Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Summary

Microscopia intravitale del microcircolo cremastere topo M. offre un unico e ben standardizzato-modello in vivo per l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.

Abstract

Nell'era della intravascolari protocolli di applicazione di cellule nel contesto della terapia cellulare rigenerativa, i meccanismi alla base della migrazione di cellule staminali per nonmarrow tessuto non sono stati completamente chiariti. Descriviamo qui la tecnica della microscopia intravitale applicata al cremastere microcircolazione del mouse per l'analisi del midollo osseo periferico migrazione delle cellule staminali in vivo. Microscopia intravitale del cremastere M. è stato precedentemente introdotto nel campo della ricerca infiammatorio per l'osservazione diretta dell'interazione dei leucociti con l'endotelio vascolare. Da staminali periferiche sufficiente e la migrazione delle cellule progenitrici include analoghe fasi iniziali di laminazione lungo e ferma adesione alla endoteliali che rivestono è concepibile applicare il modello cremastere M. per l'osservazione e la quantificazione dell'interazione delle cellule staminali somministrate intravasculary con l'endotelio. Come vari componenti chimici possono essere applicati selettivamente al bersaglio trilascio da semplici tecniche di superfusione, è possibile stabilire condizioni essenziali del microambiente, per l'assunzione iniziale di cellule staminali che si terrà in un organismo vivente al di fuori del midollo osseo.

Introduction

Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale (IVM) applicato sul cremastere microcircolazione del mouse per l'osservazione diretta e l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.

Rigenerazione dei tessuti e organi Il concetto attuale di cellule staminali basato comporta la homing delle cellule staminali del midollo osseo al tessuto danneggiato ^1. Un passo fondamentale per la migrazione di cellule staminali successo include staminali interazione delle cellule con l'endotelio locale all'interno dell'organo feriti seguita dalla migrazione transendoteliale e, infine, organo attecchimento ^2. Analisi intravital di queste cellule staminali - interazioni cellule endoteliali costituisce un parametro ideale per la quantificazione di una risposta rigenerativa basata sulle cellule staminali in differenti impostazioni fisiopatologiche in vivo. Inoltre, sembra concepibile, che, in futuro, analisi intravital della capacità migratoria di specifico p cellule staminaliopulations all'interno di ambienti microcircolazione standardizzati, potrebbero essere applicati prima avanzando queste popolazioni a ulteriori test clinici.

Microscopia intravital è stato inizialmente sviluppato per l'osservazione e la quantificazione delle interazioni cellula-endoteliale dei leucociti in vivo nel campo della ricerca infiammatorio ^3. Le prime registrazioni di successo di studi di microscopia intravitale sono stati riportati da Cohnheim già nel 19 ° secolo, studiando lingue e mesenteri rana sotto un microscopio ottico ^4. Dal suo primo uso IVM ha subito un enorme sviluppo tecnico e oggi alcuni componenti essenziali costituiscono prerequisiti per eseguire IVM quantitativa: (i) preparazioni di tessuto che consentono l'accesso ottico, (ii) sonde molecolari che possono essere rilevati da un microscopio, (iii ) un microscopio collegato ad un sistema di rilevamento e (iv) sistemi di analisi computerizzati in grado di estrarre i parametri di interesse dati di immagineset ^4.

Una varietà di preparazioni di tessuto è stato introdotto per gli studi IVM compresi i mesenteri e il fegato di topo e nel ratto ^5, le camere plica dorsale di topo ⁶ e il criceto, l'orecchio di coniglio e il sacchetto criceto guancia per citarne alcuni.

