末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

Summary

マウスのM.精巣挙微小循環の生体顕微鏡は、ユニークと周辺の骨髄幹細胞の移動を解析するための生体モデルでよく標準化されています。

Abstract

再生細胞治療の文脈における血管細胞のアプリケーションプロトコルの時代において、nonmarrow組織への幹細胞の遊走の基礎となるメカニズムは完全に解明されていない。ここでは、インビボで周辺の骨髄幹細胞の遊走の分析のためのマウスの精巣挙筋の微小循環に適用される生体顕微鏡の技術を記載している。 M.の精巣挙の生体顕微鏡は、以前の血管内皮と白血球の相互作用を直接観察するための炎症研究の分野で導入されている。十分な末梢幹細胞および前駆細胞の移動は、それを裏打ちする内皮に接着沿ってしっかりと圧延同様の初期ステップを含んでいるので内皮とintravasculary投与幹細胞の相互作用の観察および定量化のためM.精巣挙モデルを適用することが考えられる。様々な化学成分を選択的に標的tに適用することができるように初期の幹細胞の動員、骨髄外、生体内の場所を取るための単純な灌流技術による問題は、それが、本質的な微小環境の前提条件を確立することが可能である。

Introduction

本資料の目的は、末梢骨髄幹細胞の移動の直接観察および分析のためのマウス精巣挙筋の微小循環に塗布生体顕微鏡（IVM）の技術を記述することである。

幹細胞に基づく組織および臓器再生の現在の概念は、損傷組織¹に骨髄由来幹細胞のホーミングを含む。成功した幹細胞の移動のための重要なステップは、経内皮移動、最終的には、臓器移植の²に続いて負傷した臓器内のローカル内皮と細胞の相互作用幹が含まれています。これらの幹細胞の生体内分析-内皮細胞相互作用は、 インビボで異なる病態生理学的な設定での幹細胞に基づく再生応答の定量のために理想的なパラメータを形成する。さらに、それは、考えられる思われる、将来的には、特定の幹細胞pの遊走能の生体内分析標準化された微小環境内opulationsは、さらなる臨床試験をこれらの集団を進める前に適用される可能性があります。

生体顕微鏡は、最初は炎症研究³分野におけるin vivoでの白血球-内皮細胞相互作用を観察し、定量化のために開発されました。生体顕微鏡研究の最初の成功の記録は、光学顕微鏡⁴の下にカエル」舌や腸間膜を勉強し、19世紀にはすでにコーンハイムから報告された。その最初の使用IVMは、驚異的な技術開発、今日を受けているので、ある種の必須成分は、定量IVMを行うために前提条件を形成は、（i）組織の光アクセスを可能にする製剤、（ii）は、顕微鏡によって検出できる分子プローブ、（三）検出システム、画像データから関心対象のパラメータを抽出することができる（iv）のコンピュータベースの分析システムに接続された顕微鏡^4を設定します。

組織標本の様々な腸間膜およびマウスおよびラット^5、マウス^6、ハムスター、ウサギの耳といくつか例を挙げると、ハムスターの頬袋の背側皮下脂肪チャンバーの肝臓を含むIVM研究のために導入されている。

準備と可視化が十分に標準化された外科的手技によって可能であり、一般的には運動の成果物に問題が発生しないようにただし、次の年には、生体内の観察のための理想的な組織を代表する、マウスの精巣挙筋に焦点を当てます。オープン精巣挙筋標本はバエズや同僚⁷によって1970年に初めて実施された。当初のラットについて記載し、それはマウス⁸にも正常に採用されている。これまでの研究は、主に血管壁と白血球の相互作用に焦点を当てた後、私たち自身のグループは最近、評価引当として、マウス精巣挙筋標本を導入直接可視化し、定義微小環境⁹内の幹細胞内皮相互作用の定量分析のためのBLEツール。様々な幹細胞亜集団は、マウスのc-kit ⁺骨髄幹細胞および間葉系幹細胞、ならびにヒトCD 133 ⁺骨髄幹細胞を^10〜12を含む、このモデルを用いて研究されている。ドナー骨髄および可視化のための蛍光標識からの細胞単離後に、幹細胞は、選択的に遠隔の臓器内の任意の細胞の捕捉を回避し、大腿動脈を介して動脈注入を利用して精巣挙筋の微小循環に適用される。潜在的に、それぞれの設定値内の局所幹細胞の遊走を媒介する種々のケモカインは、単純な局所灌流法により標的組織に適用することができるので、精巣挙筋モデルが特に有用である。

