificação de protecção imunitária. Utilizamos sistemas de imagem in vivo (IVIS) em conjunto com uma enzima bioluminescente pirilampo para controlar progressivamente a invasão do sistema nervoso central (SNC) através de uma ciaphalitic vírus em um modelo murino. Tipicamente, a doença progride de forma relativamente lenta, no entanto a replicação do vírus é rápida, especialmente dentro do sistema nervoso central, e pode levar a um resultado, muitas vezes, fatal. Após a infecção intranasal de murganhos com TC83-Luc, uma estirpe de vírus atenuado da encefalite equina venezuelana modificado para expressão de um gene da luciferase, somos capazes de visualizar a replicação do vírus no cérebro, pelo menos, três dias antes do desenvolvimento de sintomas clínicos de doença. Utilizando invasão do SNC como objectivo o desenvolvimento de doença encefálica chave que são capazes de identificar rapidamente terapêutico e proteção da vacina contra TC83-Luc infecção antes de desenvolver os sintomas clínicos. Com a tecnologia IVIS somos capazes de demonstrar o teste rápido e preciso de drogas e vacinas terapêuticas, reduzindo o número de animais e da morbilidade.
Protocol
1. Preparação animal
- Chegada Animal: Na chegada ao nível de biossegurança animal 2 (ABSL2) instalações, permitir que os animais de um mínimo de dois dias para se aclimatar ao seu novo ambiente. Após este período de repouso, o controlo dos animais para avaliar sua saúde e aparência física geral.
- Quando se utiliza repórteres fluorescentes, é importante colocar todos os sujeitos animais com uma dieta livre de alfafa para limitar a quantidade de GI autofluorescência e sinal de fundo.
- Shave animais: Para melhorar o sinal bioluminescente detectado da região craniana durante o exame; raspar as cabeças de todos os animais. Anestesiar os animais com uma mistura de gás de oxigénio e vaporizado isoflurano. Uma vez que os animais são totalmente anestesiado, use cortadores elétricos para raspar a cabeça. Terminado o barbear, os animais regressar às suas gaiolas e observar a recuperação completa dos efeitos da anestesia.
- Bio Medic DadosSistemas de inserção de transponder (BMDs) (a realizar na sequência de corte dos ratinhos enquanto que os animais são completamente anestesiados): Para um meio menos invasivos para controlar a temperatura de um implante pré-programado BMDs transponder sem fios via subcutânea na região dorsal de cada rato. Estes transponders permitir a identificação sem fio e gravação de temperatura. A seguir à implantação do transponder, aplicar um adesivo de tecido de grau veterinária para a ferida.
- Coleta basal: Antes de infecção, gravar uma temperatura basal e peso para todos os animais. Coleta de sangue para análise de teste de placa de neutralização de redução (PRNT) através de retro-orbitais (RO) sangrar enquanto os ratos estão sob anestesia. Após a coleta de sangue, aplique pomada veterinária antibiótico para reduzir infecção secundária potencial bacteriana. Esta colecção de base deverá ser completado com consideração para o número de vezes que os animais são colocados sob anestesia devido ao stress em ratos. Futuras coleções ro should ser concluída após imagem, enquanto o mouse ainda está sob anestesia. O sangue coletado de um máximo de RO deve ser em torno de 200 ul.
- Infecção: ratinhos lugar sob anestesia, como descrito anteriormente. Inocular por via intranasal com uma dose de 5x10 6 a 5x10 7 pfu TC83-Luciferase em um volume total de 40 ul de diluição de fosfato salino tamponado (PBS) por meio de infecção intranasal. Após a infecção, coloque os ratos dentro de sua gaiola habitação e observar a recuperação.
2. Imagens de animais
Disclaimer: Mantenha ratos dentro de sua unidade habitacional, o gabinete de segurança biológica (CSB), ou a caixa de contenção XIC em todos os momentos. Os BSCs aprovados para este protocolo são uma classe B1 ou B2 Tipo II.
- Injectar todos os animais com 10 ul por grama de peso do corpo do intraperitoneal (IP), a luciferina, a uma concentração de 15 mg / ml.
- Os ratinhos que receberam Ampligen são para ser injected IP a uma dose de 12,5 mg de peso corporal / kg a infecção -4 hr pós ou 48 hr após a infecção com base no seu grupo.
