Intramikroskopi av mikrosirkulasjonen i mus Cremaster Muscle for analyse av perifer stamcelle Migration

Summary

Intramikroskopi av musen M. cremaster mikrosirkulasjonen tilbyr et unikt og godt standardisert in vivo modell for analyse av perifer benmarg stamceller migrasjon.

Abstract

I den æra av intravaskulære celle protokollene i sammenheng med regenerativ celleterapi, de underliggende mekanismene for stamcelle migrasjon til nonmarrow vev er ikke helt avklart. Vi beskriver her teknikken for intravital mikros anvendt på mus cremaster mikrosirkulasjonen for analyse av perifert benmarg stamcelle migrering in vivo. Intravital mikros M. cremaster tidligere er innført i banen av inflammatoriske forskning for direkte observasjon av leukocytter interaksjon med det vaskulære endothelium. Siden tilstrekkelig perifere stilk og stamceller migrasjon har de samme innledende skritt av rullende langs og fast vedheft på endothelial fôr det er tenkelig å bruke M. cremaster modell for observasjon og kvantifisering av samspillet intravasculary administreres stamceller med endotelet. Ettersom forskjellige kjemiske komponenter kan selektivt påføres mot målet tproblemet ved enkle superfusjonsteknikker, er det mulig å etablere nødvendige microenviron forutsetninger, for innledende stamcelle rekruttering til å finne sted i en levende organisme utenfor benmargen.

Introduction

Hensikten med den foreliggende artikkelen er å beskrive teknikken for intravital mikroskopi (IVM) anvendt på mus cremaster mikrosirkulasjonen for direkte observasjon og analyse av perifert benmarg stamcelle migrasjon.

Den nåværende konseptet med stamcellebaserte vev og organ gjenfødelse innebærer homing av benmarg avledet stamceller til det skadde vevet ^en. Et viktig skritt for vellykket stamcelle migrasjon inkluderer stamcelle samspill med det lokale endotelet innenfor den skadde organ fulgt av transendothelial migrasjon og til slutt orgel engraftment ^to. Intravital analyse av disse stamcelle - endoteliale celle interaksjoner danner et ideelt parameter for kvantifisering av en stamcelle basert regenerativ respons på forskjellige patofysiologiske innstillinger in vivo. Videre synes det tenkes, at i fremtiden, intravital analyse av den vandrende antall spesifikke stamcelle populations innenfor standardiserte microcirculatory miljøer, kanskje før fremme disse populasjonene til ytterligere klinisk testing brukes.

Intravital mikroskopi ble opprinnelig utviklet for observasjon og kvantifisering av leukocytt-endotel-celle interaksjoner in vivo i feltet av inflammatorisk forskning ^3.. Første vellykkede opptak av intramikroskopi studier ble rapportert av Cohnheim allerede på 19-tallet, studerte frosker tunger og mesenteries under et lysmikroskop ^fire. Siden første gangs bruk IVM har gjennomgått en enorm teknisk utvikling og i dag bestemte essensielle komponenter danner forutsetninger for å utføre kvantitative IVM: (i) vevspreparater som tillater optisk tilgang, (ii) molekylære prober som kan oppdages av et mikroskop, (iii ) et mikroskop koblet til et deteksjonssystem, og (iv) datamaskinbasert analysesystemer som kan trekke ut parametere av interesse fra bildedataenesatt ^fire.

En rekke vevspreparater har blitt introdusert for IVM studier samt mesenteries og lever av mus og rotter ^5, de rygg skinfold kamre mus ⁶ og hamster, kanin øret og hamster kinnet posen for å nevne noen.