Tuttavia, nel seguito ci concentreremo sul muscolo cremastere topo, che rappresenta un tessuto ideale per le osservazioni intravitale, come la preparazione e la visualizzazione sono possibili da una procedura chirurgica ben standardizzata, e in generale non si verifichino problemi di artefatti da movimento. La preparazione cremastere muscolare aperta si è svolta per la prima volta nel 1970 da Baez e colleghi ^7. Originariamente descritto per i ratti, è stato adottato con successo anche al mouse ^8. Dopo gli studi precedenti si erano concentrati principalmente sulle interazioni leucociti con la parete del vaso, il nostro gruppo ha recentemente introdotto il mouse preparazione cremastere muscolo come valutaziostrumento BLE per visualizzazione diretta e l'analisi quantitativa di staminali interazioni cellula-endotelio in un microambiente definito ^9. Varie sottopopolazioni di cellule staminali sono state studiate utilizzando questo modello, compresi murino c-kit ⁺ cellule staminali del midollo osseo e di cellule staminali mesenchimali, nonché CD umano cellule staminali del midollo osseo 133 ^{+ 10-12.} Dopo aver isolato cellule da donatore di midollo osseo e marcatura fluorescente per la visualizzazione, le cellule staminali vengono selettivamente applicati nella microcircolazione cremastere utilizzando una iniezione arteriosa attraverso l'arteria femorale, evitando così qualsiasi intrappolamento cella all'interno organi remoti. Inoltre, il modello cremastere muscolare è particolarmente utile in quanto varie chemochine potenzialmente mediano la migrazione delle cellule staminali locale entro le rispettive impostazioni, possono essere applicati localmente al tessuto bersaglio di semplice tecnica superfusione.

Protocol

L'intero protocollo dopo l'isolamento delle cellule richiede circa 2 ore.

