Intravital mikroskopi af mikrocirkulationen i Mouse Cremaster Muscle for Analyse af perifert Stem Cell Migration

Summary

Intravital mikroskopi af musen M. cremaster mikrocirkulationen giver en unik og godt standardiseret in vivo-model til analyse af perifere stamcellernes migration.

Abstract

I en tid med intravaskulære celle applikationsprotokoller i forbindelse med regenerativ celleterapi, ikke er blevet afklaret fuldstændig de underliggende mekanismer i stamceller migration til nonmarrow væv. Vi beskriver her teknikken intravital mikroskopi anvendes til muse cremaster mikrocirkulationen til analyse af perifere stamcellernes migration in vivo. Intravital mikroskopi M. cremaster tidligere er blevet indført i forbindelse med inflammatoriske forskning til direkte observation af leucocyt-interaktion med det vaskulære endotel. Da tilstrækkelig perifere stamceller og progenitorcellen migration indeholder tilsvarende indledende skridt for rullende langs og fast vedhæftning på endotel foring er det tænkeligt at anvende M. cremaster model for observation og kvantificering af samspillet mellem intravasculary administrerede stamceller med endotel. Som forskellige kemiske komponenter kan påføres selektivt til målet tproblemet ved simple superfusionssystem teknikker, er det muligt at fastsætte væsentlige microenvironmental forudsætninger for den indledende stamceller rekruttering at finde sted i en levende organisme uden for knoglemarven.

Introduction

Formålet med denne artikel er at beskrive en teknik intravital mikroskopi (IVM) anvendt på musen cremaster mikrocirkulation til direkte observation og analyse af perifere knoglemarv stamceller migration.

Den nuværende definition af begrebet stamceller baseret væv og orgel regenerering indebærer målsøgende af knoglemarv stamceller til det beskadigede væv ^1.. Et afgørende skridt for en vellykket stamcelle migration omfatter stamceller samspil med lokale endotel inden den forurettede orgel efterfulgt af transendothelial migration og til sidst orgel transplantation ^2. Intravital analyse af disse stamceller - endotelcellespecifikke interaktioner danner et ideelt parameter til kvantificering af en stamcelle baserede regenerativ respons i forskellige patofysiologiske indstillinger i vivo. Endvidere ser det ud tænkeligt, at der i fremtiden intravital analyse af vandrende kapacitet specifikke stamceller populations indenfor standardiserede mikrocirkulatoriske miljøer, kunne blive anvendt, før fremme disse befolkninger til yderligere klinisk afprøvning.

Intravital mikroskopi er oprindeligt udviklet til observation og kvantificering af leukocyt-endotel interaktion celle in vivo inden for inflammatoriske forskning ^3. Første vellykkede optagelser af intravital mikroskopi undersøgelser blev rapporteret af Cohnheim allerede i det 19. århundrede, studere frøer 'tunger og mesenteries under et lysmikroskop ^4. Siden sin første brug IVM har gennemgået en enorm teknologisk udvikling, og i dag visse væsentlige elementer danner forudsætninger for at udføre kvantitativ IVM: (i) vævspræparater, der tillader optisk adgang, (ii) molekylære prober, der kan påvises ved et mikroskop, (III ) et mikroskop forbundet til et system til påvisning og (iv) computerbaserede analyse-systemer, der kan udtrække parametre af interesse fra billedet datasæt ^4.

En række af vævspræparater er blevet indført til IVM forsøg herunder mesenteries og lever af mus og rotter ^5, de dorsale skinfold kamre mus ⁶ og hamster, kanin øre og hamster kinden pose for at nævne et par stykker.

