Summary
Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.
Abstract
En la era de los protocolos de aplicación de células intravasculares en el contexto de la terapia celular regenerativa, los mecanismos subyacentes de la migración de células madre de tejido nonmarrow no han sido completamente aclarados. Se describe aquí la técnica de microscopía intravital aplicado a la microcirculación cremáster ratón para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre in vivo. Microscopía intravital de la M. cremáster se ha introducido previamente en el campo de la investigación inflamatoria para la observación directa de la interacción de leucocitos con el endotelio vascular. Desde madre periféricas suficiente y la migración de células progenitoras incluye los pasos iniciales similares de rodar a lo largo de y la adhesión firme en el revestimiento endotelial es concebible aplicar el modelo M. cremáster para la observación y cuantificación de la interacción de las células madre administrados intravasculary con el endotelio. Como diversos componentes químicos pueden ser aplicados selectivamente a la diana Tproblema mediante técnicas de superfusión simples, es posible establecer condiciones previas esenciales microambientales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo que vive fuera de la médula ósea.
Introduction
El propósito del presente artículo es describir la técnica de microscopía intravital (IVM) aplicado sobre la microcirculación cremáster ratón para la observación directa y el análisis de médula ósea periférica migración de células madre.
La regeneración de tejidos y de órganos El concepto actual de células madre basado implica el homing de las células madre derivadas de la médula ósea al tejido lesionado 1. Un paso crucial para el éxito de la migración de células madre incluye la interacción de células madre con el endotelio local dentro del órgano lesionado, seguido de la migración transendotelial y, finalmente, el injerto de órganos 2. Análisis intravital de estas células madre - interacciones de células endoteliales se forma un parámetro ideal para la cuantificación de una respuesta regenerativa de células madre basada en diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Además, parece concebible, que, en el futuro, el análisis intravital de la capacidad migratoria de p específico de células madreopulations dentro de los entornos de la microcirculación estandarizadas, podrían aplicarse antes de avanzar en estas poblaciones de más pruebas clínicas.
Microscopía intravital se ha desarrollado inicialmente para la observación y cuantificación de la interacción célula-endotelial de leucocitos in vivo en el campo de la investigación inflamatoria 3. Primeras grabaciones exitosas de estudios de microscopía intravital fueron reportados por Cohnheim ya en el siglo 19, el estudio de las lenguas y entresijos de rana con un microscopio de luz 4. Desde su primer uso IVM ha experimentado un enorme desarrollo técnico y en la actualidad ciertos componentes esenciales formen requisitos previos para llevar a cabo IVM cuantitativa: (i) preparaciones de tejidos que permiten el acceso óptico, (ii) sondas moleculares que pueden ser detectadas por un microscopio, (iii ) un microscopio conectado a un sistema de detección y (iv) los sistemas de análisis basados en ordenador que puede extraer parámetros de interés a partir de los datos de imagenestablecer 4.
Una variedad de preparaciones de tejidos se ha introducido para los estudios de MIV incluyendo los entresijos y el hígado del ratón y de rata 5, las cámaras de los pliegues cutáneos dorsal de ratón 6 y el hámster, la oreja del conejo y de la bolsa de la mejilla del hámster por nombrar algunos.
