Summary
소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능을 식별 할 수 있습니다. 여러 시간 지점을 통해 개인 동물을 활용하는 기능은 감소 동물의 요구 사항, 비용, 질병 연구의 더 인간적 더 과학적인 수단을 확보 활용 동물 전반적인 질병을 보장합니다.
Abstract
영상 기술의 현대적인 발전은 바이러스 성 연구가 수행되는 방식으로 발전하고 상세 검색을 권장합니다. 처음 흄의 3Rs에 Russel과 버치 제안한 (교체, 감소, 정제), 과학 연구에서 동물 모델의 활용은 과학 정확성과 속도를 향상하면서 동물 사용을 줄이기 위해 새로운 방법론을 식별 할 수 지속적인 압력을 받고 있습니다. 흄의 원칙에 대한 주요 도전하지만, 동물 질병 병적 상태와 전체 숫자를 줄이는 한편 연구 통계적으로 정확하도록하는 방법입니다. 백신 효능 연구는 현재 통계적으로 유의미한 것으로 간주하기 위해 동물의 다수를 필요로 종종 면역 보호의 식별을위한 높은 병적 상태와 사망률의 끝점하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 우리는 점점 줬어에 의해 중추 신경계 (CNS)의 침략을 추적 할 반딧불 발광 생물 효소와 함께 생체 이미징 시스템 (IVIS)에 활용손쥐 모델의 phalitic 바이러스. 일반적으로,이 병은 비교적 천천히 진행하지만 바이러스 복제는 특히 CNS 내에서 빠른 속도이며, 종종 치명적인 결과로 이어질 수 있습니다. TC83 룩과 마우스의 비강 감염 후, 감쇠 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 변종이 루시 페라 제 유전자를 표현하도록 수정, 우리는 최소 3 일전에 임상 질병의 증상을 개발하기 전에 뇌에서 바이러스 복제를 시각화 할 수 있습니다. 우리는 임상 증상이 개발되기 전에 신속하게 TC83 룩 감염에 대한 치료 및 백신 보호 기능을 식별 할 수있는 키 encephalitic 질병 개발 엔드 포인트로 CNS의 침략을 활용. IVIS 기술을 통해 우리는 동물 번호와 질병을 줄이면서 약물 치료학 및 백신의 신속하고 정확한 테스트를 시연 할 수 있습니다.
Protocol
1. 동물 준비
- 동물 도착 : 동물 바이오 안전성 수준 2 (ABSL2) 시설에 도착시, 동물에게 그들의 새로운 환경에 적응하기 위해 이일을 최소 할 수 있습니다. 이 휴식 기간 후, 자신의 건강 및 전반적인 신체적 인 외모를 평가하기 위해 동물을 검사한다.
- 형광 기자를 활용하면은 GI의 autofluorescence 및 배경 신호의 양을 제한하는 알팔파 무료로 다이어트의 모든 동물 과목을 배치하는 것이 중요합니다.
- 동물을 면도 : 영상 중에 두개 지역에서 발견 발광 생물 신호를 향상 시키려면, 모든 동물의 머리를 면도. 산소 가스의 혼합물로 동물을 마취하고 isoflurane 기화. 동물이 완전히 anesthetized되면, 그들의 머리를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 일단 면도가 완료, 자신의 새장에 동물을 반환하고 마취의 영향으로부터 완전히 복구를 위해 관찰합니다.
- 바이오 의사 데이터시스템 (BMDS) 트랜스 폰더 삽입 (동물이 완전히 anesthetized있는 동안 마우스 면도 후 자리를 차지) : 덜 침습적 방법은 preprogrammed BMDS 무선 송수신기는 각 마우스의 등 지역에 피하 온도 이식을 추적 할 수 있습니다. 이 트랜스 폰더는 무선 식별 및 온도 기록을위한 수 있습니다. 트랜스 폰더의 주입 후, 상처에 수의학 급 조직 접착제를 적용합니다.
