Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Summary

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Abstract

In het tijdperk van intravasculaire celtoepassing protocollen in het kader van regeneratieve celtherapie, de onderliggende mechanismen van stamcellen migratie naar weefsel nonmarrow zijn nog niet volledig opgehelderd. We beschrijven hier de techniek van intravitale microscopie toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie in vivo. Intravitale microscopie van M. cremaster eerder geïntroduceerd in het gebied van inflammatoire onderzoek voor directe waarneming van leukocyten interactie met het vasculaire endotheel. Aangezien voldoende perifere stamcellen en celmigratie omvat Vertaald eerste stappen van rollend en stevige adhesie aan de endotheliale voering is het denkbaar de M. cremaster model toe te passen voor waarneming en kwantificering van de interactie van intravasculary toegediende stamcellen met het endotheel. Diverse chemische componenten selectief kan worden toegepast op het doel tafgifte door eenvoudige superfusie technieken is het mogelijk om essentiële microenvironmental randvoorwaarden vast te stellen, voor de eerste stamcelrekrutering plaatsvinden in een levend organisme buiten het beenmerg.

Introduction

Het doel van dit artikel is om de techniek van het opklaren (IVM) toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor directe observatie en analyse van perifere beenmerg stamcelmigratie beschrijven.

Het huidige concept van de stamcel gebaseerde weefsel en orgaan regeneratie betreft de homing van beenmerg afgeleide stamcellen naar het beschadigde weefsel ^1. Een cruciale stap voor een succesvolle stamcelmigratie bevat stamcellen interactie met de lokale endotheel binnen de benadeelde orgel gevolgd door transendotheliale migratie en uiteindelijk orgel innesteling ^2. Intravitale analyse van deze stamcellen - endotheelcelinteracties een ideaal parameter voor de kwantificering van een stamcel gebaseerde regeneratieve respons in verschillende pathofysiologische instellingen in vivo. Verder lijkt denkbaar dat in de toekomst intravitale analyse van het trekkende capaciteit specifieke stamcellen populations binnen gestandaardiseerde microcirculatie omgevingen, kunnen worden aangebracht voor het bevorderen van deze populaties aan verdere klinische testen.

Intravitale microscopie werd oorspronkelijk ontwikkeld voor waarneming en kwantificering van leukocyt-endotheelcel interacties in vivo in het gebied van inflammatoire onderzoek ^3. Eerste succesvolle opnames van intravitale microscopie studies werden gemeld door Cohnheim reeds in de 19e eeuw, het bestuderen van tongen en mesenteria kikkers 'onder een lichtmicroscoop ^4. Sinds zijn eerste gebruik IVM een enorme technische ontwikkeling en vandaag heeft ondergaan bepaalde essentiële componenten vormen voorwaarden om kwantitatieve IVM voeren: (i) weefsel preparaten die optische toegang mogelijk maken, (ii) moleculaire probes die kunnen worden gedetecteerd door een microscoop, (iii ) een microscoop gekoppeld aan een detectiesysteem en (iv) computer gebaseerde analysesystemen die parameters plaats kan halen uit de beelddataset ^4.

Een verscheidenheid van weefsel voorbereidingen is geïntroduceerd voor IVM studies waaronder de mesenteria en de lever van de muis en rat ^5, de dorsale huidplooi kamers van muis ⁶ en hamster, het konijn oor en de hamster wang zakje een paar te noemen.

