在鼠标提睾肌为外周干细胞迁移分析的微循环活体显微镜

Summary

鼠标M.提睾肌微循环活体显微镜提供了一个独特和良好的标准化的体内模型外围骨髓干细胞迁移的分析。

Abstract

在在再生细胞疗法的背景下血管内细胞应用协议的时代，干细胞迁移的基本机制，以nonmarrow组织尚未完全阐明。我们在这里描述的活体显微镜应用到小鼠提睾肌微循环在体内外周骨髓干细胞迁移的分析技术。分枝睾的活体显微镜已经在发炎的研究直接观察白细胞相互作用与血管内皮的字段先前介绍。因为充足的外周干细胞和祖细胞的迁移，包括沿与牢固粘附在轧制内皮衬里可以想到应用分枝睾模型intravasculary施用干细胞与内皮细胞的相互作用的观测和量化的相似的初始步骤。作为各种化学组分可以选择性地施加到目标吨问题通过简单的灌流技术，它可以建立必要的微环境的先决条件，初始的干细胞募集到发生在骨髓外的活的有机体。

Introduction

本条款的目的是描述活体显微镜的应用对小鼠提睾肌微循环直接观察外周血骨髓干细胞迁移和分析技术（IVM）。

干细胞的当前概念的基础组织和器官再生涉及骨髓来源的干细胞的归巢向受损组织^1。对于成功的干细胞迁移的一个关键步骤包括干受伤器官其次是跨内皮迁移，最终器官移植²内与当地内皮细胞间的相互作用。这些干细胞的活体分析-内皮细胞相互作用形成了一个理想的参数用于在体内的病理生理不同设置的干细胞为基础的再生反应的定量。此外，似乎可以设想，即，在将来，特定的干细胞P上的迁移能力的活体分析在标准化的微循环环境opulations，可能会被应用之前推进这些人群进一步临床试验。

活体显微镜已初步开发了白细胞-内皮细胞相互作用在体内的观察和量化在炎症研究³的^视场。活体显微镜研究的第一个成功的录音报道了Cohnheim已经在19世纪，研究在光学显微镜下⁴青蛙的舌头和肠系膜。自从第一次使用IVM发生了翻天覆地的技术发展到今天的某些基本组件构成，以便进行定量IVM的先决条件：（一）组织筹备工作，允许光纤接入，（II），可以通过显微镜来检测分子探针，（三），连接到检测系统及（iv）基于计算机分析系统，可以从图像数据中提取感兴趣的参数的显微镜设置^4。

各种组织筹备工作已引入体外成熟的研究，包括肠系膜和小鼠和大鼠^5，6小鼠和仓鼠，兔子耳朵和地鼠颊囊，仅举几例背侧皮褶室的肝脏。

然而，在下文中，我们将重点放在鼠标提睾肌，表示用于观察活体的理想的组织，作为制备和可视化是可能的通过公标准化的外科手术过程，和在一般的运动伪影的问题没有发生。开提睾肌的准备进行了第一次在20世纪70年代由贝兹和他的同事^7。原本为大鼠描述，已经成功地采用了也鼠标^8。经过以前的研究主要集中在与血管壁白细胞的相互作用，我们自己的小组最近推出的鼠标提睾肌整理作为VALUABLE工具直接观察和定义的微环境⁹内干细胞与血管内皮细胞相互作用的定量分析。各种干细胞亚群进行了研究，利用该模型，包括鼠的c-kit ⁺骨髓干细胞和间充质干细胞，以及人类的CD133 ⁺骨髓干细胞^10-12。以下从供体骨髓和可视化的荧光标记细胞的分离，干细胞被选择性地施加到经股动脉，利用动脉注射提睾微循环，从而避免远端器官内的任何细胞截留。此外，由于各种趋化因子的相应设置内潜在介导局部干细胞的迁移，可局部施用于靶组织以简单灌流技术提睾肌模型是特别有用的。