Men i det følgende vil vi fokusere på musen cremaster muskel, der repræsenterer en ideel væv til intravital observationer, som forberedelse og visualisering er muligt ved et godt standardiseret kirurgisk procedure, og generelt ingen problemer med bevægelsesartefakter forekomme. Den åbne cremaster muskel forberedelse blev gennemført for første gang i 1970'erne af Baez og kolleger ^7.. Oprindeligt beskrevet for rotter er det blevet vedtaget succes også musen ^8. Efter tidligere undersøgelser primært havde fokuseret på leukocyt interaktioner med karvæggen, vores egen gruppe for nylig indført musen cremaster muskel præparat som et værdiansættelsenble redskab til direkte visualisering og kvantitativ analyse af stamceller celle-endotel interaktioner inden for et defineret mikromiljø ^9. Forskellige stamcelle cellesubpopulationer er blevet undersøgt under anvendelse af denne model, herunder murine c-kit ⁺ knoglemarv stamceller og mesenchymale stamceller, såvel som den menneskelige CD 133 ⁺ knoglemarvsstamceller ^10-12. Efter celleisolering fra donor knoglemarv og fluorescerende mærkning til visualisering, er stamceller selektivt anvendt i cremaster mikrocirkulationen udnytte en arteriel injektion via arteria femoralis og derved undgå enhver celle entrapment inden fjerntliggende organer. Endvidere cremaster muscle model er særlig nyttig, da forskellige kemokiner potentielt medierer lokale stamceller migration inden for de respektive indstillinger, kan påføres topisk på målvævet ved simpel superfusionssystem teknik.

Protocol

Hele protokollen efter celleisolering tager ca 2 timer.