Men i det følgende vil vi fokusere på musen cremaster muskelen, som representerer en ideell vev for intra observasjoner, som forberedelse og visualisering er mulig ved en godt standardisert kirurgisk prosedyre, og generelt oppstår ingen problemer med bevegelse gjenstander. Den åpne cremaster muskel forberedelse ble gjennomført for første gang i 1970 av Baez og kolleger ^7. Opprinnelig beskrevet for rotter, har det blitt tatt i bruk med hell også til muse ^8.. Etter tidligere studier hadde i hovedsak fokusert på leukocytter interaksjoner med åreveggen, vår egen gruppe nylig introduserte musen cremaster muskel forberedelse som verdsetbart verktøy for direkte visualisering og kvantitativ analyse av stamcelle-endotel interaksjoner innenfor en definert mikromiljøet ^ni. Forskjellige stamcellepopulasjoner er blitt studert å benytte denne modellen, som blant annet murine c-kit ⁺ benmarg stamcelle-og mesenkymale stamceller, så vel som human CD 133 ⁺ benmarg stamceller ^10-12. Etter celleisolasjon fra donor benmarg og fluorescerende merking for visualisering, har stamcellene selektivt anbringes i cremaster mikrosirkulasjon ved anvendelse av en arteriell injeksjon via den femorale arterie, og dermed unngå en hvilken som helst celle innesperring innen fjerntliggende organer. Videre er cremaster muskel modellen spesielt nyttige, siden forskjellige kjemokiner potensielt medierer lokale stamcelle migrering innenfor de respektive innstillinger, kan bli topikalt til målvevet ved enkel superfusjonsteknikk.

Protocol

Hele protokollen etter celleisolasjon tar ca 2 timer.