Protocol

細胞単離後、プロトコル全体で約2時間かかります。

1。顕微準備

1. 標準化されたプロトコル^9,12に係るドナー骨髄および単離された亜集団の蛍光標識からの幹細胞の単離を行う細胞は、動物の動作が行われる時間の間休止することを許可する。蛍光標識のために我々はCFDA（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）をお勧めします。
2. ケタミン（75 mg / kgで）およびキシラジン（2.5 mg / kg）を用いて体重20〜25gの雄マウ​​スを麻酔。外科的手順および実験プロトコール全体を通して、麻酔補助剤によって維持されるべきである（最初の注射の10％、腹腔内）必要に応じて（通常、毎分30〜60）。
3. そっと右陰嚢の前面だけでなく、右太ももと脚の付け根を剃る。すべては湿らせた綿棒で髪を失って収集しています。プレキシガラスの観察ステージ上でマウスの腹側を上に置き、手数料を修正弾性ドレープを使用してT。ステージは、脚と陰嚢の両方を昇降するためのベースプレートの尾側端でベース板と第2板からなる、カスタムメイドされている。 37℃の体温を維持するために加温パッド上にステージを配置ステージ上で固定後、手術用顕微鏡の下で動物を配置し、10を使用して、以下の操作手順を実行します - 16倍の倍率に。
4. 鼠径部にまで右太もも、膝から大腿血管のちょうど前方の皮膚のはさみを使って最初の切開を行います。
5. 大腿動脈を特定し、周囲の軟組織から動脈を動員し、近位にそれに従ってください。焼灼器を使用して、左睾丸への大規模なブランチを特定し、カット。その後、左睾丸で表面的に滞在縫合を置く。穏やかな牽引力は、大腿動脈の近位のさらなる動員を促進する。
6. 近位の動員が完了した後、識別し、大規模なブランチをカット実行中mediall焼灼器による大腿部のY。その後、右大腿部の遠位部での大腿動脈を結紮。合字にやさしい牽引、さらに準備を支援します。
7. 再び近位大腿動脈に今の目を向けるなど近位にできるだけ動脈の周りに縫合糸を配置します。結び目を準備しますが、まだそれを接続しないでください。縫合糸に優しいトラクションを適用し、動脈よじれを作成します。
8. よじれを確立した後、動脈が慎重にmicroscissorを使用している切開。大腿静脈を損傷しないように特に注意してください。
9. 切開を介して製造マイクロカテーテル（内径0.28ミリメートル）を挿入します。カテーテルは、（0.9％塩化ナトリウム、NaCl）を脱気し、1 mlシリンジ挿入の前に接続されなければならない。
10. カテーテルの挿入が成功した後、慎重にカテーテルの通過を容易にするために、ねじれを緩めます。動脈血流は、カテーテル内ですぐに表示されるはずです。優しくカテーテルを数ミリメートルを進める前のよじれを超えてS。その後、カテーテルの固定のために準備合字を縛り付ける。
11. そっと正しい位置を確認するために、カテーテル（0.9％NaCl）にして吸引をフラッシュします。さらに運用段階にカテーテルを固定するためにテープの一部を使用してください。
12. 十分な固定後、精巣挙筋の次の準備ステップのために取ってカテーテルを入れた。血栓形成を防止するため、定期フラッシングとカテーテルごとに5〜10分間の吸引を適用します。
13. 右陰嚢に今注目を回して、右陰嚢の腹側面上の皮膚および筋膜を切断することによって切開する。どんな機器とその下の組織に触れないように注意してください。
14. 陰嚢の先端に鼠径倍と尾側まで切開を拡張します。
15. それに触れることなく、精巣挙袋上記の基本的なソフトで結合組織を慎重に分離します。精巣挙の先端部を特定し、SLにここに滞在縫合を配置ightly筋肉を伸ばす。優しく尾側と前方の筋肉を引っ張って筋肉の袋の下に今残っている軟組織を切除。
16. 結合組織から完全に分離した後、ハ​​サミで頭蓋端に1点で精巣挙袋を開きます。筋肉の先端部に、この開口部から下に切開を延長する。
17. その後、はさみを使って筋肉と精巣の間の残りの接続を切る、焼灼器を使用して睾丸と精巣挙をつなぐ小さな容器を密閉する。
18. 顕微鏡分野のうち、睾丸を脇に置きます。
19. 開かれた精巣挙は今、ステージの上に平らに産む。精巣挙筋組織を広げるために、組織の端に4 6-0プロレン滞在縫合糸を配置し、弾性ドレープでそれらを修正。これから連続的に1mlシリンジ（ 図1）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で組織を湿ら。
20. 今15分間休む調製を可能にする。その後注入微小血管のコントラスト強調のため左大腿動脈を介して、1％ローダミン-デキストラン0.05〜0.1 mlである。任意のケモカインや炎症剤がアプリケーションのために計画されている場合は、ここで局所的に1ミリリットルの注射器を使用して、それぞれの試薬で筋肉を湿らすべきである。対照実験の場合には、PBSで湿らせ続ける。