1. Microsurgical Preparazione

1. Eseguire isolamento delle cellule staminali del midollo osseo del donatore e marcatura fluorescente della sottopopolazione isolato secondo protocolli standardizzati ^9,12 permettere alle cellule di riposare durante il tempo viene eseguita l'operazione animale. Per l'etichettatura fluorescente ti consigliamo di CFDA (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl estere).
2. Anestetizzare un topo maschio pesa 20-25 g con ketamina (75 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg). Nel corso degli interventi chirurgici e protocolli sperimentali, anestesia deve essere mantenuta dai integratori (10% di iniezione iniziale, ip) come necessario (di solito ogni 30-60 min).
3. Shave delicatamente la faccia anteriore dello scroto destra così come la coscia destra e l'inguine. Raccogliere tutti perdono i capelli con un batuffolo di cotone inumidito. Posizionare il lato ventrale del mouse su un palco di visualizzazione plexiglass e fissare la tassat con telo elastico. Lo stadio è su ordine, costituito da una piastra di base e una seconda piastra sul bordo caudale della piastra di base per l'elevazione di entrambe le gambe e scroto. Posizionare la fase su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Dopo la fissazione sul palco, mettere l'animale sotto un microscopio di funzionamento ed effettuare le seguenti fasi operative utilizzando 10 - 16 volte di ingrandimento.
4. Rendere l'incisione iniziale con le forbici pelle alla coscia destra, solo anteriore dei vasi femorali dal ginocchio fino all'inguine.
5. Identificare l'arteria femorale e seguirla prossimale, mobilitando l'arteria da tessuti molli circostanti. Identificare e tagliare un grosso ramo al testicolo sinistro con termocauterio. Successivamente inserire un soggiorno di sutura superficiale al testicolo sinistro. Lieve trazione faciliterà ulteriormente mobilitazione prossimale dell'arteria femorale.
6. Dopo il completamento della mobilitazione prossimale, identificare e tagliare un grosso ramo esecuzione medially alla coscia da termocauterio. Successivamente legare l'arteria femorale nella parte distale della coscia destra. Trazione delicata sulla legatura sarà di aiuto ulteriore preparazione.
7. Girare l'attenzione ora l'arteria femorale prossimale di nuovo e mettere una sutura intorno all'arteria quanto prossimale possibile. Preparare un nodo, ma non legarlo giù ancora. Applicare una leggera trazione per la sutura e creare un attorcigliamenti arteriosa.
8. Dopo aver stabilito il piegamento, incise l'arteria viene accuratamente usando un microscissor. Fate attenzione a non danneggiare la vena femorale.
9. Inserire un microcatetere preparata (diametro interno 0,28 millimetri) attraverso l'incisione. Il catetere deve essere anidro (cloruro di sodio 0,9%, NaCl) e collegato ad una siringa da 1 ml prima dell'inserimento.
10. Dopo successo inserzione del catetere, allentare attentamente il piegamento per agevolare il passaggio del catetere. Flusso di sangue arterioso dovrebbe essere immediatamente visibile all'interno del catetere. Far avanzare delicatamente il catetere pochi millimetris oltre il piegamento precedente. Successivamente, lega giù la legatura predisposto per il fissaggio del catetere.
11. Lavare delicatamente il catetere (0,9% NaCl) e aspirare a confermare la posizione corretta. Usare un pezzo di nastro adesivo per fissare ulteriormente il catetere per la fase di esercizio.
12. Dopo la fissazione adeguata, mettere il catetere da parte per le seguenti fasi di preparazione del muscolo cremastere. Applicare lavaggio regolare e l'aspirazione del catetere ogni 5-10 minuti, al fine di prevenire la formazione di coaguli.
13. Girare l'attenzione ora allo scroto destra e fare un'incisione tagliando la pelle e la fascia sopra l'aspetto ventrale dello scroto destra. Fare attenzione a non toccare il tessuto sottostante con qualsiasi strumento.
14. Estendere l'incisione fino alla piega inguinale e caudalmente all'estremità distale dello scroto.
15. Tessuto accuratamente separato sottostante morbido e connettivo sopra il sacco Cremaster, senza toccarlo. Identificare l'estremità distale del Cremaster, e inserire un soggiorno sutura qui per slightly estendere il muscolo. Resecare ora restante del tessuto molle sotto il sacco muscolo tirando delicatamente il muscolo caudale e anteriormente.
16. Dopo la separazione completa da tessuto connettivo, aprire il sacco cremastere in un punto sul bordo craniale con le forbici. Estendere l'incisione da questa apertura fino all'estremità distale del muscolo.
17. Sigillare la piccola imbarcazione che collega il testicolo e cremastere utilizzando termocauterio, successivamente tagliare i restanti collegamenti tra il muscolo e il testicolo con le forbici.
18. Mettere da parte il testicolo, fuori dal campo microscopia.
19. Cremastere aperto ora adagiata sul palco. Mettere quattro 6-0 suture Prolene ai bordi del tessuto e fissarli con drappeggio elastico, al fine di diffondere il tessuto del muscolo cremastere. Da ora in poi inumidire continuamente il tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) usando una siringa da 1 ml (Figura 1).
20. Lasciare ora la preparazione riposare per 15 min. Successivamente iniettare0,05-0,1 ml di 1% rodamina-destrano attraverso l'arteria femorale sinistra per migliorare il contrasto del microcircolo. Se si prevedono eventuali chemochine o agenti infiammatori per l'applicazione, si dovrebbe ora topica inumidire il muscolo con il rispettivo reagente con una siringa da 1 ml. Nel caso di un esperimento di controllo, continuare inumidendo con PBS.