En. Mikro Forberedelse

1. Utfør stamcelle isolert fra donor benmarg og fluorescerende merking av isolerte subpopulasjon i henhold til standard protokoller ^9,12 tillater cellene å hvile under den tid dyret operasjonen er utført. For fluorescerende merking anbefaler vi CFDA (Carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester).
2. Anesthetize en hannmus som veier 20 til 25 g med ketamin (75 mg / kg) og xylazin (2,5 mg / kg). Gjennom de kirurgiske prosedyrer og eksperimentelle protokoller, bør anestesi opprettholdes av kosttilskudd (10% av første injeksjon, ip) etter behov (vanligvis hver 30-60 min).
3. Barber forsiktig fremre aspekt av det riktige pungen så vel som den høyre lår-og lysken. Samle alle mister håret med en fuktet bomullspinne. Plasser musen ventral siden opp på et plexiglass visning scenen og fikse gebyrt ved hjelp av elastisk drapere. Denne fasen er skreddersydd, bestående av en bunnplate, og en andre plate i den kaudale kanten av bunnplaten for heving av begge ben og pung. Plasser fasen på en varmepute for å holde kroppstemperaturen på 37 ° C. Etter fiksering på scenen, plasserer dyret under en operasjon mikroskop og utføre følgende driftsprosedyrer ved hjelp av 10 - til 16-fold forstørrelse.
4. Gjør den første innsnitt bruke hud saks på høyre lår, bare anterior av femoral fartøy fra kneet til å lysken.
5. Identifiser lårarterie og følg den proximally, mobiliserer arterien fra omkringliggende bløtvev. Identifisere og kutte en stor gren til venstre testikkel ved hjelp thermocautery. Deretter plasserer et opphold sutur overfladisk på venstre testikkel. Lett trekkraft vil legge til rette for ytterligere proksimale mobilisering av lårarterie.
6. Etter gjennomføringen av den proksimale mobilisering, identifisere og kutte en stor gren kjører medially på låret etter thermocautery. Deretter ligere lårarterien i den distale delen av den høyre lår. Lett trekkraft på ligaturen vil hjelpe ytterligere forberedelser.
7. Slå oppmerksomhet nå til den proksimale lårarterie igjen og plassere en sutur rundt arterien som proksimalt som mulig. Forbered en knute, men ikke tie det ned ennå. Påfør forsiktig trekkraft til sutur og skape en arteriell vridning.
8. Etter etablering av knekk, incise arterien er forsiktig med en microscissor. Vis forsiktighet for ikke å skade femoralvenepunksjon.
9. Sett inn en forberedt microcatheter (indre diameter 0,28 mm) via snittet. Kateteret må være avluftet (0,9% natriumklorid, NaCl) og koblet til en 1 ml sprøyte før innsetting.
10. Etter fullført innføring av kateteret, løsnes forsiktig knekk for å lette passasje av kateteret. Arterielle blodstrømmen bør være synlige inne i kateteret. Forsiktig avansere kateteret noen millimeters forbi det forrige vridning. Deretter tie nedover fremstilt ligatur for fiksering av kateteret.
11. Skylles kateteret (0,9% NaCl) og aspireres forsiktig for å bekrefte korrekt plassering. Bruk et stykke tape for ytterligere å feste kateteret til operasjonstrinn.
12. Etter tilfredsstillende fiksering, sett kateteret til side for følgende frem trinnene i cremaster muskel. Påfør regelmessig spyling og aspirasjon av kateteret hver 5-10 min for å forhindre dannelse av blodpropper.
13. Drei oppmerksomheten nå mot høyre pungen og gjøre et snitt ved å skjære huden og fascia over den ventrale del av den rette pungen. Pass på å ikke berøre den underliggende vev med noen instrumenter.
14. Forleng innsnitt opptil inguinal fold og kaudalt til den distale ende av pungen.
15. Nøye separat underliggende myk og bindevev over cremaster sekk, uten å berøre den. Identifisere den distale ende av cremaster, og plassere et opphold sutur her å slforsiktig skrå forlenge muskelen. Resect nå resterende bløtvev under muskelen sekk ved å trekke forsiktig i muskelen caudally og anteriorly.
16. Etter fullstendig atskillelse fra bindevev, åpne cremaster sekk på ett punkt på kranie kanten med saks. Forleng innsnitt fra denne åpning ned til den distale ende av muskelen.
17. Tett lite fartøy forbinder testikkelen og cremaster hjelp thermocautery, deretter kutte de resterende sammenhenger mellom muskel og testikkelen med saks.
18. Legge til side testikkelen, ut av mikroskopi-feltet.
19. Den åpnet cremaster legger nå flat på scenen. Plasser fire 6-0 prolen opphold suturer på kantene av vevet og feste dem med elastisk drape for å spre cremaster muskelvev. Fra nå av kontinuerlig fukte vev med fosfat-bufret saltløsning (PBS) under anvendelse av en 1 ml sprøyte (figur 1).
20. Tillat nå fremstillingen for å hvile i 15 min. Deretter injisere0,05-0,1 ml 1% Rhodamin-dekstran via venstre lårarterie for kontrastforbedring av microvasculature. Hvis noen chemokines eller inflammatorisk agenter er planlagt for søknaden, bør du nå topically fukte muskelen med den respektive reagens ved hjelp av en 1 ml sprøyte. I tilfelle av et kontrolleksperiment, fortsetter fukting med PBS.

