Summary
Mit Hilfe Luciferase und in vivo bildgebende Systeme (IVIS) als neuartiges Mittel gegen Krankheiten Endpunkte zu identifizieren, bevor klinische Entwicklungen auftreten. IVIS hat uns erlaubt, in Echtzeit visualisiert die Invasion der encephalitische Viren über mehrere Tage, eine genauere Krankheit Modell für zukünftige Studie. Es hat uns auch die Möglichkeit, die potenziellen Schutzfunktionen von Virostatika und Impfstoffen schneller als derzeit genutzt Tiermodellen zu identifizieren. Die Fähigkeit, einzelne Tiere über mehrere Zeitpunkte zu nutzen sorgt für reduzierte Tier, Kosten und allgemeine Morbidität der Tiere genutzt sorgt für eine menschlichere und wissenschaftlichen Mitteln der Krankheit Studie.
Abstract
Moderne Entwicklungen in der Imaging-Technologie zu fördern Weiterentwicklung und Verfeinerung in der Weise viralen Forschung durchgeführt. Zunächst von Russel und Burch in Humes 3R vorgeschlagen (Replacement, Reduction, Refinement), ist die Verwendung von Tiermodellen in der wissenschaftlichen Forschung unter dem ständigen Druck, neue Methoden zu identifizieren zu Tierversuchen zu reduzieren, während die Verbesserung der wissenschaftlichen Genauigkeit und Geschwindigkeit. Eine große Herausforderung für Humes Schulleiter ist jedoch, wie zu gewährleisten, die Studien sind statistisch genaue gleichzeitiger Reduzierung von Tierseuchen Morbidität und Gesamtzahlen. Die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien verlangen derzeit eine große Anzahl von Tieren, um als statistisch signifikant werden und oft in hohen Morbidität und Mortalität Endpunkte zur Identifizierung von Immunschutz führen. Wir verwendeten in-vivo Imaging Systems (IVIS) in Verbindung mit einem Glühwürmchen biolumineszenten Enzyms schrittweise verfolgt die Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) von einem ENCEphalitic Virus in einem Mausmodell. Typischerweise wird die Krankheit relativ langsam voranschreitet, jedoch Virusvermehrung erfolgt rasch, insbesondere innerhalb des ZNS, und kann zu einer oft letalen Ausgang führen. Nach intranasale Infektion der Mäuse mit TC83-Luc, ein attenuiertes modifiziertes venezolanischen Pferde-Enzephalitis-Virus-Stamm zu drückt ein Luciferase-Gen; können wir Virusreplikation innerhalb des Gehirns sichtbar mindestens drei Tage vor der Entwicklung klinischer Krankheitssymptome. Mit Hilfe CNS Invasion als Schlüssel encephalitische Krankheitsentwicklung Endpunkt sind wir in der Lage, schnell zu identifizieren therapeutische und Impfschutz gegen TC83-Luc Infektion bevor klinische Symptome entwickeln. Mit IVIS Technologie sind wir in der Lage, die schnelle und genaue Prüfung von Medikamenten Therapeutika und Impfstoffe zeigen, bei gleichzeitiger Reduzierung der Anzahl der Tiere und Morbidität.
Protocol
Ein. Tierische Vorbereitung
- Tierische Ankunft: Bei der Ankunft des Tieres Sicherheitsstufe 2 (ABSL2) Einrichtungen, damit sich die Tiere ein Minimum von 2 Tagen bis an ihre neue Umgebung zu gewöhnen. Nach dieser Ruhepause, überprüfen Sie die Tiere, um ihre Gesundheit und das allgemeine Aussehen bewerten.
- Bei Ausnutzung fluoreszierenden Reporter ist es wichtig, alle tierischen Probanden auf einer Luzerne freie Diät zu platzieren, um die Menge von GI Autofluoreszenz-und Hintergrund-Signal zu begrenzen.
- Shave Tiere: Um die Biolumineszenz-Signal von dem Oberkopf während der Bildgebung erkannt zu verbessern; rasieren die Köpfe aller Tiere. Betäuben die Tiere mit einem Gemisch aus Sauerstoffgas und verdampft Isofluran. Sobald die Tiere vollständig betäubt sind, verwenden elektrische Haarschneidemaschine den Kopf rasieren. Einmal mit Rasieren abgeschlossen, kehren die Tiere zu ihren Käfigen und beachten zur vollständigen Erholung von den Wirkungen der Anästhesie.
