Summary
小説としてルシフェラーゼおよびin vivoイメージングシステム（IVIS）を活用することで臨床開発が発生する前に病気のエンドポイントを識別することを意味します。 IVISは、私たちは今後の研究のために、より正確な疾患モデルを提供し、リアルタイムで複数の日にわたって脳炎ウイルスの侵入を可視化することができました。また、私たちは高速に現在利用されている動物モデルよりも抗ウイルス薬やワクチンの潜在的な保護機能を識別することができました。複数の時点にわたって個々の動物を利用する能力は、病気の研究のより人間的な、より科学的な手段を確保し活用動物に減少動物要件、コスト、および全体的な罹患率を保証します。
Abstract
イメージング技術の近代的な進歩は、ウイルス研究が達成されるようにさらなる開発と改良を奨励しています。当初はヒュームの3R（リデュース交換、還元、リファインメント）でラッセルとBurchによって提案された、科学研究における動物モデルの利用が科学的正確さとスピードを向上させながら、動物の使用量を削減する新たな方法論を識別するために、一定の圧力の下にある。ヒュームのプリンシパルへの主要な課題は、しかし、動物の疾病の罹患率と全体の数字を削減しつつ、研究は統計的に正確であることを確認する方法です。ワクチンの有効性の研究は、現在、統計的に有意であると見なされるためには、動物の多数を必要とし、多くの場合、免疫防御の識別のための高い罹患率と死亡率のエンドポイントにつながる。我々は徐々にリファレンスによって、中枢神経系（CNS）の侵入を追跡するためにホタル生物発光酵素と一緒にin vivoイメージングシステム（IVIS） で利用マウスモデルにおけるphaliticウイルス。典型的には、病気は、比較的ゆっくりと進行する、しかしウイルス複製は、特に中枢神経系内で、迅速であり、多くの場合、致命的な結果につながることができます。 TC83-Lucを用いたマウスの鼻腔内感染後、弱毒ベネズエラウマ脳炎ウイルス株は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように改変、我々は、少なくとも3日臨床疾患の症状の開発前に脳内でのウイルスの複製を視覚化することができます。我々は臨床症状が発現する前に速やかにTC83-Lucの感染症に対する治療薬およびワクチンの保護を識別することができるキー脳炎疾患発症のエンドポイントとして中枢神経系への浸潤を利用。 IVIS技術により、我々は動物数および罹患率を低減しつつ、薬物治療やワクチンの迅速かつ正確なテストを実証することができます。
Protocol
1。動物の準備
- 動物の到着：動物バイオセーフティレベル2（ABSL2）施設への到着時に、動物に、新しい環境に順応するために2日以上を可能にします。この休息期間に続いて、自分の健康と全体的な物理的な外観を評価するために動物を検査する。
- 蛍光レポーターを利用するとき、それはGIの自家蛍光とバックグラウンド信号の量を制限するためにアルファルファフリーダイエット上のすべての動物の科目を配置することが重要です。
- 動物を剃る：撮像中に頭蓋領域から検出された生物発光信号を改善するために、すべての動物の頭を剃る。酸素ガスの混合物で動物を麻酔し、イソフルラン気化。動物は完全に麻酔したら、頭を剃ること電気バリカンを使用しています。一度シェービングを終え、ケージに動物を戻すと麻酔の影響から完全に回復のために守ってください。
- バイオメディックデータシステム（BMDS）トランスポンダ挿入（動物は完全に麻酔をかけている間、マウスのシェービング後に場所を取るために）：低侵襲の手段のため事前にプログラムされBMDS無線トランスポンダは、各マウスの背部皮下に温度インプラントを追跡する。これらのトランスポンダは、無線識別と温度記録が可能になります。トランスポンダの移植後、傷口に獣医グレードの組織接着剤を適用します。
- ベースラインコレクション：感染する前に、すべての動物のためのベースライン温度と重量を記録する。マウスは麻酔下にある間眼窩（RO）のブリードスループラーク減少中和試験（PRNT）分析のために血液を採取します。採血後、潜在的な二次的細菌感染を減らすために獣医抗生物質眼軟膏を適用します。このベースラインコレクションは、動物がマウスに起因する応力に麻酔下に配置された回数を考慮して完了する必要があります。今後のROのコレクションマウスを麻酔下にまだある間、hould、イメージング後に完了する。 ROから収集された最大血は200μl程度になるはずです。
- 感染症：前述のように麻酔下でマウスを配置します。鼻腔感染によって緩衝生理食塩水（PBS）で希釈されたリン酸を40μlの総体積で5×10 6〜5×10 7 pfuの TC83-ルシフェラーゼの用量を用いた鼻腔内経路を介して接種する。感染後、彼らの住宅ケージ内にマウスを置くと回復を観察します。