Sin embargo, en lo que sigue nos centraremos en el músculo cremáster ratón, lo que representa un tejido ideal para las observaciones intravitales, como la preparación y la visualización son posibles mediante un procedimiento quirúrgico bien estandarizados, y en general no se producen problemas de artefactos de movimiento. La preparación del músculo cremáster abierto se llevó a cabo por primera vez en la década de 1970 por Báez y sus colegas 7. Originalmente descrito para ratas, se ha adoptado con éxito también para el ratón 8. Después de los estudios anteriores se habían centrado principalmente en la interacción de leucocitos con la pared del vaso, nuestro grupo ha presentado recientemente la preparación Cremáster ratón como valoraciónble herramienta para la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio dentro de un microambiente definido 9. Varios subpoblaciones de células madre se han estudiado utilizando este modelo, incluyendo las células madre mesenquimales de c-kit murino + de células madre de médula ósea y, así como de CD humano células madre de la médula ósea 133 + 10-12. Tras el aislamiento de células de donante de médula ósea y etiquetado fluorescente para la visualización, las células madre se aplican selectivamente en la microcirculación cremáster la utilización de una inyección arterial a través de la arteria femoral, evitando de este modo cualquier atrapamiento de células dentro de los órganos remotos. Además, el modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que diversas quimiocinas potencialmente que median la migración de células madre local dentro de los ajustes respectivos, se pueden aplicar tópicamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla.
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Protocol
Todo el protocolo después de aislamiento de células tarda aproximadamente 2 horas.
1. Preparación microquirúrgica
- Realizar el aislamiento de células madre de la médula ósea del donante y etiquetado fluorescente de la subpoblación aislada de acuerdo con protocolos 9,12 permitir que las células descansan durante el tiempo que se realiza la operación de los animales estandarizados. Para el marcaje fluorescente recomendamos CFDA (succinimidiléster diacetato de carboxifluoresceína).
- Anestesiar a un ratón macho 20-25 g de peso con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (2.5 mg / kg). A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia debe ser mantenida por los suplementos (10% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (por lo general cada 30 a 60 min).
- Afeitarse suavemente la cara anterior del escroto derecho, así como el muslo derecho y la ingle. Recoge todos pierden el cabello con un bastoncillo de algodón humedecido. Coloque el lado ventral del ratón hacia arriba en un escenario de visualización de plexiglás y fijar la cuotat usando cortina elástica. Está hecho a medida La etapa, que consiste en una placa base y una segunda placa en el borde caudal de la placa base para la elevación de las dos piernas y el escroto. Coloque el escenario en una almohadilla térmica para mantener la temperatura del cuerpo a 37 ° C. Después de la fijación en el escenario, colocar al animal en un microscopio de funcionamiento y realice los siguientes pasos de la operación usando 10 - a la ampliación de 16 veces.
- Hacer la incisión inicial con unas tijeras de la piel en el muslo derecho, justo por delante de los vasos femorales de la rodilla hasta la ingle.
- Identificar la arteria femoral y seguirla en dirección proximal, la movilización de la arteria de los tejidos blandos circundantes. Identificar y cortar una rama grande al testículo izquierdo con termocauterio. A partir de entonces colocar una sutura estancia superficialmente en el testículo izquierdo. Tracción suave facilitará aún más la movilización proximal de la arteria femoral.
- Después de la terminación de la movilización proximal, identificar y cortar una rama grande corriendo medially en el muslo por termocauterio. A partir de entonces ligar la arteria femoral en la parte distal del muslo derecho. Tracción suave sobre la ligadura ayudará más preparación.
- Girar la atención ahora a la arteria femoral proximal de nuevo y colocar una sutura alrededor de la arteria como proximalmente como sea posible. Preparar un nudo, pero no lo ate abajo todavía. Aplicar una suave tracción a la sutura y crear un retorcimiento arterial.
- Después de establecer el retorcimiento, haga una incisión de la arteria está utilizando cuidadosamente un microscissor. Tenga especial cuidado de no dañar la vena femoral.
- Insertar un microcatéter preparado (diámetro interior 0,28 mm) a través de la incisión. El catéter debe ser desaireado (cloruro de sodio 0,9%, NaCl) y conectado a una inserción antes de jeringa de 1 ml.
- Después de la inserción exitosa del catéter, aflojar cuidadosamente el acodamiento con el fin de facilitar el paso del catéter. El flujo de sangre arterial debe ser inmediatamente visible dentro del catéter. Avanzar suavemente el catéter de pocos milímetross más allá del retorcimiento anterior. A partir de entonces, la corbata por la ligadura preparado para la fijación del catéter.