- Bio Medic DatenSysteme (BMDS) Transponder Insertion (zu Ort nach der Rasur der Mäuse zu nehmen, während die Tiere narkotisiert sind voll): Für eine weniger invasive Mittel zur Temperatur Implantat verfolgen eine vorprogrammierte BMDS drahtlosen Transponder subkutan in die dorsale Region von jeder Maus. Diese Transponder können zur drahtlosen Identifikation und Temperatur Aufnahme. Nach der Implantation des Transponders, gelten ein Veterinär-grade Gewebeklebstoffes auf die Wunde.
- Baseline-Kollektion: Vor der Infektion, notieren eine Grundlinie Temperatur und Gewicht für alle Tiere. Sammle Blut für Plaquereduktion Neutralisationstest (PRNT) Analyse durch retro-orbitale (RO) bluten, während die Mäuse unter Narkose sind. Nach der Blutentnahme, gelten Veterinär antibiotische Augensalbe mögliche sekundäre bakterielle Infektion zu verringern. Diese Basislinie Sammlung sollte unter Berücksichtigung der Anzahl von Malen die Tiere in Narkose durch Stress auf den Mäusen platziert abgeschlossen sein. Zukünftige RO Kollektionen should nach der Bebilderung abgeschlossen sein, während die Maus noch unter Betäubung. Die maximale Blut aus einer RO erhoben werden sollten rund 200 ul sein.
- Infektion: Place Mäusen unter Narkose wie zuvor beschrieben. Beimpfen durch den intranasalen Weg mit einer Dosis von 5x10 6 bis 5x10 7 pfu TC83-Luciferase in einem Gesamtvolumen von 40 ul von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch intranasale Infektion. Nach der Infektion, legen die Mäuse in ihren Gehäusekäfig und beobachten Erholung.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Halten Mäuse innerhalb ihrer Wohneinheit, die Biosicherheitswerkbank (BSC) oder die XIC Aufbewahrungsbox zu allen Zeiten. Die genehmigten BSCs für dieses Protokoll sind eine Klasse II Typ B1 oder B2.
- Injizieren alle Tiere mit 10 ul pro Gramm Körpergewicht intraperitoneale (IP) Luciferin in einer Konzentration von 15 mg / ml.
- Mäuse, die Ampligen sind injecte seind IP in einer Dosis von 12,5 mg / kg Körpergewicht bei -4 h nach Infektion oder 48 h nach Infektion auf ihren Gruppe.
- Vor der Injektion mit Luciferin, trennen Sie die Mäuse in Gruppen von drei bis eine gute Passform im XIC-3 Aufbewahrungsbox gewährleisten.
- Für alle Bildgebung verwenden okularen Salbe / Schmiermittel, das Trocknen der Hornhaut während des gesamten Verfahrens zu verhindern.
- Öffnen Sie die LivingImage Software und drücken Sie auf Initialisieren, um die Imaging-box vorzubereiten; set auto sparen, Belichtungszeit auto (Belichtungszeit auf auto ist ein neues Feature des LivingImage Software 3.2 und höher), sehen Feld C und Filter zu öffnen, Feld aus betrachtet sich auf die Anzahl von Mäusen Sie sind bildgebende basiert; und Filter optimiert wie für andere Imagingprojekte benötigt.
- Bestätigen Sie, dass die Luft Kohlefilter noch nicht abgelaufen sind, ist der Sauerstoff Tank voll, und die Isofluran Reservoir gefüllt ist. Legen Sie kleine Streifen Isolierband in der XIC-3 isolation Box, die hilft bei der Verringerung der Tier-Bewegung während der Bildgebung.
- Inject die Mäuse mit Luciferin IP wie in den Abschnitten 2.1 und innerhalb der Isofluran Ansaugkammer (mit geöffnetem Deckel) beschrieben für 3-5 min.
- Nach 5 min, schließen Sie den Deckel der Ansaugkammer und starten Sie den Fluss von Isofluran. Die Narkose wird auf etwa 3-5% mit dem Sauerstoff der eingestellten Förderleistung bei etwa 2,0 L / min betrieben. Einmal vollständig unbewussten warten weitere 30 sec und übertragen Sie die Maus auf den XIC-3 Isolation Box. Sicherstellen, dass die Biosicherheitswerkbank wird ausgenutzt ermöglicht den sicheren Abfangen von Isofluran da dieses Verfahren Verlust von Isofluran aus der Ansaugkammer (die IVIS Gerät enthält einen eigenen Passive Messe Kanister und die XIC-3 Aufbewahrungsbox direkt an den in / out Anschlüsse umfassen wird zu enthalten Anästhesie Durchfluss zu gewährleisten).