- 기본 컬렉션 : 감염 전에, 모든 동물들에게 기준 온도와 무게를 기록합니다. 쥐가 마취에서있는 동안 복고풍 궤도 (RO) 블리드를 통해 플라크 감소 중화 시험 (PRNT) 분석을 위해 혈액을 수집합니다. 혈액 수집 후, 잠재적 인 이차 세균 감염을 줄이기 위해 수의학 항생제 눈 연고를 적용 할 수 있습니다. 이 기본 컬렉션은 동물 쥐에 의한 스트레스로 마취하에 배치 횟수를 고려하여 완료해야합니다. 미래 RO 컬렉션의마우스가 마취에서있는 동안 신고해야할, 영상 이후에 완료 될. RO에서 수집 한 최대 혈액 200 μl 주변에 있어야합니다.
- 감염 : 이전에 설명 된대로 마취하에 장소 마우스. 인산에 의해 희석 40 μl의 총 볼륨의 - 루시 페라 제 TC83 5x10 6 5x10 7 PFU의 복용량을 사용하여 비강 경로를 통해 예방이 비강 감염을 통해 (PBS) 식염 버퍼링. 감염 후, 자신의 주택 케이지 내에서 쥐를 넣고 복구를 관찰합니다.
2. 동물 이미징
면책 조항 : 자신의 주택 단위, 바이오 캐비닛 (BSC), 또는 항상 XIC 봉쇄 상자에서 마우스세요. 이 프로토콜에 대한 승인 BSCs은 클래스 II 타입 B1 또는 B2 있습니다.
- 15 MG / ML의 농도에 intraperitoneal (IP) luciferin의 체중 g 당 10 μl와 함께 모든 동물을 주사.
- Ampligen을받는 쥐 injecte하여야한다자신의 그룹에 따라 -4 시간 포스트 감염 또는 48 시간 게시물 감염에서 12.5 밀리그램 / kg 체중의 복용에 d 개의 IP.
- 이전 luciferin을 주입하기 XIC-3 봉쇄 상자에서 적절한 운동을 보장하기 위해 세 그룹으로 쥐를 구분합니다.
- 모든 영상은 절차를 통해 각막의 건조를 방지하기 위해 안구 연고 / 윤활제를 사용합니다.
- LivingImage 소프트웨어와 언론 이미징 상자를 준비하는 초기화 열고, 설정 자동 저장, 자동으로 노출 시간 (자동 LivingImage 소프트웨어 3.2 이상의 새로운 기능입니다에 대한 노출 시간), C로의 현장을 볼 수 있으며, 열 필터, 분야 보기의는 사용자가 이미지 아르 생쥐의 수에 기초 및 기타 영상 프로젝트를 위해 필요에 따라 필터를 최적화 할 수 있습니다.
- 공기 숯 필터가 만료되지 않은 확인, 산소 탱크 가득하고, isoflurane 저수지가 가득 차 있습니다. XIC-3 전에서 전기 테이프의 작은 조각을 배치어떤 solation 상자 이미징 동안 동물의 움직임을 줄여 도와드립니다.
- 3-5 분의 Isoflurane 유도 챔버 (뚜껑을 열 포함) 내에 섹션 2.1 및 장소에 설명 된대로 luciferin의 IP와 쥐를 주사.
- 5 분 후, 유도 챔버의 뚜껑을 닫고 isoflurane의 흐름을 시작합니다. 마취가 약 2.0 L / 분에서 산소 유량 세트 약 3~5%에서 운영하고 있습니다. 일단 완전히 의식 추가 30 초를 기다린 XIC-3 절연 상자에 쥐를 전송합니다. 이 절차는 유도 챔버 (IVIS 단위가 자신의 수동 공정 용기 및 XIC-3 억제 상자가 직접에 / 소켓 아웃에 연결을 포함에서 isoflurane의 손실을 포함하므로 이용되는 바이오 안전성 캐비닛은 isoflurane의 소기의 안전을 위해 할 수 있는지 확인 ) 포함 마취 흐름을 보장 할 수 있습니다.
- 첨부 isoflurane 커넥터와 XIC-3 절연 상자에 칩 / 그룹 번호에 따라 쥐를 전송d는 엽니 다. 그들이 부드럽게 테이프 스트립에 쉬고있는 머리로 흉골 드러 누움에 배치되도록 마우스를 배치합니다.
