Microscopia intravital da Microcirculação no músculo Rato Cremaster de Análise de Migração Stem Peripheral celular

Summary

Microscopia intravital do cremaster microcirculação rato M. oferece um único e bem padronizados modelo in vivo para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas.

Abstract

Na era de protocolos de aplicação intravascular de células no contexto da terapia celular regenerativa, os mecanismos subjacentes à migração de células-tronco para nonmarrow tecido não foram completamente esclarecidas. Descrevemos aqui a técnica de microscopia intravital aplicada a microcirculação cremaster rato para a análise de medula óssea a migração de células estaminais periféricas in vivo. Microscopia intravital do cremaster M. tenha sido previamente introduzido no campo da pesquisa inflamatória por observação directa de interacção de leucócitos com o endotélio vascular. Desde tronco periférica suficiente e migração de células progenitoras inclui passos iniciais semelhantes de rolando e adesão firme ao endotélio forro é concebível aplicar o modelo cremaster M. para a observação e quantificação da interação de células-tronco administrados intravasculary com o endotélio. Como vários componentes químicos pode ser aplicada selectivamente ao alvo tquestão por meio de técnicas de superfusão simples, é possível estabelecer um requisito essencial do microambiente, para o recrutamento de células-tronco inicial para ocorrer em um organismo vivo fora da medula óssea.

Introduction

O objetivo do presente artigo é descrever a técnica de microscopia intravital (IVM), aplicada sobre a microcirculação cremaster rato para observação direta e análise de medula óssea migração de células-tronco periférica.

Regeneração de tecidos e órgãos O conceito atual de células-tronco com base envolve o homing de medula óssea células-tronco derivadas do tecido lesado ^1. Um passo crucial para a migração de células-tronco de sucesso inclui tronco interação célula com o endotélio local dentro do órgão lesionado seguido de migração transendotelial e, eventualmente, o enxerto de órgãos ^2. Análise intravital destas células-tronco - as interações de células endoteliais formam um parâmetro ideal para a quantificação de uma resposta regenerativa com células-tronco com base em diferentes contextos fisiopatológicos in vivo. Além disso, parece concebível, que, no futuro, a análise intravital da capacidade migratória das células estaminais p específicoopulations dentro de ambientes microcirculação padronizadas, pode ser aplicado antes avanço dessas populações para mais testes clínicos.

Microscopia intravital foi inicialmente desenvolvido para a observação e quantificação da interacção das células de leucócitos-células endoteliais in vivo, no campo da pesquisa inflamatória ^3. As primeiras gravações de sucesso de estudos de microscopia intravital foram relatados por Cohnheim já no século 19, estudando línguas e mesentério de rã sob um microscópio de luz ^4. Desde a sua primeira utilização IVM sofreu um desenvolvimento técnico enorme e hoje certos componentes essenciais formar os pré-requisitos para a realização de MIV quantitativa: (i) as preparações de tecidos que permitam o acesso óptico, (ii) as sondas moleculares que podem ser detectados por um microscópio, (iii ) um microscópio ligado a um sistema de detecção e (iv) a partir de sistemas de análise de computador que é capaz de extrair os parâmetros de interesse a partir dos dados de imagemset ^4.

Uma grande variedade de preparações de tecido tenha sido introduzida para estudos IVM incluindo os mesentério e no fígado do rato e na ratazana ^5, as câmaras de dobras cutâneas dorsal de rato e hamster ^6, a orelha de coelho e a bolsa jugal do hamster, para citar alguns.

No entanto, a seguir vamos nos concentrar no músculo cremaster mouse, o que representa um tecido ideal para observações intravital, como são possíveis preparação e visualização por um procedimento cirúrgico bem padronizado, e em geral não ocorrem problemas de artefatos de movimento. A preparação do músculo cremaster aberto foi realizada pela primeira vez em 1970 por Baez e colegas ^7. Originalmente descrito para ratos, tem sido adotado com sucesso também para o mouse ^8. Após estudos anteriores haviam se concentrado principalmente nas interações leucócitos com a parede do vaso, o nosso próprio grupo introduziu recentemente a preparação do músculo cremaster mouse como um valuable ferramenta para a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio dentro de um microambiente definida ^9. Vários subpopulações de células estaminais têm sido estudada utilizando este modelo, incluindo murino células estaminais da medula óssea 133 ⁺ c-kit ⁺ de medula óssea em células estaminais e células estaminais mesenquimais, assim como humana CD ^10-12. A seguir ao isolamento de células de medula óssea do dador e marcação fluorescente para visualização, as células estaminais são aplicadas selectivamente na microcirculação cremaster utilizando uma injecção arterial através da artéria femoral, evitando-se assim qualquer aprisionamento de células dentro de órgãos remotos. Além disso, o modelo do músculo cremaster é particularmente útil uma vez que várias quimiocinas potencialmente medeiam a migração de células estaminais local dentro das respectivas configurações, pode ser topicamente aplicada ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão.