2. Intravitale Microscopia

1. Mantenere il mouse fissato sulla fase di esercizio e muoversi sotto un microscopio a fluorescenza modificato per epi-illuminazione e collegato ad un CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) videocamera. Fate attenzione a non dislocare il catetere arteria femorale.
2. Condurre esperimenti utilizzando un obiettivo immersione in acqua.
3. Dopo aver regolato l'obiettivo per la visualizzazione sufficiente del microcircolo Cremaster e prima iniezione di cellule, stocasticamente definire sei venule postcapillari per una successiva analisi di ferma adesione delle cellule staminali.
4. Somministrare cellule staminali fluorescenti marcato,disciolto in 200 microlitri di PBS, a 0.4 x 10 ⁶ cellule per iniezione, con un totale di cinque iniezioni consecutive utilizzando il catetere femorale e una siringa da 1 ml. Agitare con precauzione il campione cellulare prima della prima iniezione.
5. Cellule staminali Record rotolamento immediatamente dopo l'iniezione delle cellule, definendo così "rolling" come una riduzione superiore al 50% della velocità cella lungo il rivestimento endoteliale in combinazione con tipico cellulare "bastone e rilasciare" movimenti. Effettuare il conteggio delle cellule staminali di laminazione e di tutte le cellule staminali che passano una distanza venulare predefinita per 1 min di osservazione dopo ogni singola iniezione. La quantità di rotolamento cellule staminali è espressa come percentuale di tutte le cellule che passano. Non contare le cellule espositrici occasionali fenomeni tethering brevi come cellule di rotolamento.
6. Dopo l'ultima iniezione cella determinare il numero di cellule staminali saldamente aderenti contando e indica la quantità in relazione alla superficie endoteliale calcolato di the sei venule predefiniti (diametro x lunghezza x π) come cellule aderenti / mm ^2. Adesione Studio è considerato quando non il movimento delle cellule è rilevabile per 30 sec.
7. Dopo il completamento della microscopia intravitale rimuovere delicatamente il muscolo cremastere e memorizzarlo in corrispondenza successiva analisi (immunoistochimica o biologia molecolare). Sacrifica l'animale da dislocazione cervicale. L'analisi delle registrazioni microscopia intravitale per la quantificazione del gambo rotolamento cellulare e ferma adesione endoteliale, nonché emodinamica microvascolari, come la velocità del sangue rosso cella (mm / sec), la lunghezza della nave (micron), diametro del vaso (micron), parete tasso quota (sec ^-1); deve essere eseguita in linea da un investigatore cieco al rispettivo trattamento tessutale sperimentale utilizzando un software di elaborazione delle immagini.

Representative Results

In generale, l'interazione di direttamente iniettato cellule staminali o progenitrici con l'endotelio vascolare all'interno della microcircolazione cremastere muscolare è un evento raro e avviene esclusivamente in venule postcapillari (diametro: 30-80 micron). A causa fluorescenza etichettatura rotolamento e cellule staminali saldamente aderenti possono essere chiaramente quantificati in separazione da leucociti circolanti endogeni nelle venule osservati (Figura 2).

Le condizioni microcircolo rappresentati dalla velocità del flusso sanguigno e parete shear rate di solito non presentano differenze significative tra i rispettivi gruppi sperimentali con trattamento chemochina differente (Tabella 1).

Trattamento locale del tessuto muscolare cremastere con differenti chemiochine o mediatori della risposta infiammatoria, ad esempio SDF-1α (stromal cell-derived factor-1 alfa) o TNF-α (TNF-alfa) è in grado di imitare specifico micondizioni croenvironmental. Tali condizioni migliorano staminali interazioni cellula-cellula endoteliale in un importo diverso, a seconda della specifica chemochine / mediatore applicate e la popolazione di cellule staminali iniettate (Figura 3) ^12. La possibilità di quantificare in modo chiaro questi modelli diversi di interazione cellule endoteliali di cellule staminali permette per la valutazione del potenziale migratorio di popolazioni specifiche di cellule staminali all'interno di microambienti definiti in vivo prima di avanzare queste popolazioni ad ulteriori test clinici.

Inoltre, l'impatto di talune condizioni fisiopatologiche interessano la funzione endoteliale, come la carenza di ossido nitrico, è stato dimostrato con l'uso di animali knockout ^9.

Figura 1. Illustrazione dei passaggi chiave di microchirurgia (AF) nel topo Cremaster muspreparazione cle per la successiva la microscopia intravitale.