Protocol

经过细胞分离整个协议大约需要2小时。

1。显微准备

1. 从供体骨髓和分离的亚群中的荧光标记，根据标准化的协议^9,12允许细胞时进行动物操作的休息时间进行干细胞分离。对于荧光标记，我们建议CFDA（二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）。
2. 麻醉雄性小鼠体重20-25克用氯胺酮（75毫克/千克）和赛拉嗪（2.5毫克/千克）。在整个手术过程中和实验方案，麻醉应由补充剂根据需要（通常每30-60分钟）保持（初始注入的10％，IP）。
3. 轻轻地刮右阴囊前壁方面以及右大腿和腹股沟。收集所有失去的头发用浸湿的棉签。将鼠标腹侧的有机玻璃观看舞台和固定费t使用弹性悬垂性。该阶段是定制的，包括一个底板和一个第二板的底板为两脚和阴囊抬高的尾缘。在舞台上放置一个加热垫，以保持体温在37°C。固定在舞台上后，将动物在手术显微镜下，用10执行下列操作步骤 - 到16倍的放大倍率。
4. 使用皮肤剪刀在右大腿，从膝盖股骨血管只是直到前向腹股沟进行初始切口。
5. 确定股动脉，并按照其近端，从周围的软组织动员动脉。识别和使用thermocautery切一个大的分支，以左侧睾丸。此后表面上放置一个留缝在左睾丸。温柔的牵引将有利于进一步调动近端股动脉。
6. 近端动员完成后，识别和切一个大的分支运行mediallŸ在大腿由thermocautery。此后结扎的股动脉在右大腿的远端部分。在结扎温柔的牵引力，将有助于进一步的准备。
7. 将注意力现在的股骨近端动脉再次并将动脉周围缝合的近端越好。准备一个结，但不打领带下来呢。适用温柔的牵引缝线，营造动脉扭结。
8. 建立扭结后，切开动脉小心使用microscissor。要特别小心，不要损坏股静脉。
9. 通过切口插入准备好的微导管（内径0.28毫米）。导管必须被强制脱气（0.9％氯化钠，NaCl）中，并连接到一个1ml注射器之前插入。
10. 导管插入成功后，小心地松开扭结，以利于导管的通道。动脉的血流量，应立即可见导管内。轻轻将导管几毫米用言语以前的扭结。此后，领带下来的导管固定的准备结扎。
11. 轻轻冲洗导管（0.9％NaCl）中并吸出，以确认正确的位置。用一块胶布，以进一步确保导管的操作阶段。
12. 经过充分固定，把导管留做以下准备步骤，提睾肌。为了防止血块形成适用定期冲洗和导管每隔5-10分钟的愿望。
13. 关闭关注，现在到右边阴囊和切割皮肤和筋膜以上的阴囊右侧的腹侧方面做一个切口。小心不要触摸下面的组织与任何仪器。
14. 延长切口至腹股沟折起和尾端到阴囊的前端。
15. 仔细分离底层软，结缔组织上面提睾麻袋，而不触及它。确定提睾肌的远端，并放置一个留缝线这里SLightly延长肌肉。轻轻拉动肌肉和尾端现在前方切除剩余的软组织下方的肌肉麻袋。
16. 从结缔组织完全分离后，打开提睾肌袋在一个点上用剪刀颅边缘。从该开口向下的肌肉的远端延伸的切口。
17. 密封小血管连接睾丸和副睾使用thermocautery，其后用剪刀剪断肌肉和睾丸之间的剩余连接。
18. 放下睾丸，出了显微镜领域。
19. 打开提睾现在在舞台上平放。将在组织的边缘的四个6-0普理灵缝线逗留并修复它们与弹性悬垂性，以分散提睾肌组织。从现在起，连续地润湿所述组织用磷酸盐缓冲盐水（PBS），使用1ml注射器（ 图1）。
20. 现在让准备休息15分钟。此后注入0.05-0.1毫升1％的若丹明-葡聚糖通过左侧股动脉的微血管的对比度增强。如果计划在应用程序的任何趋化因子或消炎药，你现在应该局部滋润肌用1毫升注射器各自的试剂。在对照实验的情况下，继续用PBS润燥。

2。活体显微镜

1. 保持鼠标固定在操作阶段和修改后用于落射照明，并连接到一个CCD（电荷耦合器件）摄像机，在荧光显微镜下移动。请特别注意不要打乱股动脉导管。
2. 使用水浸泡的目的进行实验。
3. 调整客观上为足够的提睾肌微循环的可视化和细胞注射前，后，随机确定6毛细血管静脉为公司干细胞的粘附，以后的分析。
4. 辖荧光标记的干细胞，溶解于200μlPBS中，在每次注射0.4×10 ⁶个细胞，总的利用股动脉导管5连续注射液和1ml注射器。细胞样品仔细撼动第一次注射之前。
5. 记录干细胞细胞注射后立即滚动，从而确定“滚动”作为电解槽的速度超过50％，沿血管内皮衬里与典型的蜂窝组合“大棒和释放”的动作。进行轧干细胞计数和所有的干细胞通过一个预定义的小静脉的距离在观察1分钟以下每单次注射。干细胞滚动的量表示为所有通过细胞的百分比。不要指望细胞表现出随机简短圈养现象滚动细胞。
6. 以下通过计算最后细胞注射决定牢牢附着的干细胞的数量和表达有关次方计算的内皮细胞表面的量Ë六个预定义的小静脉（直径×长×π）为贴壁细胞/毫米^2。牢固粘结被认为是在没有细胞的运动是可检测的，持续30秒。
7. 在活体显微镜完成后小心地取下提睾肌，并将其对应储存到以后的分析（免疫组化和分子生物学）。通过颈脱位牺牲动物。的活体显微镜录音为干细胞的滚动和坚定的内皮细胞的粘附，以及微血管血流动力学，如红细胞速度（mm /秒），血管长度（微米），血管直径（μm），墙分担率的定量分析（秒^-1）;应脱机蒙蔽利用图像处理软件各自的实验治疗组织的调查员进行。