- Übertragen Sie die Maus auf Chip / group Zahl basiert in den XIC-3 Isolation Box mit der Isofluran-Anschluss befestigt eind öffnen. Positionieren Sie die Maus, so dass sie in Brustlage mit Köpfen sanft ruhen auf den Klebestreifen gelegt.
- Wischen Sie die XIC Aufbewahrungsbox mit Ethanol, Spray Hände und Unterseite des XIC-3 mit CaviCide, und Transfer zum IVIS Bildgebung Kammer. Schließen Sie die Anästhesie der Aufbewahrungsbox einmal in der Bildeinheit.
- Nach 10 min nach der Injektion von Luciferin, Bild die Mäuse durch die lebende Bildsoftware.
- Nach anfänglichen Bildgebung mit einem offenen Filter, initiieren DLIT 3-Dimensional Imaging mit der Sequenzanalyse und Image Wizard Setup für Biolumineszenz Glühwürmchenluciferase. Dieses Abbildungsverfahren dauert 4-5 Minuten und sollte bei einem Sichtfeld, die für die gewünschte Anzahl an Mäusen durchgeführt werden.
- Ex-vivo-Analyse möglich folgenden Sektion und Sammlung des Gehirns. Legen Sie das Gehirn auf eine sterile Petrischale, tropft 50-100 ul auf Lager Luciferin am Anfang, und innerhalb der imaGing Box.
- Finalize einen zweiten offenen Filter Bild bei 15-17 min nach der Infektion nach Abschluss der DLIT Bildgebung. Stellen Sie sicher, Sequenzanalyse ausgeschaltet ist und das Sichtfeld und Filter-Einstellungen werden auf die vorherigen Einstellungen zurück.
3. Zurück Mice and Data Analysis
- Schalten Sie das Isofluran Verdampfer und übertragen die XIC Aufbewahrungsbox zurück zum Biosicherheitswerkbank.
- Legen Sie die Maus zurück in ihre Wohneinheit, schließen Sie die obere, sprühen Sie das Gehäuse mit geeigneten Desinfektionsmittel und Ort wieder auf das Gehäuse Rack.
- Stellen Sie sicher, Mäusen vollständig aus der Narkose erholt.
- Wiederholen Sie den Vorgang, wie das Experiment benötigt, bis Bildgebung abgeschlossen ist.
- Desinfizieren Sie die BSC, fahren Sie das Gerät, und übertragen alle Daten auf einem externen Labor Standort für die weitere Analyse.
- Analysieren Sie die Daten und generieren 3-dimensionale Bilder auf IVIS Ergebnisse uti BasisLízing die LivingImage Software.
- Sicherstellen, dass das Bild korrekt ausgerichtet ist und Beleuchtung / Farbbalance eingestellt ist. Innerhalb der Werkzeug-Palette der Optionen gehören Bildeinstellung, Korrekturen, Bildinformationen und ROI Tools.
- Nutzen ROI Formen zu bestimmten Signalstärken nach Standort zu identifizieren.
- Rekonstruktion der Oberflächentopographie mit der Maus Körper markieren, initialisieren 3D DLIT Wiederaufbau, und verwenden lineare Anpassung an die Orgel Karte der topographischen Rekonstruktion gesetzt.
- Weitere virale Titration Analyse kann durch die Sammlung von Blut und Organen abgeschlossen sein. Titration in dieser Studie durch Homogenisierung von Gehirngewebe in modifiziertem Eagles Medium (MEM) fertig gestellt. Das Homogenat wurde seriell verdünnt und wir infiziert eine 6-Well-Platte von Vero-Zellen für 1 Stunde. Die Zellen wurden mit einer 1,5% agarose/2xMEM Overlay abgedeckt und für 2 Tage bei 37 Grad. Zellen wurden mit 10% Formalin für 30 Minuten fixiert und mitKristallviolett.
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Representative Results
Mit einem genetisch veränderten Virus, TC83-Luciferase, sahen wir einen Anstieg der Biolumineszenz Signalstärke als die Virusvermehrung bewegt sich von der nasalen Region in den zentralen CNS (Abbildung 1). Aufgrund der hohen Rate Virusreplikation erwarten wir hohe biolumineszenten Signals (2A) in Abhängigkeit von dem Vektor und dem Tier Immunreaktion auf den Vektor zu erkennen. Wir erwarten, dass diese Signalanhebung auf einen Spitzenwert weiterhin, zwischen den Tagen 5-7 nach der Infektion in Kombination mit Virusreplikation Peak im ZNS (2B). Nach dem Signal und viralen Peak erwarten wir eine Abnahme des Signals sowohl aufgrund einer Abnahme der viralen Replikation und auf einen Verlust des des Luciferasegens sehen. Mit diesen Signalwerten wir erwarten zu können Viruslast von der Stärke des Signals basierend quantifizieren, Bereitstellen eines in-vivo-Verfahren zur genauen Berechnung fortschreitend zunehmende Viruslast bei einem Tier spezif IC zu TC83-Luciferase.