- Enjuague suavemente el catéter (0,9% NaCl) y aspirar para confirmar la posición correcta. Utilice un trozo de cinta adhesiva para asegurar aún más el catéter para la etapa de operación.
- Después de la fijación adecuada, coloque el catéter a un lado para los siguientes pasos de preparación del músculo cremáster. Aplicar el lavado regular y aspiración del catéter cada 5-10 minutos con el fin de prevenir la formación de coágulos.
- Gire ahora la atención en el escroto derecho y hacer una incisión cortando la piel y la fascia por encima de la cara ventral del escroto derecho. Tenga cuidado de no tocar el tejido subyacente con ningún instrumento.
- Extender la incisión hasta el pliegue inguinal y caudalmente hasta el extremo distal del escroto.
- Tejido cuidadosamente separada subyacente suave y conectivo encima del saco cremáster, sin tocarlo. Identifique el extremo distal del cremáster, y colocar una sutura estancia aquí para slightly extender el músculo. Resecar ahora el tejido blando restante debajo del saco muscular tirando suavemente el músculo caudal y anterior.
- Después de la separación completa a partir de tejido conectivo, abrir el saco cremáster en un punto en el borde craneal con unas tijeras. Extender la incisión de esta abertura hacia abajo hasta el extremo distal del músculo.
- Selle la pequeña embarcación que conecta el testículo y el cremáster usando termocauterio, después cortar los contactos que persisten entre el músculo y el testículo con unas tijeras.
- Deja a un lado del testículo, fuera del campo de la microscopía.
- El cremáster abierto ahora está plano en el escenario. Coloque cuatro puntos de Prolene 6-0 estancia en los bordes de los tejidos y fijarlas con cortina elástica con el fin de extender el tejido del músculo cremáster. A partir de ahora humedecer continuamente el tejido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa de 1 ml (Figura 1).
- Autorizar ahora la preparación reposar 15 min. A partir de entonces inyectar0,05-0,1 ml de 1% de rodamina-dextrano a través de la arteria femoral izquierda para la mejora de contraste de la microvasculatura. Si se planifican las quimiocinas o agentes inflamatorios para su aplicación, ahora debería humedecer tópicamente el músculo con el respectivo reactivo usando una jeringa de 1 ml. En el caso de un experimento de control, continuar humedeciendo con PBS.
2. Microscopia intravital
- Mantenga el ratón fijada en la etapa de operación y moverse bajo un microscopio de fluorescencia modificado para epi-iluminación y conectado a un CCD (dispositivo de carga acoplada) de la cámara de vídeo. Tenga especial cuidado de no dislocar el catéter en la arteria femoral.
- Llevar a cabo experimentos utilizando un objetivo de inmersión en agua.
- Después de ajustar el objetivo para la visualización suficiente de la microcirculación cremáster y antes de la inyección de células, definir estocásticamente seis vénulas post-capilares para su posterior análisis de la firma de la adhesión de células madre.
- Administrar las células madre fluorescentes que llevan la etiqueta,disuelto en 200 l de PBS, a 0,4 x 10 6 células por inyección, con un total de cinco inyecciones consecutivas utilizando el catéter en la arteria femoral y una jeringa de 1 ml. Sacudir cuidadosamente la muestra de células antes de la primera inyección.
- Células madre disco de los Rolling inmediatamente después de la inyección de células, definiendo de este modo "rodar" como una reducción de más del 50% de la velocidad de la célula a lo largo del revestimiento endotelial en combinación con típico celular "palo y liberar" movimientos. Lleve a cabo el recuento de las células madre de rodadura y todas las células madres que pasan una distancia predefinida venular durante 1 min de la observación después de cada inyección única. La cantidad de laminación de células madre se expresa como porcentaje de todas las células que pasan. No contar las células que exhiben fenómenos inmovilización breves aleatorios como células de rodadura.