- Antes da injecção com a luciferina, separar os ratos em grupos de três para garantir um bom ajuste dentro da caixa de contenção XIC-3.
- Para todas as imagens, a utilizar uma pomada ocular / lubrificante para evitar a secagem da córnea durante todo o procedimento.
- Abra o software LivingImage e pressione Inicializar para preparar a caixa de imagem; economia auto set, tempo de exposição ao automóvel (tempo de exposição em auto é um novo recurso do software LivingImage 3.2 e mais recente), ver campo para C, e filtro para abrir; campo de vista é baseada no número de murganhos que você está imagiologia e de filtro pode ser optimizada, conforme necessário para outros projectos de imagiologia.
- Confirmar que os filtros de carvão de ar não expiraram, o tanque de oxigênio está cheio, o reservatório e isoflurano é preenchido. Coloque pequenas tiras de fita isolante no XIC-3 icaixa solation que ajuda com a redução da circulação de animais durante o exame.
- Injectar os ratos com IP luciferina, como descrito na seção 2.1 e lugar dentro da câmara de indução isoflurano (com a tampa aberta) por 3-5 min.
- Após 5 min, fechar a tampa da câmara de indução e iniciar o fluxo de isoflurano. O anestésico é operado a cerca de 3-5% com o conjunto de taxa de fluxo de oxigénio em cerca de 2,0 L / min. Depois de completamente inconsciente esperar um adicional de 30 seg e transferir os animais para a caixa de isolamento XIC-3. Verifique se o gabinete de biossegurança a ser utilizada permite a segura eliminação de isoflurano como esse procedimento irá envolver perda de isoflurano da câmara de indução (a unidade IVIS contém suas próprias passivos latas Fair e da caixa de contenção XIC-3 conecta diretamente à entrada / saída soquetes para garantir o fluxo contido anestésico).
- Transfira os ratos com base em chip / número de grupo na caixa de isolamento XIC-3 com o conector de isoflurano em anexo umd abrir. Posicione os ratos para que eles são dispostos em decúbito esternal com a cabeça suavemente descansando sobre as tiras de fita.
- Limpe a caixa de contenção XIC com as mãos de etanol, spray e fundo da XIC-3 com cavicide, e transferir para a câmara de imagem IVIS. Reconectar a anestesia para a caixa de contenção, uma vez dentro da unidade de imagem.
- Depois de 10 min após a injecção de luciferina, a imagem dos ratinhos através do software de imagem viva.
- Seguindo imagem inicial com um filtro aberto, iniciar uma imagem 3-Dimensional DLIT utilizando a análise de seqüência e configuração Assistente de imagem para bioluminescente da luciferase firefly. Este processo de imagem terá 4-5 minutos e deve ser completada em um campo de visão relevante para o número de ratinhos desejados.
- Ex vivo-análise é possível após necropsia e coleta do cérebro. Coloque o cérebro em uma placa de Petri estéril, escorrer 50-100 ul de estoque luciferina em cima, e lugar dentro da imaging caixa.
- Finalize uma imagem aberta de segunda filtro em 15-17 de infecção pós min após a conclusão da imagem DLIT. Assegurar a análise de sequência é desligado eo campo de visão e configurações de filtro são retornados às configurações anteriores.
3. Ratos de retorno e análise de dados
- Desligue o vaporizador isoflurano e transferir a caixa de contenção XIC de volta para o armário de biossegurança.
- Coloque os ratos de volta dentro de sua unidade habitacional, perto do topo, borrife o exterior com desinfetante apropriada e lugar de volta na prateleira habitação.
- Garantir ratos se recuperaram totalmente da anestesia.
- Repetir o procedimento acima, como a experiência requer até imagiologia foi concluída.
- Desinfectar o BSC, desligue o equipamento, e transferir todos os dados para um local fora do laboratório para análise posterior.
- Analisar os dados e gerar três imagens tridimensionais baseadas em resultados IVIS UTIlisador o software LivingImage.
- Garantir que a imagem é devidamente orientada e iluminação / cor equilíbrio está definido. Dentro da paleta de ferramentas as opções incluem Ajuste de imagem, Correções, Informação, Imagem e Ferramentas de ROI.
- Utilize formas de ROI para identificar os pontos fortes de sinal específicos baseados em localização.
- Reconstruir a topografia da superfície para realçar o corpo do mouse, inicializar reconstrução DLIT 3D, e usar ajuste linear para definir o mapa de órgãos, para a recomposição topográfica.