In het volgende zullen we ons richten op de muis cremasterspier, wat een ideale weefsel voor intravitale observaties, als voorbereiding en visualisatie mogelijk door een goed gestandaardiseerde chirurgische ingreep, en in het algemeen geen problemen van bewegingsartefacten optreden. De open cremasterspier voorbereiding werd voor het eerst in de jaren 1970 gedragen door Baez en collega ^7. Oorspronkelijk beschreven voor ratten, is het succes vastgesteld ook de muis ^8. Na eerdere studies vooral was gericht op leukocyten interacties met de vaatwand, onze eigen groep onlangs de muis cremasterspier preparaat als waardenoriëntaties geïntroduceerdlijk hulpmiddel voor directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties binnen een gedefinieerde micro ^9. Verschillende stamcel subpopulaties bestudeerd gebruikmaking dit model, zoals muizen c-kit ⁺ beenmerg stamcellen en mesenchymale stamcellen, alsook menselijke CD 133 ⁺ beenmergstamcellen ^10-12. Na celisolatie van donor beenmerg en fluorescentielabelling voor visualisatie, worden de stamcellen selectief toegepast in de cremaster microcirculatie met behulp van een arteriële injectie via de slagader, waardoor elke cel beknelling binnen op afstand organen vermijden. Bovendien is de cremasterspier model is vooral handig omdat verschillende chemokines mogelijk bemiddelen lokale stamcelmigratie binnen de respectieve instellingen, kunnen worden plaatselijk door eenvoudige superfusie techniek toegepast op het te onderzoeken weefsel.

Protocol

Het gehele protocol na celisolatie duurt ongeveer 2 uur.

1. Microchirurgische Voorbereiding

1. Voer stamcelisolatie van de donor beenmerg en fluorescente labeling van de geïsoleerde subpopulatie volgens gestandaardiseerde protocollen ^9,12 Laat cellen rusten gedurende de tijd het dier wordt uitgevoerd. Voor fluorescentielabelling raden wij CFDA (carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester).
2. Verdoven mannelijke muizen gewicht van 20-25 g met ketamine (75 mg / kg) en xylazine (2,5 mg / kg). Gedurende de chirurgische procedures en experimentele protocollen moeten anesthesie gehandhaafd door supplementen (10% van de eerste injectie, ip) indien nodig (gewoonlijk 30-60 minuten).
3. Scheer voorzichtig de voorste aspect van de juiste scrotum evenals de rechterdij en lies. Verzamel alle haren te verliezen met een vochtig wattenstaafje. Plaats de muis ventrale zijde naar boven op een plexiglas waarneemplatform en bevestig de vergoedingt gebruik van elastische draperen. Het podium is op maat gemaakt, bestaande uit een basisplaat en een tweede plaat aan de caudale rand van de bodemplaat voor verheffing van beide benen en het scrotum. Plaats het toneel een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Na fixatie op het podium, plaats het dier onder een operatie microscoop en de volgende bewerking uit stappen met 10 - tot 16-voudige vergroting.
4. Maak de eerste incisie met behulp van huid schaar op de rechterdij, net anterior van de femorale schepen vanaf de knie tot aan de lies.
5. Identificeer de femorale slagader en volg het proximaal, het mobiliseren van de slagader van de omliggende weke delen. Identificeer en snijd een grote tak naar de linker testikel behulp thermocautery. Daarna plaatst u een verblijf hechtdraad oppervlakkig op de linker testikel. Gentle tractie zal vergemakkelijken verdere proximale mobilisatie van de slagader.