- cavicide과 에탄올, 스프레이 손과 XIC-3 하단으로 XIC 봉쇄 상자를 닦아하고, IVIS 이미징 챔버에 전송할 수 있습니다. 한 번 이미징 유닛 내부의 밀폐 상자에 마취를 다시 연결하십시오.
- 후 luciferin의 주입에 따라 10 분, 생활 이미지 소프트웨어를 통해 이미지가 쥐를.
- 오픈 필터 초기 이미징 따라 순서 분석 및 발광 생물 반딧불의 루시 페라 제의 이미지 마법사 설정을 사용하여 DLIT 3 차원 영상을 시작합니다. 이 이미징 프로세스 4-5 분 소요됩니다하고 원하는 생쥐의 수에 대한 관련 뷰의 필드에서 완료해야합니다.
- 전 생체 분석은 뇌의 가능한 다음 검시 및 모음입니다. 멸균 페트리 접시에 뇌를 놓고 IMA에서 50-100 상단에 주식 luciferin의 μl, 그리고 장소를 똑상자를 ging.
- DLIT 영상이 완료되면 15-17 분 후 감염에 두 번째 오픈 필터 이미지를 완료. 서열 분석이 꺼져 확인 및보기 및 필터 설정의 필드가 이전 설정으로 돌아갑니다.
3. 반환 마우스 및 데이터 분석
- isoflurane vaporizer를 끄고 바이오 안전성 캐비닛으로 다시 XIC 봉쇄 상자를 전송할 수 있습니다.
- 자신의 주택 단위에서 다시 마우스를 놓고, 다시 주택 랙에 대해 적절한 살균제과 장소와 외관을 뿌려 상단을 닫습니다.
- 확인 마우스는 완전히 마취에서 회복했습니다.
- 이미징이 완료 될 때까지 실험에서 요구하는대로 위의 절차를 반복합니다.
- , BSC를 소독 장비를 종료하고, 추가 분석을 위해 외부 실험실 위치에 모든 데이터를 전송할 수 있습니다.
- 데이터를 분석하고 IVIS 결과 uti에 따라 3 차원 이미지를 생성LivingImage 소프트웨어를 lizing.
- 이미지가 제대로 지향하고 조명 / 색상 균형이 설정되어 있는지 확인합니다. 도구 팔레트 내 옵션은 이미지, 조정 정정, 이미지 정보, 투자 수익 (ROI) 도구 등이 있습니다.
- 위치에 따라 특정 신호 강도를 식별 할 투자 수익 (ROI) 모양을 사용합니다.
- , 마우스 몸을 강조하기 위해 표면 지형을 재구성 3D DLIT 재건를 초기화하고, 지형 재건에 장기 맵을 설정하는 선형 운동을 사용합니다.
- 또한 바이러스 적정 분석 혈액 및 장기의 컬렉션을 완료 할 수 있습니다. 본 연구에서는 적정은 수정 독수리 매체 (가상)에서 뇌 조직의 균질화를 통해 완성되었습니다. homogenate는 순차적으로 희석 우리는 1 시간에 Vero 세포의 6 잘 판을 감염되었습니다. 세포는 1.5 % agarose/2xMEM 오버레이로 덮여 있으며 37도에서 2 일 incubated되었습니다. 세포는 30 분에 포르말린 10 %로 고정되어 물들되었습니다크리스탈 바이올렛.
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Representative Results
바이러스 복제가 중앙 CNS (그림 1)에 코 지역에서 이동하는 유전자 변형 바이러스, TC83 - 루시 페라 제, 우리는 발광 생물 신호 강도의 증가를 보았다. 높은 바이러스 복제 속도로 인해, 우리는 벡터 및 벡터에 대한 동물 면역 반응에 의존 발광 생물 신호의 높은 수준 (그림 2A)를 참조 할 예정입니다. 우리는 CNS에서 바이러스 복제 피크 (그림 2B)와 함께, 일 5-7 후 감염 사이에,이 신호 증가 피크를 계속 할 예정입니다. 신호 및 바이러스 피크 따라, 우리는 바이러스 복제의 감소로 인해와 루시 페라 제 유전자의 손실로 인해 두 신호의 감소를 볼 것으로 기대합니다. 이러한 신호 값으로 우리는 정확하게 하나의 동물 specif에서 점진적으로 증가 바이러스 부하를 계산하기 위해 생체 방법에를 제공하는 신호의 강도에 따라 바이러스 부하를 정할 수있을 것으로 예상 TC83 - 루시 페라로 IC.