Mit Hilfe dieses Modells als ein Mittel, um Impfstoffe und antivirale Behandlungen zu analysieren, erwarten wir in der Lage sein, einen Unterschied zwischen wirksame Behandlungen bei einer Verringerung Biolumineszenz-Signal zu detektieren. In unserem Fall gegen TC83-Luciferase, können wir IP Ampligen (a Toll-like Rezeptor 3-Agonist) oder Impfung 3 Wochen vor der Infektion zu nutzen, deutlich zu reduzieren Virusinfektion und Biolumineszenz-Signal während der gesamten Studie (Abbildung 3). Diese Abnahme kann direkt zu einer Verringerung der Viruslast im ZNS werden (Daten nicht gezeigt) korreliert. Als ein Weg zur vollen Entfaltung und visualisieren die Technologie ist IVIS Software LivingImage fähig, drei-dimensionale Bilder der biolumineszenten Signals (Abbildung 4), die uns einfach identifizieren Stellen hoher Virusreplikation bei Gewebetiefe und Zusammensetzung ermöglicht.
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Abbildung 1. IVIS Imaging von TC83-Luciferase Drei C57BL / 6 Mäuse wurden durch intranasale Herausforderung mit TC83-Luciferase und abgebildet in 2, 4, 6 und 8 Tage nach der Infektion (DPI) infiziert. Die Bilder wurden nach IP Luciferin Injektion mit einem Belichtungsautomatik Länge und offenen Filter. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Beide Stämme von Mäusen hatten ähnliche Biolumineszenz Signalstärke nach IP-Injektion von Luciferin mit einer Verzögerung von 10 Minuten nach der Injektion vor der Belichtung abgeschlossen wurde (A). Viruslast im Gehirn (pfu / g Gewebe) zeigt eine starke Korrelation in der Infektion auf das biolumiescent Signal (B).
Abbildung 3. Treatment Vergleich Mit Hilfe IVIS. Behandlung comarison nach TC83-Luciferase Infektion in C3H/HeN-Mäusen. Mäusen mit subkutanen TC83 23 Tage vor mit TC83-Luciferase ohne biolumineszenten Signals (A) präsentiert herauszufordern immunisiert. Mäuse, die IP Ampligen bei -4 und 48 h nach der Infektion (B) zeigten verringerte Werte im Vergleich zu Mäusen, die keine Behandlung (C).
Abbildung 4. 3-dimensionale Rekonstruktion Bildgebung. Unter Verwendung 3-dimensionale Rekonstruktion visualisierten wir den Gipfel Lage TC83-Luciferase Infektion Nutzung LivingImage die DLIT Rekonstruktion Werkzeug. Wir können lokalisieren die Tiefe und die Position der primären Signal innerhalb des ZNS Ausnutzung dieses technique.
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Discussion
Während dieses Protokoll umfasst die bildgebende Aspekte für die in vivo-Analyse ist es wichtig, um die biolumineszierende Vektor als ein Schlüsselfaktor für zukünftige Studien erkannt. Unsere Ausnutzung TC83, einem attenuierten Impfstamm von VEEV, als Vektor für die Expression von Luciferase gewährleistet, daß große Mengen des Enzyms produziert werden aufgrund der sehr Replikation des Virus im ZNS, wie zuvor 1-4 beschrieben. Während die Zugabe eines zweiten subgenomischen Promotor und den Luciferasegen ergeben sich weitere Dämpfung des rekombinanten Virus zu Wildtyp TC83 Vergleich geht diese Dämpfung anscheinend nicht den klinischen Verlauf der Krankheit innerhalb der ersten 6 Tagen der Infektion 5 zu verändern. Wir erwarten um einen Verlust des Luciferase-Gens durch Replikation des Virus finden im Laufe der Zeit aber auch dies wird erst später in der Entwicklung der Krankheit gesehen. Entwicklung anderer pathogener Vektoren, virale und bakterielle, bestätigt das Potenzial und Effizienzder IVIS und Luciferase über mehrere Felder des Erregers Forschungs 6-9.