2。動物イメージング
免責事項：すべての回で彼らの住宅の単位、生物学的安全キャビネット（BSC）、またはXIC封じ込めボックス内でマウスをおいてください。このプロトコルのための承認されたのBSCは、クラスIIタイプB1またはB2です。
- 15 mg / mlの濃度で腹腔内（IP）ルシフェリンの体重1グラム当たり10μlのすべての動物を注入します。
- Ampligenを受けたマウスはinjecteされるそれらのグループに基づいて-4時間後に感染または48時間後に感染症で12.5 mg / kg体重の用量でDのIP。
- ルシフェリンの注射の前に、XIC-3封じ込めボックス内の適切なフィットを保証するために、3つのグループにマウスを分ける。
- すべての画像は、手順全体で角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏剤/潤滑剤を使用しています。
- LivingImageソフトウェアを開き、イメージングボックスを準備するために初期化を押し、設定した自動保存、自動（自動で露光時間がLivingImageソフトウェア3.2およびそれ以降の新機能である）への露光時間、Cへのフィールドを表示したり、開くことがフィルター;フィールドビューのあなたがイメージングであるマウスの数に基づいて行われ、その他のイメージングプロジェクトのために必要に応じてフィルタを最適化することができる。
- エアチャコールフィルタの期限が切れていないことを確認し、酸素タンクがいっぱいで、イソフルランリザーバが満たされている。私はXIC-3に電気テープの小さなストリップを置き撮像時に動物の動きを減らすことを支援ゾル化ボックス。
- 3〜5分間（ふたが開いている）イソフルラン誘導チャンバ内にセクション2.1と場所で説明したようにルシフェリンのIPをマウスに注入します。
- 5分後、誘導チャンバーの蓋を閉めるとイソフルランのフローを開始する。麻酔は、約2.0リットル/分に設定酸素流量で約3〜5％で運転される。一度完全に無意識のさらに30秒待つとXIC-3分離ボックスにマウスを移す。この手順としてイソフルランの掃気安全が誘導室（IVISユニットは独自のパッシブフェアキャニスターが含まれているとXIC-3封じ込めボックスが直接イン/アウトのソケットに接続してから、イソフルランの損失も含まれるために利用されてバイオセーフティキャビネットができますを確認します）が含まれている麻酔の流れを確保しています。
- 添付イソフルランコネクタ付きXIC-3分離ボックスにチップ/グループ数に基づいてマウスを転送dが開きます。彼らは静かにテープストリップで休んで頭と胸骨の横臥にレイアウトされているので、マウスを置きます。
- cavicideエタノール、スプレー手とXIC-3の底部とXIC封じ込めボックスを拭うと、IVISイメージング室に移す。一度撮像部内側封じ込めボックスに麻酔を再接続します。
- 後のルシフェリンの注射後10分、リビングイメージソフトウェアを使用して画像をマウス。
- 開いたフィルターを使用した初期画像に続いて、配列分析および生物発光ホタルルシフェラーゼのイメージウィザードのセットアップを使用してDLIT 3次元イメージングを開始する。このイメージングプロセスは4-5分かかりますし、目的のマウスの数に関連する視野で完了する必要があります。
- 生体外分析は、脳の可能性は、次剖検およびコレクションです。 、滅菌シャーレに脳を置き上に株式ルシフェリンの50から100μlを垂れると、IMA内の場所ボックスを変更する。
- DLITイメージングの完了時に15から17分後の感染で第二のオープンフィルタ画像を完成させます。配列解析が切れていることを確認して、ビューとフィルタ設定のフィールドは、以前の設定に戻ります。
3。マウスおよびデータ解析を返す
- イソフルラン気化器の電源をオフにし、バイオセーフティキャビネットにバックXIC封じ込めボックスを転送します。
- 彼らの住居ユニット内に戻るマウスを置くと、背面筐体ラックの適切な消毒剤と場所と外観を吹きかけ、上部を閉じます。
- マウスは完全に麻酔から回復していることを確認します。
- 撮像が完了するまでの実験が必要であるように上記の手順を繰り返します。
- は、BSCを消毒装置をシャットダウンして、さらに分析するために外部の研究室の場所にすべてのデータを転送します。
- データを分析し、IVIS結果UTIに基づいて3次元画像を生成LivingImageソフトウェアをlizing。
- 画像が適切に指向していて、照明/カラーバランスが設定されていることを確認します。ツールパレット内のオプションは、画像調整、修正、画像情報、およびROIツールが含まれています。
- 場所に基づいて、特定の信号強度を識別するために、ROIの形状を利用しています。