6. Na voltooiing van de proximale mobilisatie, identificeren en snijd een grote tak loopt medially in de dij door thermocautery. Daarna ligeren de femorale slagader in het distale gedeelte van de rechter dij. Gentle tractie op de ligatuur zal verdere voorbereiding helpen.
7. Draai aandacht nu het proximale femorale slagader opnieuw en plaats een hechtdraad rondom de arterie zo proximaal mogelijk. Bereid een knoop maar nog niet bind het naar beneden. Pas lichte tractie aan de hechtdraad en creëren een slagaderlijke knikken.
8. Na vaststelling van de knikken, incisie de slagader wordt voorzichtig met een microscissor. Wees extra voorzichtig de lies niet te beschadigen.
9. Plaats een voorbereide microcatheter (inwendige diameter 0,28 mm) via de incisie. De katheter moet deaired (0,9% natriumchloride, NaCl) en aangesloten op een 1 ml injectiespuit voor insertie.
10. Na succesvol inbrengen van de katheter, maak de capsule knikken om doorgang van de katheter vergemakkelijken. Arteriële bloedstroom moet onmiddellijk zichtbaar zijn binnen de katheter. Zachtjes vooraf de katheter een paar millimeters dan de vorige knikken. Daarna vastbinden het voorbereid rietbinder voor fixatie van de katheter.
11. Voorzichtig Spoel de katheter (0,9% NaCl) en zuig de juiste positie te bevestigen. Gebruik een stuk tape om de katheter verder te verzekeren om de bewerking fase.
12. Na adequate fixatie, zet de katheter opzij voor de volgende voorbereidende stappen van de cremasterspier. Solliciteer regelmatig spoelen en aspiratie van de katheter om de 5-10 minuten om stolselvorming te voorkomen.
13. Draai de aandacht nu naar rechts scrotum en maak een insnijding door het snijden van de huid en fascia boven de ventrale aspect van de juiste scrotum. Verzorgen het onderliggende weefsel niet aan te raken met alle instrumenten.
14. Verleng de incisie tot de lies vouw en caudaal naar het distale uiteinde van het scrotum.
15. Zorgvuldig aparte onderliggende zacht en bindweefsel boven de cremaster zak, zonder aan te raken. Identificeer het distale uiteinde van de cremaster en plaats hier een verblijf hechtdraad SLightly breiden de spier. Resect nu resterende zacht weefsel onder de spier zak door voorzichtig aan de spier caudaal en ventraal.
16. Na volledige scheiding van bindweefsel, opent de cremaster zak op een punt van de craniale rand met een schaar. Verleng de incisie van deze opening naar het distale uiteinde van de spier.
17. Dicht de kleine schip aansluiten van de testikel en de cremaster behulp thermocautery, daarna snijd de resterende verbindingen tussen de spieren en de testikel met een schaar.
18. Afleggen van de testikel, uit het veld microscopie.
19. De geopende cremaster ligt nu plat op het podium. Plaats vier 6-0 Prolene hechtingen verblijf aan de randen van het weefsel en bevestig ze met elastische laken om de cremasterspier weefsel verspreid. Vanaf nu continu bevochtigen van het weefsel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met een 1 ml injectiespuit (figuur 1).
20. Laat nu de voorbereiding om te rusten gedurende 15 minuten. Daarna injecteren0,05-0,1 ml van 1% Rhodamine-dextran via de linker dijslagader voor contrast verbetering van de microvasculatuur. Als een chemokines of inflammatoire middelen zijn gepland voor de toepassing, moet u nu lokaal bevochtig de spier met de respectieve reagens met een injectiespuit 1 ml. Bij een controle-experiment, verder bevochtigen met PBS.