- Después de la última inyección de células determinar el número de células madre firmemente adherentes contando y expresar la cantidad en relación a la superficie endotelial calculado de the seis vénulas predefinidos (diámetro x largo x π) como células adherentes / mm 2. Adherencia firme se considera cuando hay movimiento celular es detectable durante 30 segundos.
- Después de la terminación de la microscopía intravital retirar con cuidado el músculo cremáster y almacenarlo en correspondencia con el análisis posterior (inmunohistoquímica o biología molecular). Sacrificio del animal por dislocación cervical. El análisis de las grabaciones de microscopía intravital para la cuantificación de la laminación de células madre y firme adhesión endotelial, así como la hemodinámica microvasculares, tales como la velocidad de la sangre de glóbulos rojos (mm / s), la eslora del buque (m), el diámetro del vaso (m), tasa de cuota de pared (s-1); se debe realizar fuera de línea por un investigador ciego para el tratamiento respectivo tejido experimental que utiliza un software de procesamiento de imágenes.
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Representative Results
En general, la interacción de directamente inyectado células madre o progenitoras con el endotelio vascular dentro de la microcirculación músculo cremáster es un evento raro y se produce exclusivamente en las vénulas postcapilares (diámetro: 30-80 micras). Debido a la fluorescencia de etiquetado de rodadura y las células madre firmemente adherentes pueden ser claramente cuantificados en la separación de leucocitos circulantes endógenas en las vénulas observadas (Figura 2).
Las condiciones de la microcirculación representados por la velocidad del flujo sanguíneo y la tasa de cizallamiento por lo general no difieren significativamente entre los respectivos grupos experimentales con el tratamiento de quimioquinas diferentes (Tabla 1).
El tratamiento local del tejido del músculo cremáster con diferentes quimiocinas o mediadores de la respuesta inflamatoria, por ejemplo, SDF-1α (células estromales derivadas del factor 1 alfa) o TNF-α (factor de necrosis tumoral-alfa) es capaz de imitar específica millascondiciones croenvironmental. Estas condiciones aumentan madre-células endoteliales interacciones celulares en una cantidad diferente, dependiendo de la quimiocina / mediador específico aplicados y la población de células madre inyectadas (Figura 3) 12. La posibilidad de cuantificar claramente estos patrones diferentes de interacciones de las células madre-células endoteliales permite para la evaluación del potencial migratorio de las poblaciones de células madre específicas dentro de microambientes definidos en vivo antes de avanzar en estas poblaciones de efectuar nuevas pruebas clínicas.
Además, el impacto de ciertas condiciones fisiopatológicos que afectan la función endotelial, tales como la deficiencia de óxido nítrico, se ha demostrado por el uso de animales knockout 9.
Figura 1. Ilustración de los pasos clave de microcirugía (AF) en el ratón cremaster muspreparación culo para microscopía intravital posterior.
Figura 2. Microscopia intravital de c-kit + en las células de una preparación Cremáster murino. Fondo intravascular es proporcionado por rodamina-dextrano. (Af) Una serie de seis imágenes consecutivas con laminado (flechas negras) y firmemente adherentes (flecha blanca) c-kit + células succinimidylester marcado-d-acetato carboxi fluoresceína en el sistema vascular venular. Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.
Figura 3. El análisis cuantitativo de las interacciones entre las células endoteliales c-kit + celular y basados en fluorescencia imágenes microscópicas intravitales. (a) El número de células c-kit + rodando sobre el endotelio venular (expresado en porcentaje de todas las células que pasan) en músculos cremáster murinos expuestos a SDF-1α, TNF-α o una combinación de ambos en comparación con c-kit + la inyección de células sin tratamiento previo de quimioquinas (de control). El tratamiento con SDF-1α solo y la combinación de SDF-1α + TNF-α Aumento del porcentaje de células rodantes c-kit +. (B) El número de c-kit + células firmemente adherentes por mm 2 de revestimiento endotelial venular se incrementa de manera significativa sólo después del tratamiento con la combinación de SDF-1α + TNF-α. Los datos se expresan como media ± SEM (* P <0.05 vs control). Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.
