מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

Summary

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

Abstract

בעידן של פרוטוקולי יישום תא intravascular בהקשר של טיפול בתאי משובי, המנגנונים של נדידת תאי גזע לרקמות nonmarrow לא הובהרו לחלוטין. אנו מתארים כאן את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital להחיל את זרימת דם Cremaster עכבר לניתוח של נדידת תאי גזע היקפית מח עצם בגוף חי. מיקרוסקופיה Intravital של Cremaster מ 'כבר הציגה בעבר בתחום של מחקר דלקתי לתצפית ישירה של האינטראקציה יקוציט עם האנדותל של כלי הדם. מאז גזע היקפי מספיק ונדידת תאי אב כוללים שלבים ראשוניים דומים של מתגלגל לאורך והידבקות משרד בהאנדותל המצפה את זה מתקבל על הדעת להחיל את מודל Cremaster מ 'לתצפית וכימות של האינטראקציה של תאי גזע מנוהלים intravasculary עם האנדותל. כרכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי כדי לא היעדנושא על ידי טכניקות superfusion פשוט, זה אפשרי להקים תנאים מוקדמים microenvironmental חיוניים, לגיוס תאי גזע ראשוני להתקיים באורגניזם חי מחוץ למח העצם.

Introduction

מטרתו של המאמר הנוכחי היא לתאר את הטכניקה של מיקרוסקופיה intravital (IVM) להחיל על זרימת דם Cremaster עכבר להתבוננות וניתוח ישירים של נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

התחדשות רקמות ואיברים המבוסס הקונספט הנוכחי של תאי גזע כרוך הביות של תאי גזע שמקורם במח עצם לרקמות נפצעו ^1. צעד חיוני לנדידת תאי גזע מוצלחת כולל גזע אינטראקציה עם תא האנדותל המקומי בתוך האיבר הפצוע ואחרי הגירת transendothelial וסופו של דבר האיבר engraftment ^2. ניתוח Intravital של תאי גזע אלה - אינטראקציות תא האנדותל מהווה פרמטר אידיאלי לכימות של תגובת משובי תאי גזע מבוססת בהגדרות pathophysiological שונות in vivo. יתר על כן, זה נראה מתקבל על הדעת, כי, בעתיד, ניתוח intravital של יכולת הנדידה של תאי גזע הספציפי populations בתוך סביבות microcirculatory סטנדרטיות, עשוי להיות מיושם לפני קידום אוכלוסיות אלה לבדיקה קלינית נוספת.

מיקרוסקופיה Intravital פותחה בתחילה עבור התצפית וכימות של אינטראקציה תא יקוציט-אנדותל in vivo בתחום המחקר דלקתי ^3. הקלטות מוצלחות הראשונות של מחקרי מיקרוסקופיה intravital דווחו על ידי Cohnheim כבר במאה ה -19, לומדות לשון וmesenteries צפרדעים תחת מיקרוסקופ אור ^4. מאז השימוש הראשון שלה IVM עבר פיתוח טכני אדיר והיום רכיבים חיוניים מסוימים יוצרים תנאים מוקדמים על מנת לבצע IVM כמותיים: הכנות (i) רקמה המאפשרות גישה אופטית, (ii) בדיקות מולקולריות שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ, (iii ) מיקרוסקופ המחובר למערכת גילוי וכן (iv) ניתוח מערכות מחשב מבוסס שיכול לחלץ פרמטרים של עניין מנתוני התמונהלהגדיר ^4.

מגוון רחב של הכנות רקמות כבר הציג ללימודי IVM כולל mesenteries והכבד של העכבר והחולדה ^5, תאי skinfold הגב של עכבר ^ו6 אוגר, אוזן הארנב וכיס הלחי אוגר עד כמה שם.

עם זאת, בחלק הבא אנו נתמקד בשריר Cremaster העכבר, המייצג את הרקמה אידיאלית לתצפיות intravital, כהכנה להדמיה הן אפשריות על ידי הליך כירורגי סטנדרטי היטב, ובאופן כללי אין בעיות של חפצי תנועה להתרחש. הכנת השרירים Cremaster הפתוחה בוצעה בפעם הראשונה ב1970s ידי אאז ועמיתיו ^7. תאר במקור עבור חולדות, זה כבר אימץ בהצלחה גם לעכבר ^8. לאחר המחקרים קודמים התמקדו בעיקר באינטראקציות יקוציט עם קיר הכלי, הקבוצה שלנו הציגה לאחרונה את הכנת השרירים Cremaster העכבר כvaluaכלי ble להדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע בתוך microenvironment מוגדר ^9. אוכלוסיות תאי גזע שונות נחקרו ניצול מודל זה, כולל c-kit עכברי ⁺ בתאי גזע במח עצם ותאי גזע mesenchymal, כמו גם תקליטורי אדם תאי גזע במח עצם 133 ^{+ 10-12.} בעקבות בידוד תא ממח עצם מתורם וניאון תיוג להדמיה, תאי הגזע מיושמים באופן סלקטיבי לזרימת דם Cremaster ניצול הזרקת עורקים דרך עורק הירך, ובכך להימנע מכל מלכודת תא בתוך איברים מרוחקים. יתר על כן, מודל שריר Cremaster שימושי במיוחד מאז כמוקינים שונים שעלולים להיות מתווכים נדידת תאי גזע מקומית בתוך ההגדרות המתאימות, ניתן למריחה על עור לרקמות המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה.

Protocol

כל הפרוטוקול לאחר בידוד התא לוקח כ 2 שעות.