Protocol

O protocolo de todo após o isolamento das células leva cerca de 2 horas.

1. Microsurgical Preparação

1. Realizar o isolamento de células estaminais da medula óssea do dador e marcação fluorescente da subpopulação isolado de acordo com protocolos padronizados ^9,12 aceitam as células repousar durante o tempo que o animal é realizada a operação. Para marcação fluorescente recomendamos CFDA (Carboxifluoresceína diacetate éster succinimidyl).
2. Anestesiar um rato macho pesando 20-25 g, com cetamina (75 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg). Durante os procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, anestesia deve ser mantida por suplementos (10% de injecção inicial, ip), conforme necessário (normalmente a cada 30-60 min).
3. Raspe suavemente a face anterior do escroto direito, bem como a coxa e virilha direita. Colete todos perdem o cabelo com um cotonete umedecido. Coloque o mouse lado ventral em um palco de visualização plexiglass e fixar a taxat usando cortina elástica. A fase é feito à medida, que consiste em uma placa de base e uma segunda placa da extremidade caudal da placa de base para a elevação de ambas as pernas e o escroto. Coloque a fase de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Após a fixação no palco, coloque o animal sob um microscópio de operação e executar as seguintes etapas da operação por meio de 10 - a ampliação de 16 vezes.
4. Faça a incisão inicial usando uma tesoura de pele na coxa direita, logo anterior dos vasos femorais do joelho até a virilha.
5. Identificar a artéria femoral e segui-lo proximamente, mobilizando a artéria de tecidos moles circundantes. Identificar e cortou um grande ramo para o testículo esquerdo usando termocautério. Posteriormente colocar uma sutura de estadia superficialmente no testículo esquerdo. Tração suave vai facilitar ainda mais a mobilização proximal da artéria femoral.
6. Após a conclusão da mobilização proximal, identificar e cortar um grande ramo executando medially na coxa por termocautério. A partir de então ligar a artéria femoral, na parte distal da coxa direita. Tração suave na ligadura vai ajudar ainda mais a preparação.
7. Rode-se agora a atenção para a artéria femoral proximal e novamente colocar uma sutura em torno da artéria como proximalmente possível. Prepare um nó, mas não amarrá-lo para baixo ainda. Aplicar tração suave para a sutura e criar um kinking arterial.
8. Depois de estabelecer a dobras, inciso artéria é cuidadosamente usando uma microtesoura. Tome especial cuidado para não danificar a veia femoral.
9. Inserir um microcateter preparado (diâmetro interno 0,28 milímetro) através da incisão. O cateter deve ser deaired (cloreto de sódio a 0,9%, NaCl) e ligado a um inserção antes seringa de 1 ml.
10. Após a inserção com êxito do cateter, cuidadosamente solte o enroscamento, a fim de facilitar a passagem do cateter. Fluxo arterial deve ser imediatamente visível dentro do cateter. Delicadamente, avançar o cateter alguns milímetross além do kinking anterior. A partir de então, amarrar a ligadura preparado para fixação do cateter.
11. Lavar cuidadosamente o cateter (0,9% NaCl) e aspirado para confirmar a posição correta. Utilizar um pedaço de fita adesiva para prender ainda mais o cateter para a fase de operação.
12. Após a fixação adequada, colocar o cateter de lado para as seguintes etapas de preparação do músculo cremaster. Aplicar a lavagem regular e aspiração do cateter cada 5-10 min, a fim de impedir a formação de coágulos.
13. Vire a atenção agora para o escroto direito e fazer uma incisão, cortando a pele e fáscia acima do aspecto ventral do escroto direito. Tome cuidado para não tocar no tecido subjacente com quaisquer instrumentos.
14. Estender a incisão até a dobra inguinal e caudal para a extremidade distal do escroto.
15. Tecidos cuidadosamente separado subjacente suave e conjuntivo acima do saco cremaster, sem tocá-lo. Identificar a extremidade distal do cremaster, e colocar uma sutura de estadia a slightly estender o músculo. Ressecar agora tecido mole remanescente sob o saco muscular, puxando suavemente o músculo caudal e anteriormente.
16. Após a separação completa do tecido conjuntivo, abra o saco cremaster em um ponto na borda cranial com uma tesoura. Estender a incisão desta abertura para baixo a extremidade distal do músculo.
17. Selar a pequena embarcação que liga o testículo eo cremaster usando termocautério, depois cortar as conexões restantes entre o músculo eo testículo com uma tesoura.
18. Deixe de lado o testículo, fora do campo de microscopia.
19. O cremaster abriu agora está na horizontal no palco. Coloque quatro 6-0 estadia prolene nas bordas do tecido e corrigi-los com caimento elástico, a fim de espalhar o tecido do músculo cremaster. De agora em diante continuamente humedecer o tecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma seringa de 1 ml (Figura 1).
20. Permitir agora a preparação para descansar por 15 min. Posteriormente injetar0,05-0,1 ml de 1% de Rodamina-dextrano através da artéria femoral esquerda para o realce do contraste da microvasculatura. Se algum quimiocinas ou agentes inflamatórios estão previstas para aplicação, você deve agora topicamente umedecer o músculo com o respectivo reagente usando uma seringa de 1 ml. No caso de uma experiência de controlo, continuar humedecendo com PBS.