2。生体顕微鏡検査

1. 操作ステージに固定されたマウスを維持し、落射照明用に変更し、CCD（電荷結合素子）ビデオカメラに接続され、蛍光顕微鏡下で移動する。大腿動脈カテーテルを脱臼しないよう特に注意してください。
2. 水浸対物レンズを用いて実験を行う。
3. 精巣挙微小循環の十分な視覚化のために、細胞の注射の前に目標を調整した後、確率的にしっかりした幹細胞の接着の後の分析のために6毛細血管細静脈を定義します。
4. 蛍光標識された幹細胞を投与し、大腿動脈カテーテルを利用して5つの連続した注射剤との合計1mlシリンジで、注射当たり0.4×10 ⁶個の細胞で、200μlのPBSに溶解した。慎重に最初の注射前に細胞サンプルを振る。
5. レコードの幹細胞は、それによって典型的なセルラと組み合わせた内皮内層に沿った細胞の速度の50％以上の減少として「ローリング」を定義する、細胞注射の直後にローリング」棒と解放」運動を。ローリング幹細胞の計数およびすべての単一の注射後の観察の1分の間に事前定義された細静脈の距離を通過するすべての幹細胞を実行します。幹細胞ローリングの量は全て通過する細胞の割合として表される。ローリング細胞のようなランダムな簡単なテザリング現象を示す細胞をカウントされません。
6. 最後のセルの注射後の計数でしっかりと接着性幹細胞の数を決定し、目の計算された内皮表面に関連して金額を表現接着細胞/ mm ^2のようなE 6事前定義された細静脈（直径×長さ×π）。まだ細胞運動が30秒間検出されないときに強固な接着が考えられる。
7. 生体顕微鏡が完了した後、慎重に精巣挙筋を取り外し、後で分析（免疫組織化学や分子生物学）に対応して保管してください。頚椎脱臼により動物を生け贄に捧げる。幹細胞のローリングと企業内皮接着、ならびに赤血球速度（100mm /秒）、血管長さ（μm）、血管径（μm）を、壁のシェア率などの微小血管血行動態の定量化のための生体顕微鏡記録の解析（秒^-1）;画像処理ソフトを利用し、それぞれの実験組織処置を知らされていない研究者がオフラインで実行する必要があります。

Representative Results

一般的には、精巣挙筋の微小循環内の血管内皮と直接注入幹細胞または前駆細胞の相互作用はまれな事象であると毛細血管細静脈（直径30〜80ミクロン）で独占的に発生します。による蛍光標識圧延しっかりと付着幹細胞に明らかに観察細静脈（ 図2）における内因性白血球の循環から分離して定量化することができる。

血流速度と壁剪断速度で表される微小循環条件は、通常、異なるケモカイン処置（ 表1）を用いて各実験群の間で有意に異ならない。

炎症応答の異なるケモカインまたはメディエーターとの精巣挙筋組織の局所治療、 例えば SDF-1α（間質細胞由来因子-1α）またはTNF-α（腫瘍壊死因子-α）は、特定のマイルを模倣することが可能であるcroenvironmental条件。このような条件は、特定のケモカイン/メディエーターに応じて、異なる量の幹細胞-内皮細胞相互作用を増強適用し、幹細胞集団（ 図^{3）12 を}注射した。明らかに、幹細胞-内皮細胞相互作用のこれらの異なるパターンを定量化する可能性は、さらなる臨床試験に、これらの集団を前進する以前に、インビボで定義された微小環境内の特定の幹細胞集団の遊走能力の評価のために可能にする。