백신과 항 바이러스 치료를 분석하는 수단으로이 모델을 활용, 우리는 발광 생물 신호의 감소에 따라 효과 트리트먼트 사이의 차이를 감지 할 수 있도록 기대합니다. TC83 - 루시 페라 제에 대한 우리의 경우, 우리는 크게 연구를 통해 바이러스 감염과 발광 생물 신호 (그림 3)을 줄이기 위해, 감염 전에 IP Ampligen (수신자 같은 수용체 작용제 3) 또는 예방 접종 삼 주가 활용할 수 있습니다. 이 감소는 직접 CNS (데이터가 표시되지 않음) 내에서 바이러스 부하의 감소에 상관 할 수 있습니다. 완전히 기술을 개발하고 시각화 할 수있는 방법으로 IVIS 소프트웨어 LivingImage은 우리가 쉽게 조직 깊이와 구성에 따라 높은 바이러스 복제의 위치를 식별 할 수있는 발광 생물 신호 (그림 4)의 3 차원 이미지를 만드는 할 수 있습니다.
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1 그림. TC83 - 루시 페라 세 C57BL / 6 마우스의 IVIS 이미징은 비강 2시 TC83 - 루시 페라 제 및 이미징과 도전, 4, 6, 8 일 후 감염 (DPI)를 통해 감염되었다. 이미지가 autoexposure 길이와 오픈 필터 IP luciferin 주입에 따라 만든 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영상은 (A) 완료되기 전에 그림 2. 마우스의 두 변종은 10 분 포스트 분사의 지연 luciferin의 IP 주입에 따라 유사한 발광 생물 신호 강도를했다. 뇌에 바이러스 부하 (PFU / g 조직)는 biolumiescent 신호에 감염 내내 강한 상관 관계를 보여줍니다 (B).
그림 3. 치료 비교 IVIS를 활용. 치료 comarison는 C3H/HeN 마우스의 TC83-루시 페라 감염 다음. 마우스가 더 발광 생물 신호 (A)가 표시 TC83 - 루시 페라와 도전 23 일 이전에 피하 TC83와 함께 예방 접종을. -4 및 48 시간 게시물 감염에 IP Ampligen를받은 쥐 (B)은 더 치료 (C)를 수신하지 생쥐에 비해 감소 수준을 보여 주었다.
4 그림. 3 차원 재건 영상. 3 차원 재건을 활용하여 우리는 LivingImage의 DLIT 재건 도구를 활용 TC83 - 루시 페라 감염의 피크 위치를 시각화. 이 테를 활용 CNS 내에 깊이와 기본 신호의 위치를 현지화 할 수 있습니다chnique.
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Discussion
이 프로토콜은 생체 분석을위한 이미징 측면을 다루고 있지만, 향후 연구를위한 중요한 요소로 발광 생물 벡터를 인식하는 것이 중요합니다. 루시 페라 제 표현을위한 벡터로 TC83 우리의 활용, VEEV의 감쇠 백신 변형은 효소의 대량는 이전 1-4에 설명 된대로 CNS에서 바이러스의 높은 복제 속도로 인해 생산되고 있다는 보장합니다. 재조합 바이러스의 추가 감쇠에 두 번째 subgenomic 발기인 및 루시 페라 제 유전자 결과의 추가는 야생 타입 TC83에 비해 있지만,이 감쇠 감염 5 첫번째 6 일 이내에 질병의 임상 과정을 변경하지 않는 것 같습니다. 우리는 기대 시간이 지남에 따라 바이러스의 복제를 통해 루시 페라 제 유전자의 손실을 볼 수 있지만, 다시는 질병의 개발에까지 나중에 볼 수 없습니다. 바이러스와 박테리아 등 병원성 벡터,의 개발 가능성과 효율성을 확인병원체 연구 6-9의 여러 분야에 걸쳐 IVIS과 루시 페라 제의.