Das bildgebende Verfahren selbst hat ein paar wichtige Schritte, die abgeschlossen werden, bevor eine vollständige Studie kann umgesetzt werden müssen. Eine erste Analyse der Biolumineszenz Stärke der Vektor sollte in einer Pilotstudie mit einer minimalen Gruppe von Tieren abgeschlossen werden. Die erwartete Lage in vivo von Luciferase Anreicherung sollte vorher aufgrund der Vektor verwendet, sondern die erwartete Signalstärke bekannt sein sollten, bevor sie eine große Studie ermittelt werden. Mit der neuen Software eine Exposition Länge Analyse ist nicht als notwendig, da die automatische Belichtung Funktion zur Erkennung nun in die Software, sondern eine Zeitverzögerung bei der Injektion von Luciferin Basis gebaut werden müssen noch bestimmt werden. Auch bei allen diesen Signals Berechnungen kann biolumineszierenden Detektion noch begrenzt aufgrund Vektor Tiefe und insgesamt tierischen Pigment und Pelze werden. Wir empfehlen dringend, die Schereinheit von Tieren vore Bildgebung beginnt um das stärkste Signal möglich zu gewinnen.
Selbst wenn man für Vektor-Dämpfung und Enzymproduktion, glauben wir, haben wir einen genaueren und effizienteren Modell nutzen Luciferase könnte dann mit einem Standard-fluoreszierendes Molekül für in vivo-Analyse erzeugt werden entwickelt. Biolumineszenz ist nicht durch eine Initiierung Lichtquelle, die anfänglich durch das Gewebe, was zu einem Verlust des Signals passieren muss begrenzt. Es hat auch nicht die hohen Hintergrund auto fluoreszierende Probleme mit Mäusen auf ihr Fell und sogar aus ihrer Ernährung zu sehen. Das Risiko der Toxizität aus der Luciferinsubstrat wird leicht durch Filtration und richtige Dosierung gesteuert, wodurch biolumineszierenden genauso sicher für das Tier. Beide Fluoreszenz-und Biolumineszenz-Systeme drastisch reduzieren können Tierversuchen durch In-vivo-Analyse, die wichtig sein werden für die zukünftige Forschung aufgrund der sich verändernden politischen Haltung gegenüber Tierversuchen und das weitere Festhalten an Hume der 3R (Replacement, Reduction, Refinement) zur Nutzung von Tieren 10.
Für unsere Anwendung der viralen Pathogenese und antivirale Wirksamkeit Analyse, in vivo-Modellierung ist effizienter als derzeitige Systeme 11,12 mehreren Gründen. Wir sind in der Lage, bestimmte wichtige Schritte für die Entwicklung der Krankheit, CNS Invasion 1 im Falle von TC83, zu erkennen, bevor eine klinische Krankheit entwickelt. Von der ersten Invasion Erkennung, sind wir in der Lage, immer wieder in einem einzigen Tier die Ausbreitung und Vermehrung des Virus eine genauere mittels Studium Krankheitsprogression 5 visualisieren. Das Modell haben wir entwickelt, ist auch sicherer für die Forscher aufgrund der verringerten Anforderungen des Opfers und Orgel Sammlung, die Fähigkeit, wichtige Krankheitsprogression Punkten zu erkennen, bevor klinische Erkrankung von Tieren Reizbarkeit führen kann, und speziell in unserem System können wir ergänzen diese Studien in einem abgeschwächten viralen Vektor in der ABSL2 anstelle des ABSL3Verwendung eines ausgewählten Mittels.
Zukünftige Krankheit Studien werden zunehmend ausschöpfen Biolumineszenz IVIS Modellierung. Fortschritte in der modernen Molekularbiologie und Klonen ermöglichen das Einsetzen eines Luciferasegens schnell und preiswert in die beiden virale und bakterielle Vektoren. Die Fähigkeit zur transgenen Mäusen, die einen Promotor abhängigen Luciferase-Gen entwickeln auch ein weiteres System zur Biolumineszenz Studie. Schließlich reagiert neu entwickelten Biolumineszenz Sonden wie Messschieber RediJect Entzündung Sonde mit Myeloperoxidase Berücksichtigung in vivo Visualisierung von Phagozyten Entzündungsreaktion. Diese neuen Technologien mit der Steigerung der Effizienz der Kameras und Software kombiniert macht Biolumineszenz IVIS ein brauchbares System für die zukünftige Forschung in vielen verschiedenen Bereichen der Studie.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Institute for Translational Sciences UTMB-NIH 1UL1RR029876-01 und Alisha Prather für ihre Unterstützung bei der Videobearbeitung für dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
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