1.. Microsurgical Forberedelse

1. Udfør stamceller isoleret fra donorknoglemarv og fluorescerende mærkning af det isolerede subpopulation efter standardiserede protokoller ^9,12 tillader celler at hvile i den tid dyret operationen udføres. For fluorescerende mærkning anbefaler vi CFDA (carboxyfluoresceindiacetat diacetate succinimidylester).
2. Bedøver en hanmus der vejer 20-25 g med ketamin (75 mg / kg) og xylazin (2,5 mg / kg). Gennem de kirurgiske procedurer og forsøgsprotokoller bør anæstesi opretholdes ved kosttilskud (10% af initial injektion ip) efter behov (normalt hver 30-60 min.)
3. Barbere forsigtigt den forreste del af den højre pungen samt højre lår og lyske. Saml alle mister hår med en fugtet vatpind. Placer musen ventrale side op på en plexiglas visning scenen og fastsætte gebyrett ved hjælp af elastisk drapere. Scenen specialfremstillet, bestående af en bundplade og en anden plade ved den kaudale kant af bundpladen af ​​højde på begge ben og pungen. Placer scenen på en varmepude til at opretholde kroppens temperatur på 37 ° C. Efter fiksering på scenen, skal du placere dyret under en operation mikroskop og udfør følgende handling trin ved hjælp af 10 - til 16-gange forstørrelse.
4. Gøre det oprindelige snit hjælp hud saks på højre lår, bare forreste af de femorale skibe fra knæet indtil til lysken.
5. Identificer lårarterien og følge det proksimalt, mobilisere arterien fra omgivende bløde væv. Identificere og skære en stor gren til venstre testikel ved hjælp thermocautery. Derefter placere et ophold sutur overfladisk i venstre testikel. Blid trækkraft vil lette yderligere proksimal mobilisering af den femorale arterie.
6. Efter afslutningen af ​​den proksimale mobilisering, identificere og skære en stor gren kører medially på låret ved thermocautery. Derefter ligere den femorale arterie i den distale del af højre lår. Skånsom trækkraft på ligatur vil støtte yderligere forberedelse.
7. Drej opmærksomhed nu til den proksimale lårarterie igen og placere en sutur omkring arterien så proksimalt som muligt. Forbered en knude, men ikke binde den ned endnu. Påfør blid trækkraft til suturen og skabe en arteriel knæk.
8. Efter oprettelse af knæk, incise arterien er forsigtigt med en microscissor. Vær særlig forsigtig med ikke at beskadige den femorale vene.
9. Sæt en forberedt mikrokateter (indvendig diameter 0,28 mm) via indsnit. Kateteret skal deaired (0,9% natriumchlorid, NaCl) og forbundet til en 1 ml sprøjte før indsættelse.
10. Efter vellykket indsætning af kateteret forsigtigt løsne kinkedannelsen for at lette passagen af ​​kateteret. Arteriel blodgennemstrømning skal være umiddelbart synlige i kateteret. Forsigtigt fremføre kateteret et par millimeters uden foregående knæk. Derefter binde den forberedte ligatur til fiksering af kateteret.
11. Skylles forsigtigt kateter (0,9% NaCl) og aspirat at bekræfte korrekte position. Brug et stykke tape for yderligere at sikre kateteret til operationstrin.
12. Efter tilstrækkelig fiksering, sætte kateteret afsat til følgende forberedelse trin i cremaster musklen. Anvend regelmæssig skylning og aspiration af kateteret hver 5-10 min for at forhindre koageldannelse.
13. Aflede opmærksomheden nu til højre pungen og lave et snit ved at skære i huden og fascia over den ventrale aspekt af den rigtige pungen. Pas på ikke at røre ved det underliggende væv med eventuelle instrumenter.
14. Forlænge snittet op til lyske gange og caudalt til den distale ende af pungen.
15. Adskil forsigtigt underliggende blødt og bindevæv over cremaster sæk, uden at røre den. Identificer den distale ende af cremaster, og placere et ophold sutur her for at slightly forlænge musklen. Resect nu resterende blødt væv under musklen sæk ved forsigtigt at trække musklen caudally og anteriort.
16. Efter fuldstændig adskillelse fra bindevæv, åbne cremaster sæk på et tidspunkt på kranie kanten med en saks. Udvide snittet fra denne åbning ned til den distale ende af musklen.
17. Forsegl lille fartøj forbinder testiklen og cremaster hjælp thermocautery, derefter skæres de resterende forbindelser mellem muskel og testikel med en saks.
18. Lægge testikel, ud af mikroskopi felt.
19. Den åbnede cremaster nu ligger fladt på scenen. Placer fire 6-0 prolene ophold suturer ved kanterne af vævet og løse dem med elastik drapere for at sprede cremaster muskelvæv. Fra nu kontinuerligt fugte med phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en 1 ml sprøjte (figur 1).
20. Lad nu forberedelse til hvile i 15 min. Derefter injicere0,05-0,1 ml 1% rhodamin-dextran via venstre femoral arterie til kontrastforbedring af mikrovaskulaturen. Hvis der planlægges eventuelle kemokiner eller inflammatoriske midler til ansøgning, bør du nu topisk fugte musklen med den respektive reagens ved hjælp af en 1 ml sprøjte. I tilfælde af et kontrolforsøg, fortsat befugtning med PBS.