이미징 프로세스 자체는 전체 연구가 구현되기 전에 완료해야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 벡터의 발광 생물 강도의 초기 분석은 동물의 최소한의 그룹을 포함하는 파일럿 연구에서 완료해야합니다. 루시 페라 축적 생체의 예상 위치가 큰 연구를 시작하기 전에 결정해야 사전에 활용 벡터하지만 예상 신호 강도로 인해 알려져해야합니다. 새로운 소프트웨어와 함께 노출 길이 분석 이제 소프트웨어 만 luciferin의 주입에 따라 약간의 시간이 지연에 내장 된 자동 노출 감지 기능으로 인해 필요하지 여전히 결정해야합니다. 심지어 이러한 신호 계산의 모든과 함께 발광 생물 탐지는 여전히 벡터 깊이와 전체 동물의 안료와 모피로 인해 제한 될 수 있습니다. 우리는 강력하게 동물 befor의 면도를하는 것이 좋습니다전자 이미징은 가능한 가장 강한 신호를 얻기 위해 시작합니다.
도 벡터 감쇠 및 효소 생산을 위해 회계, 우리는 루시 페라 제는 다음 생체 분석을위한 표준 형광 분자 시스템을 생성 할 수 활용 정확하고 효율적으로 모델을 설계 한 것 같은데. Bioluminescence는 처음 신호의 손실의 결과로 조직을 통과해야합니다 시작 광원을 필요에 의해 제한되지 않습니다. 또한 자신의 털에, 심지어 자신의 다이어트에서 마우스로 볼 고 배경을 자동 형광 문제가되지 않습니다. luciferin 기판에서 독성의 위험이 쉽게 동물처럼 안전 발광 생물 만들기, 적절한 여과 및 용량을 통해 제어됩니다. 형광 및 발광 생물 시스템 모두 크게 인해 변화하는 정치적 자세 동물 연구와 지낼 수있는 더 준수에 대한 미래의 연구를 위해 중요합니다 생체 분석에 의한 동물의 사용을 줄일 수 있습니다동물 사용 10에 대한 전자의 3Rs (교체, 감소, 교양).
바이러스 성 pathogenesis 및 항 바이러스 효능 분석 우리의 응용 프로그램에 대해 생체 모델링에서 여러 가지 이유로 현재의 시스템 11,12보다 더 효율적이다. 우리는 임상 질병이 개발되기 전에 질병 개발, TC83의 경우 CNS의 공격 1에 대한 특정 주요 단계를 감지 할 수 있습니다. 초기 침공 감지에서, 우리는 반복적으로 단일 동물 바이러스의 확산 및 복제는 질병 진행 5 공부보다 정확한 수단을 제공 시각화 할 수 있습니다. 우리가 설계 한 모델도 희생과 장기 수집, 임상 질병이 동물의 과민성을 일으킬 수 전에 키 질병 진행 포인트를 감지 할 수있는 능력, 그리고 우리의 시스템에 특정의 감소 요구로 인해 연구자에 대한 안전, 우리는이 연구를 완료 할 수 있습니다 대신 ABSL3의 ABSL2의 감쇠 바이러스 벡터에선택 에이전트를 활용.
미래 질병 연구 점점 발광 생물 IVIS 모델링을 활용합니다. 현대 분자 생물학 기술과 복제의 발전은 바이러스와 박테리아 벡터 모두에 신속하고 저렴 루시 페라 제 유전자의 삽입을 할 수 있습니다. 발기인 의존 루시 페라 제 유전자를 표현하는 유전자 변형 쥐를 개발 할 수있는 능력도 발광 생물 연구의 또 다른 시스템을 제공합니다. 마지막으로, 이러한 캘리퍼스 RediJect 염증 프로브와 같은 새로 개발 된 발광 생물 프로브는 myeloperoxidase은 식세포 염증 반응의 생체 시각화에 대한 허용과 반응. 카메라와 소프트웨어의 증가 효율성과 결합이 새로운 기술은 발광 생물 IVIS 연구의 여러 분야에서 미래 연구를위한 가능한 시스템을합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에 대한 비디오 편집과 그녀의 도움 병진 과학 UTMB-NIH 보조금 1UL1RR029876-01과 Alisha 프레이 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
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