2. Intramikros

1. Hold musen fast på drift scenen og bevege seg under en fluorescens mikroskop modifisert for epi-belysning og koblet til en CCD (charge-coupled device) videokameraet. Vis forsiktighet for ikke å forrykke lårarterie kateter.
2. Gjennomføre forsøk med en vannimmersjonsobjektiv.
3. Når du har justert målsettingen for tilstrekkelig visualisering av cremaster mikrosirkulasjonen og før celle injeksjon, stokastisk definere seks postcapillary venules for senere analyse av firmaet stamcelle tilslutning.
4. Administrer fluorescensmerkede stamceller,oppløst i 200 ul PBS, på 0,4 x 10 ⁶ celler pr injeksjon, med totalt fem påfølgende injeksjoner utnytte lårarterien kateteret, og en 1 ml sprøyte. Riste celleprøve nøye før første injeksjon.
5. Record stamcelle rulle umiddelbart etter celleinjeksjon, for derved å definere "rullende" som en mer enn 50% reduksjon av cellehastighet langs endotelial foring i kombinasjon med typiske cellulære "stick-og slipp" bevegelser. Utfør telling av rullende stamceller og alle stamceller passerer en forhåndsdefinert venular avstand under 1 min av observasjon etter hver enkelt injeksjon. Mengden av stamcelle rullende er uttrykt som prosentandel av alle celler som passerer. Ikke telle celler stiller tilfeldige korte tethering fenomener som rullende celler.
6. Etter den siste cellen injeksjon bestemme antall fast tilhenger stamceller ved å telle og uttrykke mengden i forhold til beregnet endothelial overflaten av the seks forhåndsdefinerte venules (diameter x lengde x π) som heftende celler / mm ^2. Firm vedheft regnes når ingen celle bevegelse er synlig for 30 sek.
7. Etter gjennomføringen av den intramikros fjerne nøye cremaster muskel og lagre den i korrespondanse til senere analyse (immunhistokjemi eller molekylær biologi). Ofre dyret ved halshugging. Analysen av intravital mikros opptak for kvantifisering av stamcelle rullende og fast endotelial adhesjon, så vel som mikrovaskulære hemodynamikk, slik som røde blodceller hastighet (mm / s), fartøylengde (mm), fartøy diameter (um), vegg dele frekvensen (sek ^-1), bør utføres i frakoblet modus ved en etterforsker blindet for den respektive eksperimentell vev behandling utnytte et bildebehandlingsprogram.

Representative Results

Generelt, samspill av direkte injisert stamceller eller stamceller med blodåreendotelets innenfor cremaster muskel mikrosirkulasjonen er en sjelden begivenhet og forekommer utelukkende i postcapillary venules (diameter: 30-80 mikrometer). På grunn av fluorescens-merking rullende og fast heftende stamceller kan tydelig kvantifisert i separasjon fra endogene sirkulerende leukocytter i de observerte venules (figur 2).

De mikrosirkulasjonsforhold som representeres av blodstrømningshastigheten og veggskjærhastighet vanligvis ikke signifikant forskjellig mellom de respektive forsøksgrupper med forskjellige kjemokin-behandling (tabell 1).

Lokal behandling av cremaster muskelvev med forskjellige kjemokiner eller formidlere av inflammatorisk respons, er f.eks SDF-1α (stromal celle-avledet faktor-1 alfa) eller TNF-α (tumornekrosefaktor-alfa) i stand til å etterligne bestemt microenvironmental forhold. Slike tilstander forbedre stamcelle-endotelial celle interaksjoner i en annen mengde, avhengig av den spesifikke chemokine / mediator anvendt og stammen cellepopulasjon injisert (figur 3) ^12. Muligheten til å tydelig kvantifisere disse ulike mønstre av stamcelle-endothelial celle interaksjoner gjør for evaluering av den vandrende potensialet av spesifikke stamceller populasjoner innenfor definerte microenvironments in vivo før fremme disse populasjonene til ytterligere klinisk testing.

Videre er virkningen av visse patofysiologiske tilstander som påvirker endotelial funksjon, slik som salpetersyre-oksyd mangel, har blitt vist ved bruk av knockout-dyrene ^9.

Figur 1. Illustrasjon av de viktigste mikro trinn (AF) i muse cremaster muscle forberedelse for senere intramikroskopi.