- 、マウス本体を強調するために表面形状を再構成3D DLIT再建を初期化し、地形復興に臓器マップを設定するには、線形近似を使用しています。
- さらにウイルスの滴定分析は血液や臓器のコレクションを介して完了することができます。本研究では滴定を改変イーグル培地（MEM）で脳組織の均質化を経て完成しました。ホモジネートを段階希釈し、我々は1時間Vero細胞の6ウェルプレートを感染させた。細胞は1.5％agarose/2xMEMオーバーレイで覆われ、37℃で2日間インキュベートした。細胞を30分間、10％ホルマリンで固定して染色したクリスタルバイオレット。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ウイルス複製が中央CNS（ 図1）に鼻の領域から移動すると、遺伝的に改変されたウイルスで、TC83-ルシフェラーゼ、我々は、生物発光信号強度の増加を見た。高いウイルス複製速度のために、我々はベクトルにベクトルや動物の免疫応答に依存する生物発光信号のハイレベル（ 図2A）を参照してください期待しています。我々は、CNS内のウイルス複製のピーク（ 図2B）との組み合わせで、日5月7日、感染後の間に、この信号の増加がピークに継続を期待しています。信号およびウイルスピークに続いて、我々は、ウイルス複製の減少により、ルシフェラーゼ遺伝子の喪失に起因する両方の信号の減少を期待しています。我々はin vivo法正確に単一の動物specifで徐々に増加してウイルス量を計算するために提供して、信号の強度に基づいてウイルス量を定量化することができることを期待し、これらの信号の値を持つ TC83-ルシフェラーゼのIC。
ワクチンや抗ウイルス治療を解析する手段として、このモデルを利用して、我々は、生物発光シグナルの減少に基づいて効果的な治療間の差を検出することができることを期待しています。 TC83-ルシフェラーゼに対する我々のケースでは、我々は大幅に試験期間を通じてウイルス感染および生物発光信号（ 図3）を低減するために、感染する前に、IP Ampligen（Toll様受容体3アゴニスト）またはワクチン接種3週間を利用することができます。この減少は、直接CNS（データは図示せず）内にウイルス量の減少に相関させることができる。完全に技術を開発し、可視化するための方法として、IVISソフトウェアLivingImageは、私たちは簡単に組織の深さおよび組成に基づいて高いウイルス複製の位置を識別することを可能にする生物発光信号（ 図4）の3次元画像を作成することが可能です。
/ 4429/4429fig1.jpgの "alt ="図1 "のfo：コンテンツの幅=" 5インチ "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
図1。 TC83-ルシフェラーゼのIVISイメージング三C57BL / 6マウスを2でTC83-ルシフェラーゼと撮像を鼻腔内チャレンジ、4、6、8日後に感染症（DPI）を介して感染していた。画像は自動露出の長さとオープンフィルタでIPルシフェリン注射後作られた。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図2：マウスの両方の株がイメージング10分前にポスト噴射の遅延でルシフェリンのIP注射後に似たような生物発光信号強度（）が完成しました。脳内のウイルス量（PFU / g組織）がbiolumiescent信号に感染全体の強い相関関係を示したものである（B）。
図3。治療の比較IVISを活用。治療comarisonはC3H/HeNマウスにおけるTC83-ルシフェラーゼ感染後。マウスは生物発光信号（）が提示TC83-ルシフェラーゼと挑戦して23日前までに皮下TC83で免疫した。 -4と48時間後の感染症（B）でのIP Ampligenを受けたマウスは治療を受けていないマウス（C）に比べて減少したレベルを示した。
図4。 3次元再構成画像3次元再構成を利用し、我々はLivingImageのDLIT再建ツールを利用TC83-ルシフェラーゼ感染のピーク位置を可視化した。我々は、このテを利用CNS内の主要な信号の深さと位置をローカライズすることができますchnique。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは 、in vivo で解析するための撮像面をカバーしていますが、それは今後の研究のための重要な要因として、生物発光ベクトルを認識することは重要である。ルシフェラーゼの発現用ベクターとしてTC83当社の利用、VEEVの弱毒ワクチン株は、酵素を多量に前述の1〜4としてCNSにおけるウイルスの高い複製速度に起因する生産されていることを保証します。野生型TC83と比較して、組換えウイルスのさらなる減衰第二ゲノムプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の結果を加えながら、この減衰は感染5の最初の6日以内の疾患の臨床経過を変更するためには表示されません。我々は期待して時間をかけてウイルスの複製を通してルシフェラーゼ遺伝子の消失を確認し、再び、これは疾患の発症後半まで見られません。ウイルスと細菌の他の病原性ベクターの開発では、可能性と効率性を確認病原体の研究6-9の複数のフィールドを越えIVISとルシフェラーゼの。