2. Microscopia intravital

1. Manter o rato fixado na fase de operação e mover-se sob um microscópio de fluorescência modificado para epi-iluminação e ligada a uma câmara CCD (charge-coupled device) da câmara de vídeo. Tome especial cuidado para não deslocar o cateter de artéria femoral.
2. Realizar experimentos usando uma objetiva de imersão em água.
3. Depois de ajustar o objetivo de visualização suficiente da microcirculação cremaster e antes da injeção das células, estocasticamente definir seis vênulas pós-capilares, para posterior análise da aderência de células-tronco firme.
4. Administrar as células estaminais marcado com fluorescentes,Dissolveu-se em 200 ul de PBS, a 0,4 x 10 ⁶ culas por injecção, com um total de cinco injecções consecutivas, utilizando o cateter da artéria femoral e uma seringa de 1 ml. Agitar a amostra de células antes da primeira injecção.
5. Células estaminais da ficha de rolamento imediatamente após a injecção das células, definindo, assim, "rolar" como uma redução de mais de 50% da velocidade da célula ao longo do revestimento endotelial em combinação com típico celular "vara e solte" movimentos. Realizar contagem de células-tronco rolantes e todos as células-tronco que passam a uma distância pré-definida venular durante 1 min de observação após cada injeção única. A quantidade de rolamento de células estaminais é expressa como percentagem de todas as células que passam. Não conte células exibindo fenômenos amarrar breves aleatórios como células de rolamento.
6. Após a última injecção de células determinar o número de células estaminais, firmemente aderentes por contagem e expressar a quantidade em relação à superfície endotelial de th calculadoe seis vênulas predefinidos (diâmetro x comprimento x π) como células aderentes / mm ^2. Adesão firme é considerado quando há movimento celular é detectável por 30 seg.
7. Após a conclusão da microscopia intravital remova cuidadosamente o músculo cremaster e armazená-lo em correspondência para posterior análise (imunohistoquímica e biologia molecular). Sacrificar o animal por deslocamento cervical. A análise de microscopia intravital gravações para a quantificação de células estaminais de rolamento e adesão celular endotelial firmes, bem como a hemodinâmica microvasculares, tais como a velocidade do sangue de células vermelhas (mm / s), o comprimento do vaso (mm), o diâmetro dos vasos (mM), a taxa de partes de parede (seg ^-1); deve ser realizada off-line por um investigador cego para o respectivo tratamento do tecido experimental utilizando um software de processamento de imagem.

Representative Results

Em geral, a interação de injetado diretamente as células-tronco ou progenitoras com o endotélio vascular dentro da microcirculação músculo cremaster é um evento raro e ocorre exclusivamente em vênulas pós-capilares (diâmetro: 30-80 mm). Devido à fluorescência rotulagem de rolamento e as células-tronco, firmemente aderentes pode ser quantificada claramente na separação de leucócitos circulantes endógenos nas vénulas observados (Figura 2).

As condições da microcirculação representadas pela velocidade do fluxo sanguíneo e taxa de cisalhamento geralmente não diferem significativamente entre os respectivos grupos experimentais com o tratamento de quimiocinas diferentes (Tabela 1).

O tratamento local do tecido do músculo cremaster com diferentes quimiocinas ou mediadores de resposta inflamatória, por exemplo, SDF-1α (estromal derivada de células fator alfa-1) ou de TNF-α (factor de necrose tumoral-alfa), é capaz de imitar milhas específicocondições croenvironmental. Tais condições reforçar-tronco de células do endotélio interações celulares em um valor diferente, dependendo da quimiocina / mediador específico aplicado ea população de células-tronco injetadas (Figura 3) ^12. A possibilidade de quantificar claramente esses padrões diferentes de interações celulares de células-tronco endoteliais permite a avaliação do potencial migratório de populações específicas de células-tronco dentro de microambientes definidas in vivo antes avanço dessas populações para promover testes clínicos.