Figur 2. Intravital mikroskopi av c-kit ⁺ celler i en murine cremaster muskel forberedelse. Intravaskulær bakgrunn er levert av rhodamin-dekstran. (Af) En serie på seks etterfølgende bilder med rullende (svarte piler) og fast tilhenger (hvit pil) karboksybeskyt-fluorescein d-acetat succinimidylester-merket c-kit ⁺ celler i venular blodkar. Lab Invest, 2008, vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Figur 3. Kvantitativ analyse av interaksjoner mellom c-kit ⁺ celle og endotelceller basert på intra fluorescens mikroskopiske bilder. (a) Antallet rulle c-kit ^+-celler på venular endotel (uttrykt i prosent i alle celler som passerer) i murine cremaster musklene utsettes for SDF-1α, TNF-α eller en kombinasjon av begge deler i forhold til c-kit ⁺ celle injeksjon uten chemokine forbehandling (kontroll). Behandling med SDF-1α alene og kombinasjonen av SDF-1α + TNF-α økt prosentandel av rullende c-kit ⁺ celler. (B) Antallet fast heft c-kit ^+-celler pr mm ² av venular endoteliale foring er betydelig økt kun etter behandling med en kombinasjon av SDF-1α + TNF-α. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* P <0,05 vs kontroll). Lab Invest, 2008, vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Musetype	Eksperimentgruppen	røde blodlegemer hastighet(Mm / sek)	veggen skjærhastighet (sek -1)
Villtype	Kontroll	0.7 ± 0.2	43 ± 32
Villtype	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Villtype	TNF	0.4 ± 0.2	45 ± 24
Villtype	SDF-1 α + TNF α	1,0 ± 0,5	117 ± 26

Tabell 1. Røde blodlegemer hastigheter og vegg skjær priser i venules av murine Cremaster muskler ved baseline. Analysen er utført ved hjelp av CapImage programvare (Zeintl, Heidelberg, Tyskland) i muskel preparater av villtype mus etter behandling med SDF-1α, TNF-α. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± sd Forskjeller mellom de enkelte gruppene ikke ble funnet å være signifikant. et al.

Discussion

Intra fluorescens mikroskopi tillater direkte visualisering og kvantitativ analyse av stamcelle-endotel interaksjoner. Den cremaster muskel-modellen er særlig nyttig, siden mikro eksponering og teknikker intravital visualisering er blitt vel etablert i løpet av forskningen på leukocytt-endotel interaksjoner og forskjellige kjemiske komponenter kan selektivt påføres på målvevet ved enkel superfusjonsteknikk. På grunn av fravær av bevegelse gjenstander og alvorlig bildestøy, denne modellen, i forhold til andre intra-mikros innstillinger, gir optimale forhold for visualisering av celle-celle interaksjoner.

Modellen gjør det mulig å avsløre viktige microenviron forutsetninger, for første stamcelle rekruttering skal skje i en levende organisme. Om nødvendig, kan endogene leukocytter tjene som positive kontroller for validering og bevise av prinsippet om stamcelle atferd.

jove_content "> representerer en akutt dyremodell og utnytte direkte arteriell injeksjon i stedet for venøs søknad, de potensielle begrensninger av kroniske celle migrasjon modeller og / eller systemisk celle levering - f.eks celle tap på grunn av entrapment innenfor eksterne organer - kan unngås På den andre. side er akutte kirurgiske vevskader sannsynlighet for å fremkalle en viss grad av vev aktivering verket. Derfor er en atraumatisk kirurgiske forberedelse obligatorisk og stabil microcirculatory betingelser følgende cremaster muskel preparatet må oppnås på en reproduserbar måte før start med forsøksgruppene.

Forekomst av omfattende leucocyte opphopning innenfor postcapillary venules og betydelig lekkasje av fluorescerende fargestoff til omkringliggende vev i begynnelsen av intramikros opptakene i kontroll dyr indikerer større kirurgisk vev traumer.

Men selv når du søker grundig forberedelsesjonsteknikk, resultater avledet fra forskjellige undersøkere er ikke nødvendigvis helt sammenlign grunn av noe varierende utgangsvevet aktivering. Dette er grunnen til at de påfølgende eksperimenter skal utføres av den samme undersøker når det er mulig.

Designet for analyse og kvantifisering av de første trinnene av stamcelle rekruttering til målet vev, gjør dagens modell ikke tillate uttalelser om klar stamcelle organ-engraftment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500