さらに、このような一酸化窒素欠乏症内皮機能に影響する特定の病態生理学的状態の影響は、ノックアウト動物⁹を用いて示されている。

図1。マウス精巣挙MUSにおける重要顕微段階（A〜F）のイラストその後の生体顕微鏡用CLEの準備。

図2。マウス精巣挙筋標本におけるc-KIT ⁺細胞の生体顕微鏡。血管内背景はローダミン - デキストランによって提供されます。 （AF）細静脈血管系（黒矢印）をローリングで6連続した一連の画像しっかりと付着した（白矢印）カルボキシ-フルオレセインD-アセテートスクシンイミジルエステルで標識されたc-kit ⁺細胞。 ラボ投資 、2008年、巻88。カミンスキー、A.、MA、N.、Donndorf、P. ら

図3。生体内の蛍光顕微鏡像に基づいてのc-kit ⁺細胞と内皮細胞間の相互作用の定量分析。 >（A）、SDF-1αに暴露されたマウス精巣挙筋の細静脈内皮上のc-kit ⁺細胞ローリングの数（すべて通過する細胞の割合で表される）、TNF-αまたはC-KIT ⁺に比べて両方の組み合わせをケモカインの前処理（コントロール）することなく細胞注入。一人でSDF-1αを用いた治療と、SDF-1α+ TNF-αの組み合わせは、ローリングのc-kit ⁺細胞の割合を増加させた。 （b）は、細静脈内皮内層の1mm ²あたりにしっかりと付着性のc-kit ⁺細胞の数が大幅にのみ、SDF-1α+ TNF-αの組み合わせで処理した後に増加している。 ±SEM（* P <0.05対対照）。 ラボ投資 、2008巻88は、平均値としてデータが表現されている。カミンスキー、A.、MA、N.、Donndorf、P. ら

マウスのタイプ	実験群	赤血球速度（100mm /秒）	壁剪断速度（秒-1）
野生型	コントロール	0.7±0.2	43±32
野生型	SDF-1α	0.5±0.2	51±31
野生型	TNF	0.4±0.2	45±24
野生型	SDF-1α+ TNFα	1.0±0.5	117±26

表1。ベースラインでのマウス精巣挙筋の細静脈中の赤血球速度と壁せん断速度 。分析は、SDF-1α、TNF-αで処理した後、野生型マウスの筋肉調製物中CapImageソフトウェア（Zeintl、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて行った。個々のグループ間の平均±SDの差が有意では認められなかったとしてデータが表現されている。 ら

Discussion

生体内蛍光顕微鏡検査は、直接視覚化および幹細胞、内皮相互作用の定量的な分析を可能にする。顕微露光および生体内視覚化技法はよく白血球 - 内皮相互作用および種々の化学成分の研究の間に選択的に単純な表面灌流技術によって標的組織に適用することができる確立されたので、精巣挙筋モデルは、特に有用である。による動きアーチファクトおよび重度画像ノイズが存在しないため、この特定のモデルは、他の生体内顕微鏡検査の設定値と比較して、細胞 - 細胞相互作用の視覚化のための最適条件を提供する。

モデルは、生体内で行われる初期の幹細胞動員のために、不可欠な微小環境の前提条件を明らかにすることができます。必要であれば、内因性白血球を検証するための陽性対照として機能し、幹細胞の挙動の原理を証明することができる。

jove_contentは">急性動物モデルを表現し、代わりに、静脈アプリケーションの直接動脈注入を利用して、慢性の細胞遊走モデルおよび/ ​​または全身の細胞送達の潜在的な限界-による遠隔臓器内の挟み込みに、例えば細胞の損失は-他には回避することができる急性の外科用組織外傷は、組織の活性化自体をある程度誘導する可能性がある一方で、あるので、非外傷性の外科的調製物は、精巣挙筋調製物を、以下の必須および安定した微小循環条件は、実験群で再現可能な様式の前の開始で達成される必要がある。

毛細血管細静脈および対照動物における生体顕微鏡録音の開始時に、周囲の組織への蛍光色素の大幅な漏れの中大規模な白血球の蓄積が存在することは、主要な外科的組織の外傷を示す。

しかし、細心PREPAを適用する場合でも、配給の技術は、様々な研究者から得られた結果は、わずかにベースライン組織の活性化が異なると必ずしも完全に比較することはできません。その後の実験は、可能な限り同じ研究者によって行われるべきであるのはこのためです。

組織を対象とする幹細胞動員の初期段階の分析と定量化のために設計された、現在のモデルは、明確な幹細胞の臓器の移植に関するステートメントを許可していません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500