2. Intravital Microscopy

1. Hold musen fastsættes på operationstrin og bevæger sig under et fluorescensmikroskop modificeret til epi-illumination og forbundet til en CCD (charge-coupled device) videokamera. Vær særlig opmærksom på ikke at forskubbe femoralarterien kateter.
2. Udføre eksperimenter anvendelse af en vand immersionsobjektiv.
3. Efter justering af mål for tilstrækkelig visualisering af cremaster mikrocirkulationen og før celle injektion, stokastisk definere seks postkapillære vener til senere analyse af fast stamceller tilslutning.
4. Administrere fluorescensmærkede stamcelleropløst i 200 pi PBS ved 0,4 x 10 ⁶ celler pr injektion, med i alt fem på hinanden følgende injektioner anvender den femorale arterie kateteret og en 1 ml sprøjte. Ryst forsigtigt celleprøven forud for den første injektion.
5. Optag stamcelle rullende umiddelbart efter celle injektion, hvorved man definerer "rullende" som en reduktion af celle hastighed mere end 50% langs endotelhinden kombineret med typiske cellulær "stick og slip" bevægelser. Udfør tælling af rullende stamceller, og alle stamceller passerer en foruddefineret venular afstand i løbet af 1 min observation efter hver enkelt injektion. Mængden af ​​stamceller rullende udtrykkes som procentdel af alle forbipasserende celler. Må ikke tælle celler udviser tilfældige korte tøjre fænomener som rullende celler.
6. Efter den sidste celle injektion bestemme antallet af fast fastklæbende stamceller ved at tælle og udtrykker mængden i forhold til den beregnede endoteloverfladen af ​​the seks foruddefinerede venules (diameter x længde x π) som adhærente celler / mm ^2. Firm adhæsion overvejes, når ingen celle bevægelse er påviselig i 30 sek.
7. Efter afslutningen af ​​intravital mikroskopi forsigtigt fjerne cremaster muskler og gemme det i korrespondance til senere analyse (immunhistokemi eller molekylær biologi). Sacrifice dyret ved cervikal dislokation. Analysen af ​​intravital mikroskopi optagelser til kvantificering af stamceller rullende og fast endotel vedhæftning, samt mikrovaskulære hæmodynamik, såsom røde blodlegemer hastighed (mm / sek), fartøjets længde (mM), fartøj diameter (um), væg andel rate (sek ^-1), bør udføres offline ved en efterforsker blindet for den respektive eksperimenterende væv behandling udnytte en billedbehandling software.

Representative Results

I almindelighed interaktion injiceres direkte stam-eller progenitorceller med det vaskulære endotel i cremaster muscle mikrocirkulationen er en sjælden begivenhed, og forekommer udelukkende i postkapillære venuler (diameter: 30-80 um). På grund af fluorescensmærkning rullende og fast adhærerende stamceller kan kvantificeres klart i adskillelse fra cirkulerende endogene leukocytter i de observerede venuler (figur 2).

De mikrocirkulatoriske betingelser repræsenteret af blodgennemstrømningen hastighed og vægforskydningshastighed normalt ikke signifikant forskellig mellem de respektive eksperimentelle grupper med forskellig chemokinet behandling (Tabel 1).

Lokal behandling af cremaster muskelvæv med forskellige chemokiner eller mediatorer af inflammatoriske respons, fx SDF-1α (stromal celle-afledte faktor-1 alpha) eller TNF-α (tumornekrosefaktor-alfa) er i stand til at efterligne specifikke microenvironmental forhold. Sådanne betingelser kan forbedre stamcellelignende endothelial celle-interaktioner i en anden mængde, afhængigt af den specifikke chemokin / mediator anvendes, og stamcellepopulation injiceret (fig. 3) ^12. Muligheden for tydeligt kvantificere disse forskellige mønstre af stamcelle-endotel celleinteraktioner muliggør til evaluering af den vandrende potentiale af specifikke stamceller populationer i definerede mikromiljøer in vivo før fremme disse befolkninger at fremme klinisk afprøvning.

Desuden er virkningen af visse patofysiologiske forhold, der påvirker endotel funktion, såsom nitrogenoxid-oxid-mangel, er blevet vist ved brug af knockout dyr ^9.

Figur 1. Illustration af de vigtigste microsurgical trin (AF) i mus cremaster musforberedelse Cle til efterfølgende intravital mikroskopi.