イメージングプロセス自体が完全な調査を実施することができる前に完了しなければならないいくつかの重要なステップがあります。ベクトルの生物発光強度の初期分析は、動物の最小限のグループを含むパイロットスタディで仕上げなければならない。ルシフェラーゼ蓄積のin vivoでの予想される場所が原因で利用ベクタにあらかじめ知られている必要がありますが、予想される信号強度は、大規模な研究を開始する前に決定されるべきである。新しいソフトウェアで露出長解析はソフトウェアに組み込まれますが、ルシフェリンの注入に基づいて遅延時間がまだ決定する必要があります自動露出検出機能のため、必要に応じてではありません。これらの信号の全ての計算でも、生物発光検出はまだベクトルの深さと全体的な動物の顔料や毛皮のために制限することができます。我々は、動物の血友病のシェービングを強くお勧めします電子イメージングが可能な最強の信号を得るために開始されます。
ベクトルの減衰と酵素生産のためにも会計、我々は、ルシフェラーゼを利用し、正確かつ効率的なモデルは 、in vivo での解析のための標準的な蛍光分子系で生成することができ設計していると信じています。生物発光は、最初の信号の損失をもたらして組織を通過する必要があります開始する光源を、持っていることによって限定されるものではない。また、彼らの毛皮でも、彼らの食事からマウスで見られる高いバックグラウンドの自動蛍光の問題を抱えていない。ルシフェリン基質から毒性の危険性が容易に動物用の生物が同じように安全に、適切な濾過及び用量を介して制御されます。蛍光および生物発光システムの両方が大幅に変化する政治姿勢による動物の研究やハムするためのさらなる遵守に向けた今後の研究のために重要であろう生体内分析でのために動物の使用量を減らすことができます動物の使用に向けた10 eの3R（リデュース交換、還元、リファインメント）。
ウイルス病原性と抗ウイルス効果分析の我々のアプリケーションについては、in vivoでのモデリングでは 、複数の理由のための現在のシステム11,12よりも効率的です。どのような臨床疾患が発現する前に我々は、TC83の場合におけるCNS浸潤1、病気の開発のための特定の重要なステップを検出することができます。初期の侵入検知から、我々は繰り返し単一の動物ウイルスの拡散、レプリケーションが病気の進行を勉強5のより正確な手段を提供することで視覚化することができます。我々が設計したモデルも犠牲と臓器の収集、臨床疾患は動物の過敏性につながることができます前に、キーの疾患の進行ポイントを検出する機能、そして、我々のシステムに固有の減少要件に起因する研究者のための安全です、我々はこれらの研究を完了することができます代わりにABSL3のABSL2における弱毒ウイルスベクターでセレクトエージェントを利用する。
将来の病気の研究はますます生物発光IVISモデリングを活用していきます。現代の分子生物学的技術とクローニングの進歩は、ウイルスや細菌の両方のベクトルに迅速かつ安価にルシフェラーゼ遺伝子を挿入することができます。プロモーター依存性ルシフェラーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを開発する能力はまた、生物発光研究のために別のシステムを提供しています。最後に、このようなキャリパーRediJect炎症プローブとして新たに開発された生物発光プローブは、ミエロは食細胞の炎症反応の in vivo 可視化を可能にすると反応します。カメラとソフトウェアの効率化と組み合わせてこれらの新技術は、生物発光IVIS研究のさまざまな分野における将来の研究のための実行可能なシステムとなっています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この原稿のためのビデオ編集と彼女の支援のためのトランスレーショナル科学UTMB-NIHの助成金1UL1RR029876-01とアリーシャプレイザー研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 4, 245-247 (1998).
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