2. Intravitale Microscopie

1. Houd de aan de operatie tijdstip vastgesteld muis en bewegen onder een fluorescentiemicroscoop aangepast voor epi-verlichting en verbonden met een CCD (ladingsgekoppelde inrichting) videocamera. Wees extra voorzichtig het dijbeenslagader katheter niet te ontwrichten.
2. Voeren experimenten met behulp van een water immersie objectief.
3. Na het aanpassen van de doelstelling voor voldoende visualisatie van de cremaster microcirculatie en vóór celinjectie, stochastisch definiëren zes postcapillaire venules voor latere analyse van de firma stamcel therapietrouw.
4. Dien-fluorescent gelabelde stamcellen,opgelost in 200 pl PBS, 0,4 x 10 ⁶ cellen per injectie met een totaal van vijf opeenvolgende injecties met behulp van de femorale slagader katheter en een 1 ml spuit. Zwenk de celmonster vóór de eerste injectie.
5. Record stamcellen direct rollen na celinjectie, waardoor definitie van "rollen" een vermindering van meer dan 50% van de mobiele snelheid langs de endotheliale bekleding in combinatie met typische cellulaire "stick release" bewegingen. Voer het tellen van het rollend stamcellen en alle stamcellen passeren van een vooraf gedefinieerde venular afstand gedurende 1 min van waarneming na elke injectie. De hoeveelheid stamcellen walsen wordt uitgedrukt als percentage van alle passerende cellen. Niet cellen tellen vertonen willekeurige kort tethering verschijnselen als rollende cellen.
6. Na de laatste injectie cel bepalen aantal stevig hechtende stamcellen tellen en voor de hoeveelheid ten opzichte van de berekende endotheliale oppervlak van ee zes voorgedefinieerde venulen (diameter x lengte x π) als hechtende cellen / mm ^2. Stevige adhesie wordt beschouwd als er geen celbeweging detecteerbaar gedurende 30 sec.
7. Na voltooiing van de microscopie intravitale verwijder voorzichtig de cremasterspier en opslaan in correspondentie met latere analyse (immunohistochemie of moleculaire biologie). Offer het dier door cervicale dislocatie. De analyse van intravitale microscopie opnames voor kwantificering van stamcellen walsen en stevig endotheliale adhesie, en microvasculaire hemodynamica, zoals rode bloedcellen snelheid (mm / s), scheepslengte (urn), diameter vat (urn), wand aandeel koers (sec ^-1); moet offline worden uitgevoerd door een onderzoeker geblindeerd aan de respectieve experimentele weefsel behandeling gebruik te maken van een image processing software.

Representative Results

In het algemeen, interactie van direct ingespoten stamcellen of voorlopercellen met het vasculair endotheel binnen de cremasterspier microcirculatie is een zeldzame gebeurtenis en komt uitsluitend in postcapillaire venulen (diameter: 30-80 pm). Door fluorescentie labeling rollen en stevig hechtende stamcellen duidelijk meetbaar zijn gescheiden van endogene circulerende leukocyten van de waargenomen venulen (figuur 2).

De microcirculatie voorwaarden voorgesteld door de snelheid van de bloedstroom en shear rate meestal niet significant verschillend tussen de respectieve experimentele groepen met verschillende chemokine behandeling (tabel 1).

Plaatselijke behandeling van de cremaster spierweefsel met verschillende chemokines of mediatoren van inflammatoire respons, zoals SDF-1α (stromale cellen afgeleide factor-1 alfa) of TNF-α (tumor necrose factor-alfa) in staat om na te bootsen specifieke microenvironmental voorwaarden. Dergelijke omstandigheden verbeteren stamcel-endotheelcel interacties in een ander bedrag, afhankelijk van de specifieke chemokine / mediator toegepast en de stamcelpopulatie geïnjecteerd (Figuur 3) ^12. De mogelijkheid om duidelijk te kwantificeren verschillende patronen van stamcel-endotheelcelinteracties maakt de evaluatie van het trekkende mogelijke specifieke stamcelpopulaties binnen gedefinieerde micromilieus in vivo voor het bevorderen deze populaties klinische proeven verder.

Bovendien is de invloed van bepaalde pathofysiologische aandoeningen van de endotheelfunctie, zoals stikstofoxide deficiëntie, is aangetoond door het gebruik van knockout dieren ^9.

Figuur 1. Illustratie van de belangrijkste microchirurgische stappen (af) in de muis cremaster muscle voorbereiding voor volgende opklaren.

Figuur 2. Intravitale microscopie van c-kit ⁺ cellen in een muizenmodel cremasterspier voorbereiding. Intravasculaire achtergrond wordt verschaft door rhodamine-dextran. (Af) Een reeks van zes opeenvolgende beelden met rollen (zwarte pijlen) en stevig hechtende (witte pijl) carboxy-fluoresceïne d-acetaat-succinimidylester gemerkt c-kit ⁺ cellen in de venulaire vasculatuur. Lab Invest, 2008, Vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al..