- Análise de titulação mais viral pode ser concluído através de coleta de sangue e de órgãos. Titulação neste estudo foi concluído através de homogeneização do tecido cerebral em modificado águias médio (MEM). O homogenato foi diluído em série e que infectou uma placa de 6 poços de células Vero para 1 hr. As células foram cobertas com uma camada agarose/2xMEM 1,5% e incubadas durante 2 dias a 37 graus. As células foram fixadas com formalina a 10% durante 30 minutos e coradas comvioleta de cristal.
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Representative Results
Com um vírus geneticamente modificado, TC83-Luciferase, vimos um aumento na intensidade do sinal bioluminescente como a replicação do vírus se move da região nasal para o SNC central (Figura 1). Devido à elevada taxa de replicação viral, esperamos ver altos níveis de sinal de bioluminescência (Figura 2A) que dependem do vector e a resposta dos animais imunes ao vector. Esperamos que este aumento de sinal para prosseguir até atingir um pico, entre 5-7 dias após a infecção, em combinação com o pico da replicação viral no SNC (Figura 2B). Na sequência do sinal e de pico viral, esperamos ver uma diminuição do sinal, tanto devido a uma diminuição na replicação virai e, devido a uma perda do gene da luciferase. Com estes valores de sinal que esperar para ser capaz de quantificar a carga viral baseado na intensidade do sinal, fornecendo um método in vivo para calcular com precisão a aumentar progressivamente a carga viral de um único animal, especi ic a TC83-Luciferase.
Utilizando este modelo, como um meio para analisar a vacinas e tratamentos antivirais, espera-se ser capaz de detectar uma diferença entre tratamentos eficazes baseadas em uma redução no sinal bioluminescente. No nosso caso, contra TC83-Luciferase, podemos utilizar Ampligen IP (a Toll-like receptor 3 agonista) ou vacinação de três semanas antes da infecção, para reduzir significativamente a infecção viral e um sinal de bioluminescência durante o estudo (Figura 3). Esta diminuição pode ser directamente correlacionada com a diminuição da carga viral no SNC (dados não mostrados). Como uma maneira de desenvolver plenamente e visualiza a tecnologia, IVIS software LivingImage é capaz de tornar as imagens 3-dimensional do sinal de bioluminescência (Figura 4), que permite a fácil identificação de locais de replicação viral elevada com base na profundidade do tecido e da composição.
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Figura 1. IVIS imagem de TC83-luciferase Três ratos C57BL / 6 foram infectados através de desafio intranasal com TC83-Luciferase e digitalizado a 2, 4, 6 e 8 dias após a infecção (DPI). Imagens foram feitas após a injeção de luciferina IP com um comprimento de auto-exposição e filtro aberto. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Ambas as estirpes de ratinhos tinham intensidade do sinal semelhante bioluminescente após injecção IP de luciferina com um atraso de 10 minutos após a injecção antes da imagiologia foi concluída (A). A carga viral no cérebro (pfu / grama de tecido) mostra uma forte correlação durante a infecção com o sinal de biolumiescent (B).
Figura 3. Comparação Tratamento Utilizando IVIS. Tratamento comarison seguindo TC83-Luciferase infecção em ratinhos C3H/HeN. Os ratinhos imunizados por via subcutânea com TC83 23 dias antes do desafio com TC83 Luciferase-apresentado com nenhum sinal de bioluminescência (A). Os ratinhos que receberam Ampligen IP na infecção -4 e 48 horas pós (B) mostraram níveis reduzidos em comparação com ratinhos que não receberam nenhum tratamento (C).
Figura 4. 3-Dimensional imagem reconstrução. Utilizando 3-Dimensional reconstrução visualizamos o local pico de TC83-Luciferase infecção utilizando ferramenta LivingImage de reconstrução DLIT. Nós somos capazes de localizar a profundidade ea localização do sinal primário no interior do SNC, utilizando esta technique.