Além disso, o impacto de certas condições fisiopatológicas afectam a função endotelial, tais como deficiência de óxido nítrico, foi mostrado pelo uso de animais nocaute ^9.

Figura 1. Ilustração das etapas de microcirurgia chave (FA) em rato cremaster muscle preparação para microscopia intravital subseqüente.

Figura 2. Microscopia intravital de células de c-kit ⁺ em uma preparação de músculo cremaster murino. Fundo intravascular é fornecido por rodamina-dextrano. (Af) Uma série de seis imagens consecutivas com rolamento (setas pretas) e células firmemente aderentes (seta branca) carboxi-fluoresceína d-acetato marcado com succinimidylester c-kit ⁺ na vasculatura venular. Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Figura 3. A análise quantitativa das interações entre c-kit ⁺ celular e células endoteliais com base em imagens microscópicas de fluorescência intravital. (a) o número de células de c-kit ⁺ rolando no endotélio venular (expressa em percentagem de todas as células de passagem) em músculos cremaster murino expostos a SDF-1α, TNF-α ou uma combinação de ambos em relação a c-kit ⁺ injecção de células sem pré-tratamento de quimiocina (controlo). O tratamento com o SDF-1α sozinho e a combinação de SDF-1α + TNF-α aumento percentual de células de rolamento de c-kit ^+. (B) O número de células firmemente aderentes c-kit ⁺ por ² mm de revestimento endotelial venular é aumentada de forma significativa apenas após o tratamento com a combinação de SDF-1α + TNF-α. Os dados estão expressos como média ± SEM (* P <0,05 vs controlo). Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Mouse Tipo	Grupo Experimental	velocidade de células vermelhas do sangue(Mm / seg)	taxa de corte na parede (seg -1)
Tipo selvagem	Controle	0,7 ± 0,2	43 ± 32
Tipo selvagem	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Tipo selvagem	TNF	0,4 ± 0,2	45 ± 24
Tipo selvagem	SDF-1 α + TNF α	1,0 ± 0,5	117 ± 26

Tabela 1. Velocidades de células sanguíneas e taxas de cisalhamento parede em vênulas dos músculos cremaster murino no início do estudo Vermelho. A análise foi realizada usando software CapImage (Zeintl, Heidelberg, Alemanha), em preparações de músculo de ratinhos de tipo selvagem após tratamento com SDF-1α, TNF-α. Os dados são expressos como média ± sd diferenças entre os grupos individuais não foram encontrados sendo significativo. et al.

Discussion

Microscopia de fluorescência intravital permite a visualização direta e análise quantitativa de interações célula-tronco do endotélio. O modelo do músculo cremaster é particularmente útil, já que a exposição de microcirurgia e técnicas de visualização intravital têm sido bem estabelecidos durante a investigação sobre as interacções de leucócitos-endotélio e os vários componentes químicos podem ser selectivamente aplicado ao tecido alvo através de uma simples técnica de superfusão. Devido à ausência de artefatos de movimento e ruído de imagem grave, este modelo em particular, em comparação com outros ambientes de microscopia intravital, proporciona as condições ideais para a visualização de interações célula-célula.

O modelo permite revelando condições do microambiente essenciais, para o recrutamento de células-tronco inicial para ocorrer em um organismo vivo. Se necessário, leucócitos endógenos podem servir como controle positivo para a validação e prova de princípio de comportamento de células-tronco.

jove_content "> Representando um modelo animal aguda e utilizando injeção arterial direta, em vez de aplicação venosa, os potenciais limitações dos modelos de migração celular crônicas e / ou entrega de células sistêmica - por exemplo, a perda de células devido ao aprisionamento dentro de órgãos à distância - pode ser evitada por outro. lado, o trauma agudo do tecido cirúrgico seja susceptível de induzir um certo grau de activação do tecido em si. Portanto, uma preparação cirúrgica atraumática é obrigatória e estável condições microcirculatórios seguinte preparação do músculo cremaster precisa ser conseguida de uma forma inicial antes reprodutível com grupos experimentais.

A presença da acumulação de leucócitos dentro das extensa vénulas pós-capilares e de fuga significativa do corante fluorescente para o tecido circundante, no início dos registos de microscopia intravital em animais de controlo indicam um grande trauma cirúrgico dos tecidos.

No entanto, mesmo quando se aplica preparação meticulosatécnicas de ração, os resultados derivados de diferentes investigadores não são necessariamente totalmente comparáveis ​​devido a ligeiramente diferentes de ativação do tecido de base. É por isso que as experiências subsequentes devem ser realizadas pelo mesmo investigador, sempre que possível.

Projetado para a análise e quantificação das etapas iniciais de recrutamento de células-tronco de tecidos-alvo, o modelo atual não permite afirmações sobre definitiva de células-tronco órgão-enxerto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500