Figur 2. Intravital mikroskopi af c-kit ^+-celler i et murint cremaster muscle forberedelse. Intravaskulær baggrund tilvejebringes af rhodamin-dextran. (Af) En række af seks på hinanden følgende billeder med rullende (sorte pile) og fast adhærerende (hvid pil) carboxy-fluorescein d-acetat succinimidylester-mærkede c-kit ^+-celler i venular vaskulatur. Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Figur 3. Kvantitativ analyse af samspillet mellem c-kit ⁺ celle og endotelceller baseret på intravital fluorescens mikroskopiske billeder. (a) Antallet af rullende c-kit ^+-celler på venular endotel (udtrykt i procent af alle passerer celler) i murine Cremaster muskler udsat for SDF-1α, TNF-α eller en kombination af begge i forhold til c-kit ⁺ celleinjektion uden chemokin forbehandling (kontrol). Behandling med SDF-1α alene og kombinationen af SDF-1α + TNF-α større procentdel af rullende c-kit ^+-celler. (B) antallet af fast fastklæbende c-kit ^+-celler pr mm ² venular endotelhinden signifikant forøget efter behandling med kombinationen af SDF-1α + TNF-α. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM (* p <0,05 vs kontrol). Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Mus type	Experimental Group	røde blodlegemer hastighed(Mm / sek)	vægforskydningshastighed (sek -1)
Vildtype	Kontrol	0,7 ± 0,2	43 ± 32
Vildtype	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Vildtype	TNF	0,4 ± 0,2	45 ± 24
Vildtype	SDF-1 α + TNF α	1,0 ± 0,5	117 ± 26

Tabel 1.. Røde blodlegemer hastigheder og vægforskydningshastighed satser i små vener af murine cremaster muskler ved baseline. Analyse blev udført ved hjælp CapImage Software (Zeintl, Heidelberg, Tyskland) i muskel præparater af wild-type mus efter behandling med SDF-1α, TNF-α. Data er udtrykt som middelværdi ± SD Forskelle mellem de enkelte grupper ikke blev fundet værende væsentlig. et al.

Discussion

Intravital fluorescensmikroskopi giver mulighed for direkte visualisering og kvantitativ analyse af stamceller celle-endotel interaktioner. Den cremaster muscle model er særlig nyttig, da mikrokirurgisk eksponering og teknikker intravital visualisering er blevet veletableret i forskning i leukocyt-endotel-interaktioner og forskellige kemiske komponenter kan påføres selektivt på målvævet ved simpel superfusionssystem teknik. På grund af fraværet af bevægelsesartefakter og svær billedstøj denne særlige model, i sammenligning med andre intravital-mikroskopi indstillinger giver optimale betingelser for visualisering af celle-celle-interaktioner.

Modellen gør det muligt at afsløre væsentlige microenvironmental forudsætninger, for første stamcelle ske ansættelser i en levende organisme. Hvis det er nødvendigt, kan endogene leukocytter tjene som positive kontroller til validering og bevise af princippet om stamceller adfærd.

jove_content "> repræsenterer en akut dyremodel og udnytte direkte arteriel indsprøjtning i stedet for venøs ansøgning, de potentielle begrænsninger af kroniske celle migration modeller og / eller systemisk celle levering - fx celle tab som følge af indespærring i fjerntliggende organer - kan undgås på den anden. hånd, akut kirurgisk vævstraumer sandsynligvis fremkalde en vis grad af væv aktivering selv. Derfor er en atraumatisk kirurgisk forberedelse er obligatorisk og stabil mikrocirkulatoriske betingelser efter cremaster muskel forberedelse skal nås i en reproducerbar måde tidligere start med eksperimentelle grupper.

Tilstedeværelsen af ​​omfattende leukocyt akkumulering inden for de postkapillære venuler og betydelig lækage af det fluorescerende farvestof til det omgivende væv ved begyndelsen af ​​intravital mikroskopi optagelser i kontroldyr indikerer større kirurgisk vævstraume.

Men selv når de anvender omhyggelig forberation teknikker, resultater stammer fra forskellige efterforskere er ikke nødvendigvis helt sammenlignelige på grund af lidt forskellige baseline væv aktivering. Dette er grunden til efterfølgende eksperimenter bør udføres af den samme investigator muligt.

Designet til analyse og kvantificering af de indledende trin i stamceller rekruttering til at målrette væv, er den nuværende model ikke tillade udsagn om konkret stamcelle orgel-transplantation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500