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Discussion
Embora este protocolo abrange os aspectos de imagem para análise in vivo, é importante reconhecer o vector bioluminescente como factor-chave para estudos futuros. Nossa utilização de TC83, uma estirpe de vacina atenuada de VEEV, como um vector para a expressão de luciferase assegura que grandes quantidades da enzima estão a ser produzidos, devido à elevada taxa de replicação do vírus no SNC como previamente descritos 1-4. Enquanto a adição de um segundo promotor subgenómico e os resultados do gene da luciferase na atenuação do vírus recombinante em comparação com o tipo selvagem TC83, esta atenuação não parece alterar o curso clínico da doença durante os primeiros 6 dias de infecção 5. Esperamos para ver uma perda do gene da luciferase por meio da replicação do vírus ao longo do tempo, mas de novo isso não é visto mais tarde no desenvolvimento da doença. Desenvolvimento de vectores de outros patogénicos virais e bacterianos, confirma o potencial ea eficiênciade IVIS e luciferase através de vários campos de pesquisa de patógenos 6-9.
O processo de gravação em si tem alguns passos críticos que devem ser concluídas antes de um estudo completo pode ser implementada. Uma análise inicial da força bioluminescente do vetor deve ser concluída em um estudo piloto contendo um grupo mínimo de animais. A localização esperada in vivo da acumulação de luciferase deve ser conhecido de antemão, devido ao vector utilizado, mas a intensidade do sinal esperado deve ser determinada antes do início de um grande estudo. Com o novo software de análise de extensão de exposição não é tão necessária devido ao recurso de detecção de auto exposição agora incorporado no software, mas um período de tempo com base na injecção de luciferina ainda terá de ser determinada. Mesmo com todos estes cálculos de sinal, a detecção bioluminescente pode ainda ser limitada devido à profundidade do vetor e pigmento animais em geral e de peles. Recomendamos fortemente o corte de befor animaise de imagem começa a ganhar o sinal mais forte possível.
Mesmo representando atenuação vetor e produção de enzimas, acreditamos ter projetado um modelo preciso e mais eficiente utilizando luciferase então poderia ser gerado com um sistema de molécula fluorescente padrão para a análise in vivo. A bioluminescência não é limitada por ter uma fonte de luz iniciar, que inicialmente tem de passar através do tecido, resultando na perda de sinal. Ela também não tem os problemas de fundo elevados de auto fluorescentes observados com ratinhos sobre a sua pele e até mesmo a partir de sua dieta. O risco de toxicidade a partir do substrato luciferina é facilmente controlada através de filtragem adequada e dosagem, fazendo bioluminescente apenas como seguro para o animal. Ambos os sistemas fluorescentes e bioluminescente pode reduzir drasticamente o uso de animais devido a análise in vivo que será importante para futuras pesquisas a atitude do devido mudança política para a investigação animal e mais adesão Hum3Rs E'S (substituição, redução, refinamento) em relação ao uso de animais 10.
Para a nossa aplicação de patogénese viral e análise de eficácia antiviral, na modelagem vivo é mais eficiente do que os sistemas atuais 11,12 por várias razões. Nós somos capazes de detectar específicos passos chave para o desenvolvimento da doença, a invasão do SNC 1 no caso de TC83, antes de qualquer doença clínica se desenvolve. Da detecção de invasão inicial, somos capazes de visualizar repetidamente em um único animal a difusão e replicação do vírus proporcionando um meio mais preciso de estudar a progressão da doença 5. O modelo que temos desenvolvido também é mais seguro para os pesquisadores, devido à exigência de redução de sacrifício e coleta de órgãos, a capacidade de detectar pontos de progressão principais doenças antes que a doença clínica pode levar à irritabilidade animal, e, específica para o nosso sistema, podemos concluir estes estudos em um vector viral atenuado no ABSL2 vez do ABSL3utilizando um agente.
Estudos de doenças futuras, cada vez mais utilizam modelagem IVIS bioluminescente. Avanços em modernas técnicas de biologia molecular e clonagem de permitir a inserção de um gene de luciferase rápida e barata em ambos os vectores virais e bacterianas. A capacidade de desenvolver ratinhos transgénicos que expressam um gene promotor de luciferase dependente também proporciona um outro sistema para o estudo bioluminescente. Finalmente, recentemente desenvolvidos, tais como sondas bioluminescentes Calipers sonda Inflamação RediJect reage com mieloperoxidase permitindo a visualização in vivo de reacção de inflamação fagócito. Essas novas tecnologias, combinadas com o aumento da eficiência das câmeras e software faz bioluminescente IVIS um sistema viável para futuras pesquisas em diferentes campos de estudo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Instituto de Ciências Translacional UTMB-NIH concessão 1UL1RR029876-01 e Prather Alisha por sua assistência com edição de vídeo para este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
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