Figura 2. Microscopia intravitale di c-kit ⁺ cellule in una preparazione cremastere muscolo murino. Sfondo intravascolare è fornito da Rhodamin-destrano. (Af) Una serie di sei immagini consecutive con rotolamento (frecce nere) e saldamente aderenti (freccia bianca) carbossi-fluoresceina d-acetato di c-kit ⁺ cellule succinimidylester marcato nel sistema vascolare venulare. Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Figura 3. Analisi quantitativa delle interazioni tra c-kit ⁺ cellule e cellule endoteliali basato su intravitale fluorescenza immagini microscopiche. (a) Il numero di rotolamento ⁺ cellule c-kit sull'endotelio venulare (espressa in percentuale di tutte le cellule che passano) in muscoli Cremaster murini esposti a SDF-1α, TNF-α o una combinazione di entrambi rispetto al c-kit ⁺ iniezione di cellule senza chemochina pretrattamento (controllo). Il trattamento con SDF-1α solo e la combinazione di SDF-1α + TNF-α aumento della percentuale di c-kit ⁺ cellule rotolamento. (B) Il numero di c-kit saldamente aderenti ⁺ cellule per mm ² di rivestimento endoteliale venulare è significativamente aumentata solo dopo trattamento con l'associazione di SDF-1α + TNF-α. I dati sono espressi come media ± SEM (* P <0.05 vs controllo). Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Tipo di mouse	Gruppo Sperimentale	velocità dei globuli rossi(Mm / sec)	parete gradiente di velocità (sec -1)
Tipo selvatico	Controllo	0.7 ± 0.2	43 ± 32
Tipo selvatico	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Tipo selvatico	TNF	0,4 ± 0,2	45 ± 24
Tipo selvatico	SDF-1 α + TNF α	1.0 ± 0.5	117 ± 26

Tabella 1. Red velocità cellule del sangue e dei tassi di parete di taglio in venule muscolari murine Cremaster al basale. L'analisi è stata effettuata utilizzando CapImage Software (Zeintl, Heidelberg, Germania) nei preparati muscolari di topi wild-type dopo il trattamento con SDF-1α, TNF-α. I dati sono espressi come media ± DS differenze tra i singoli gruppi non sono stati trovati essere significativo. et al.

Discussion

Microscopia a fluorescenza intravital permette la visualizzazione diretta e l'analisi quantitativa delle interazioni cellula-endotelio staminali. Il modello cremastere muscolare è particolarmente utile, poiché l'esposizione microchirurgico e le tecniche di visualizzazione intravitale sono stati ben stabiliti nel corso della ricerca sulle interazioni leucociti-endotelio e vari componenti chimici può essere applicato selettivamente al tessuto bersaglio semplice tecnica superfusione. A causa dell'assenza di artefatti di movimento e rumore dell'immagine grave, questo particolare modello, in confronto ad altre impostazioni intravital-microscopia, fornisce le condizioni ottimali per la visualizzazione delle interazioni cellula-cellula.

Il modello consente rivelando condizioni microambientali essenziali, per il reclutamento di cellule staminali prima di prendere posto in un organismo vivente. Se necessario, leucociti endogeni possono servire come controlli positivi per la convalida e dimostrare di principio del comportamento delle cellule staminali.

jove_content "> Rappresentare un modello animale acuta e utilizzando l'iniezione arteriosa diretta anziché di applicazione venoso, i potenziali limiti dei modelli di migrazione cellulare croniche e / o consegna delle cellule sistemica - ad esempio la perdita di cellule a causa di intrappolamento all'interno degli organi remoti - può essere evitato D'altro. mano, trauma acuto chirurgica di tessuto può procurare un certo grado di attivazione tessuto stesso. Pertanto, una preparazione chirurgica atraumatica è obbligatoria e stabile condizioni microcircolo seguente bisogno preparazione muscolo cremastere da raggiungere in maniera riproducibile prima di partenza con gruppi sperimentali.

La presenza di una vasta accumulo dei leucociti all'interno delle venule postcapillari e perdite significative di colorante fluorescente al tessuto circostante all'inizio delle registrazioni microscopia intravitale in animali di controllo di indicare grave trauma tissutale chirurgico.

Tuttavia, anche quando l'applicazione preparazione meticolosatecniche di razionamento, i risultati ottenuti da diversi ricercatori non sono necessariamente del tutto paragonabili a causa di un po 'diverse l'attivazione del tessuto di base. Questo è il motivo per esperimenti successivi devono essere eseguite dallo stesso sperimentatore quando possibile.

Progettato per l'analisi e la quantificazione delle fasi iniziali di reclutamento di cellule staminali da tessuti bersaglio, il modello attuale non consente dichiarazioni in definitiva cellule staminali organo-attecchimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500