| Un tipo de ratón | Grupo Experimental | velocidad de los glóbulos rojos(Mm / seg) | tasa de cizallamiento (s -1) |
| Tipo salvaje | Control | 0,7 ± 0,2 | 43 ± 32 |
| Tipo salvaje | SDF-1α | 0,5 ± 0,2 | 51 ± 31 |
| Tipo salvaje | TNF | 0,4 ± 0,2 | 45 ± 24 |
| Tipo salvaje | SDF-1 α + TNF α | 1,0 ± 0,5 | 117 ± 26 |
Tabla 1. Velocidades de los glóbulos sanguíneos y tasas de corte de la pared en vénulas de músculos cremáster murinos al inicio del estudio Roja. El análisis se realizó utilizando CapImage Software (Zeintl, Heidelberg, Alemania) en preparaciones de músculo de los ratones de tipo salvaje después del tratamiento con SDF-1α, TNF-α. Los datos se expresan como no se encontraron diferencias de medias ± sd entre los grupos individuales de ser significativo.
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Discussion
Microscopía de fluorescencia intravital permite la visualización directa y el análisis cuantitativo de la madre de las interacciones célula-endotelio. El modelo de músculo cremáster es particularmente útil, ya que la exposición de microcirugía y técnicas de visualización intravital han sido bien establecido durante la investigación sobre las interacciones entre leucocitos y endotelio diversos componentes químicos se puede aplicar selectivamente al tejido diana mediante la técnica de superfusión sencilla. Debido a la ausencia de artefactos de movimiento y ruido de la imagen severa, este modelo en particular, en comparación con otras configuraciones de microscopía intravital-, proporciona condiciones óptimas para la visualización de las interacciones célula-célula.
El modelo permite revelar condiciones microambientales esenciales, para el reclutamiento de células madre inicial que tendrá lugar en un organismo vivo. Si es necesario, leucocitos endógenos pueden servir como controles positivos para la validación y demostrar de principio de comportamiento de células madre.
jove_content "> En representación de un modelo animal aguda y la utilización de la inyección arterial directa en lugar de la aplicación venosa, las posibles limitaciones de los modelos de migración celular crónicas y / o suministro de células sistémica - por ejemplo, la pérdida de células debido a atrapamiento dentro de órganos a distancia - se puede evitar por otro. parte, un traumatismo agudo tejido quirúrgico tiene probabilidades de inducir un cierto grado de activación del tejido en sí. Por lo tanto, una preparación quirúrgica atraumática es obligatorio y condiciones estables de la microcirculación tras necesita preparación Cremáster ser alcanzado de manera inicial antes reproducible con grupos experimentales.La presencia de extensa acumulación de leucocitos en las vénulas post-capilares y fuga significativa del colorante fluorescente al tejido circundante en el comienzo de las grabaciones de microscopía intravital en los animales de control indican importante trauma del tejido quirúrgico.
Sin embargo, incluso cuando la aplicación de preparación meticulosatécnicas de racionamiento, los resultados derivados de los diferentes investigadores no necesariamente son totalmente comparables debido a las diferencias ligeramente la activación del tejido de base. Es por esto que los experimentos posteriores deben ser realizadas por el mismo investigador siempre que sea posible.
Diseñado para el análisis y la cuantificación de los pasos iniciales de reclutamiento de células madre a los tejidos diana, el modelo actual no permite declaraciones en definitiva de células madre órgano-injerto.
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Disclosures
Todos los experimentos con animales, llevados a cabo por este manuscrito han sido aprobados por el comité local de cuidado y uso de animales.
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 | |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 | |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available | |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available | |
| Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home? Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