Figuur 3. Kwantitatieve analyse van de wisselwerking tussen de c-kit ⁺ cellen en endotheliale cellen op basis van intravitale fluorescentie microscopische beelden. (a) Het aantal rollen c-kit ⁺ cellen op venulaire endotheel (uitgedrukt in percentage van alle passerende cellen) in muizen cremaster spieren blootgesteld aan SDF-1α, TNF-α of een combinatie van beide in vergelijking met c-kit ⁺ celinjectie zonder chemokine voorbehandeling (controle). Behandeling met SDF-1α alleen en de combinatie van SDF-1α + TNF-α verhoogd percentage rollend c-kit ⁺ cellen. (B) Het aantal stevig hechtende c-kit ⁺ cellen per ^mm2 van venulaire endotheliale bekleding significant na behandeling met de combinatie van SDF-1α + TNF-α verhoogd. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± sem (* P <0,05 vs controle). Lab Invest, 2008, Vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al..

Muis Type	Experimentele Groep	rode bloedcellen snelheid(Mm / s)	shear rate (sec-1)
Wild-type	Controle	0.7 ± 0.2	43 ± 32
Wild-type	SDF-1α	0.5 ± 0.2	51 ± 31
Wild-type	TNF	0.4 ± 0.2	45 ± 24
Wild-type	SDF-1 α + α TNF	1.0 ± 0.5	117 ± 26

Tabel 1. Rode bloedcel snelheden en shear tarieven in venules van muizen cremaster spieren bij aanvang. Analyse werd uitgevoerd met CapImage Software (Zeintl, Heidelberg, Duitsland) in de spieren bereidingen van wildtype muizen na behandeling met SDF-1α, TNF-α. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde ± sd Verschillen tussen de afzonderlijke groepen niet gevonden significant. et al..

Discussion

Intravitale fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties. De cremasterspier model is bijzonder bruikbaar, omdat blootstelling en microchirurgische technieken intravitaal visualisatie zijn goed vastgesteld tijdens het onderzoek leukocyt-endotheel interacties en diverse chemische componenten kunnen door eenvoudige superfusieapparaat techniek selectief worden toegepast op het doelweefsel. Door de afwezigheid van bewegingsartefacten en ernstige beeldruis, dit model in vergelijking met andere intravitale microscopie-instellingen, een optimale voorwaarden voor visualisatie van cel-cel interacties.

Het model maakt het openbaren van essentieel microenvironmental randvoorwaarden voor werving eerste stamcellen te laten plaatsvinden in een levend organisme. Indien nodig, kan endogene leukocyten als positieve controles dienen voor validatie en bewijzen van principe van stamcellen gedrag.

jove_content "> Vertegenwoordigen een acute diermodel en gebruik te maken van directe arteriële injectie in plaats van veneuze toepassing, de mogelijke beperkingen van chronische cel migratie modellen en / of systemische cel levering - bijvoorbeeld cel verlies als gevolg van beknelling binnen op afstand organen - kan worden vermeden Aan de andere. hand acute chirurgische weefseltrauma waarschijnlijk een zekere weefsels activatie veroorzaakt zelf. dus een atraumatische chirurgische preparaat verplicht stabiele microcirculatie volgende voorwaarden cremasterspier voorbereiding nodig op reproduceerbare wijze voorafgaande beginnend met experimentele groepen te bereiken.

Een omvangrijke leukocyten accumulatie in de postcapillaire venulen en significante lekkage van de fluorescente kleurstof aan het omringende weefsel aan het begin van de intravitale microscopie opnames controledieren dan grote chirurgische weefseltrauma.

Maar zelfs bij de toepassing van zorgvuldige voorbereidingrantsoen technieken, de resultaten zijn afgeleid van verschillende onderzoekers zijn niet noodzakelijk volledig vergelijkbaar vanwege enigszins afwijkende basislijn weefsel activering. Daarom volgende experimenten worden uitgevoerd door dezelfde onderzoeker waar mogelijk.

Ontworpen voor de analyse en kwantificering van de eerste stappen van stamcelrekrutering om weefsels te richten, is het huidige model niet uitspraken over bepaalde stamcellen orgaan-implantatie mogelijk te maken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500