Representative Results

一般情况下，直接的互动注射干细胞或祖细胞内提睾肌微循环血管内皮是一个罕见的事件，并专门在毛细血管静脉（直径30-80微米）时发生。由于荧光标记的滚动和牢固附着的干细胞可以清楚地量化，在从循环内源性白细胞中所观察到的微静脉（ 图2）的分离。

由血流速度和壁剪切速率表示的微循环条件下通常不显著各实验组之间具有不同的趋化因子治疗（ 表1）不同。

的提睾肌组织与炎症反应的不同的趋化因子或介质的局部治疗， 如 SDF-1α（基质细胞衍生因子-1α）或TNF-α（肿瘤坏死因子-α）是能够以模仿特定英里croenvironmental条件。这样的条件下提高干细胞-内皮细胞相互作用在不同的量，这取决于特定的趋化因子/介体施加和干细胞群注入（ 图^3）12。清楚地量化的干细胞-内皮细胞相互作用的这些不同模式的可能性之前前进这些人群进一步临床试验能够用于体内定义的微环境中的特定的干细胞群的迁移潜力的评估。

此外，影响内皮功能，诸如一氧化氮缺乏某些病理生理条件的影响，已经显示出通过使用基因敲除动物^9。

图1。说明在小鼠提睾肌亩的关键显微步骤（AF）随后的活体显微镜CLE准备。

图2的c-kit ⁺细胞在小鼠提睾肌的准备活体显微镜。血管内的背景是由罗丹明 - 葡聚糖提供。 （AF）的一系列连续的六幅图像与轧制（黑色箭头）和附着牢固（白色箭头）羧基荧光素D-乙succinimidylester标记的c-kit ⁺细胞在小静脉血管。 实验室投资 ，2008，88。卡明斯基，答，麻，N.，Donndorf，P. 等 。

图3。基于活体荧光显微图像的c-kit ⁺细胞和内皮细胞之间的相互作用的定量分析。 >（a）一小静脉内皮细胞（表达于所有通过的细胞的百分比）在暴露于SDF-1α，TNF-α或其组合的小鼠提睾肌滚动的c-kit ⁺细胞的数目两者相比的c-kit ⁺细胞注射无趋化因子预处理（对照组）。治疗与SDF-1α单独和SDF-1α+ TNF-α的结合增加了滚动的c-kit ⁺细胞的百分比。 （二）牢固地粘附的c-kit ⁺细胞每毫米小静脉内皮衬里²的数量仅与SDF-1α+ TNF-α的结合处理后的显著增加。数据为平均值±标准差表示（* P <0.05 vs对照组）。 实验室投资 ，2008年，第88卷。卡明斯基，答，麻，N.，Donndorf，P. 等 。

鼠标类型	实验组	红细胞流速（毫米/秒）	壁面剪切速率（秒-1）
野生型	控制	0.7±0.2	43±32
野生型	SDF-1α	0.5±0.2	51±31
野生型	肿瘤坏死因子	0.4±0.2	45±24
野生型	SDF-1α+ TNF-α	1.0±0.5	117±26

表1。红血细胞的速度和壁面剪切率的小鼠提睾肌的肌肉在基线静脉 。在野生型小鼠的肌肉制剂使用CapImage软件（Zeintl，Heidelberg，德国）与SDF-1α，TNF-α处理后进行分析。数据表示为中未发现各组之间的平均值±标准差差异是显著。 等 。

Discussion

活体荧光显微镜可以直接可视化和干细胞与血管内皮细胞相互作用的定量分析。提睾肌模型是非常有用的，因为显微曝光和技术活体可视化已经确立的白细胞 - 内皮细胞相互作用和各种化学组分的研究过程中可以选择性地施加到目标组织通过简单灌流技术。由于没有运动伪影和严重的图像噪声，这种特殊的模式，相较于其他的活体，镜设置，提供了用于细胞 - 细胞相互作用的可视化的最佳条件。

该模型允许揭示微环境必不可少的先决条件，初始的干细胞募集到发生在活的有机体。如果需要，内源性白细胞可作为阳性对照进行验证，并证明了干细胞行为的原则。

“>代表一种急性动物模型，并利用直接动脉注射代替静脉应用，jove_content慢性细胞迁移模型和/或全身的细胞传递的潜在限制-可避免在其他- 如细胞损失，由于远程器官内滞留。另一方面，急性手术组织创伤可能诱发一定程度的组织活化本身，因此，无创手术准备是强制性的，稳定的微循环的条件下提睾肌制备需要在一个可再现的方式事先起点与实验组实现。

的毛细血管静脉和显著泄漏的荧光染料，以在活体显微镜记录在对照组动物的开始对周围组织的范围内广泛的白细胞积累的存在表明主要的外科组织创伤。

然而，应用细致的准备相甚至当从不同的研究者得出定量技术，结果不一定完全由于稍微不同的基线组织活化相媲美。这就是为什么后续实验应该由同一研究者尽可能进行。

设计的最初步骤干细胞招募到靶组织进行分析和量化，目前的模型不允许在明确的干细胞器官移植报表。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500