1. Microsurgical הכנה

1. לבצע בידוד בתאי גזע ממח עצם מתורם וסימון ניאון של subpopulation המבודד על פי פרוטוקולים סטנדרטיים ^9,12 אפשר תאים לנוח בזמן המבצע בבעלי החיים מתבצע. לניאון תיוג אנו ממליצים CFDA (succinimidyl אסתר diacetate Carboxyfluorescein).
2. הרדימי במשקל גרם 20-25 עם קטמין (75 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (2.5 מ"ג / קילוגרם) עכבר זכר. לאורך כל ההליכים כירורגיים ופרוטוקולים ניסיוניים, הרדמה צריכה להיות מתוחזק על ידי תוספים (10% מהזרקה ראשונית, ip) לפי צורך (בדרך כלל כל 30-60 דק ').
3. לגלח בעדינות את ההיבט הקדמי של כיס האשכים תקין, כמו גם את הירך ומפשעה הימנית. לאסוף את כל לאבד את השיער עם מקלון צמר גפן טבולה. הנח את צד הגחון העכבר על שלב צפייה פרספקס ולתקן את התשלוםלא באמצעות וילון אלסטי. הבמה מחוייט, בהיקף של צלחת בסיס וצלחת שנייה בקצה הזנב של צלחת הבסיס לגובה של שני רגליים וצק האשכים. מניחים את הבמה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף על 37 ° C. לאחר קיבוע על הבמה, המקום חי תחת מיקרוסקופ פעולה ולבצע את שלבי הפעולה הבאים באמצעות 10 - להגדלת 16 פי.
4. הפוך את החתך הראשוני באמצעות מספריים עור בשוק הימין, רק הקדמי של כלי הירך מהברך ועד למפשעה.
5. זהה את עורק הירך ובצע אותה proximally, וגייס את העורק מרקמות רכות. לזהות ולחתוך סניף גדול לאשך השמאלי באמצעות thermocautery. לאחר מכן למקם את תפר שהות באופן שטחי באשך השמאלי. מתיחה עדינה תאפשר גיוס הפרוקסימלי נוסף של עורק הירך.
6. לאחר השלמת הגיוס הפרוקסימלי, לזהות ולחתוך mediall סניף פועל גדולy בירך על ידי thermocautery. לאחר מכן לקשור את עורק הירך בחלקו האחורי של ירך ימין. מתיחה עדינה על המייתר תסייע הכנה נוספת.
7. להפנות את תשומת לב החברה לעורק הירך הפרוקסימלי שוב ולמקם את תפר סביב העורק כproximally ככל האפשר. הכן את קשר אבל לא לקשור את זה עדיין. החל מתיחה עדינה לתפר וליצור מסתלסלים בעורקים.
8. לאחר הקמת מסתלסלת, לחתוך את העורק באמצעות microscissor בזהירות. קח טיפול מיוחד שלא לפגוע בעורק הירך.
9. הכנס microcatheter מוכן (קוטר פנימי 0.28 מ"מ) דרך החתך. קטטר יש deaired (כלוריד 0.9% נתרן, NaCl) ומחובר לכניסה לפני מזרק 1 מיליליטר.
10. לאחר כניסה מוצלחת של קטטר, לשחרר בזהירות מסתלסלת על מנת להקל על המעבר של קטטר. זרימת דם בעורקים צריכה להיות גלויה באופן מיידי בתוך קטטר. בעדינות לקדם את הקטטר כמה מילימטרשל מעבר למסתלסל הקודם. לאחר מכן, לקשור את המייתר מוכן לקיבעון של הקטטר.
11. בעדינות לשטוף את הצנתר (0.9% NaCl) ולשאוב כדי לאשר את המיקום נכון. השתמש בנייר דבק כדי להבטיח עוד יותר את הצנתר לשלב הפעולה.
12. לאחר קיבוע נאות, לשים את הקטטר בצד לשלבי ההכנה הבאה של שריר Cremaster. החל שטיפה ושאיפה של קטטר כל דקות 5-10 קבועות על מנת למנוע היווצרות קריש דם.
13. להפנות את תשומת לב החברה לצק האשכים תקין ועושה חתך על ידי חיתוך העור וfascia מעל היבט הגחון של שק האשכים תקין. יש להיזהר שלא לגעת ברקמה הבסיסית עם כל מכשירים.
14. להאריך את החתך עד לקפל מפשעתי וcaudally לקצה הדיסטלי של שק האשכים.
15. רקמה נפרדת זהירות בסיסית רכה וחיבור מעל שק Cremaster, מבלי לגעת בו. זהה את הקצה הדיסטלי של Cremaster, ולמקם את תפר שהות כאן כדי SLightly להאריך את השרירים. לכרות עם החברה רקמות רכות שנותרו מתחת לשק השריר על ידי משייכתו בעדינות את שריר caudally ו anteriorly.
16. לאחר הפרדה מוחלטת מרקמות חיבור, פתח את שק Cremaster בנקודה אחת על קצה הגולגולת באמצעות מספריים. להאריך את החתך מפתיחה למטה זה לקצה הדיסטלי של השריר.
17. לאטום את כלי השיט הקטן המחבר את האשך וCremaster באמצעות thermocautery, לאחר מכן לחתוך את הקשרים שנותרו בין השרירים והאשך באמצעות מספריים.
18. להניח בצד האשך, מתוך השדה במיקרוסקופ.
19. Cremaster נפתח כעת מניח שטוח על הבמה. הנח ארבעה 6-0 תפרי שהות Prolene בקצוות של הרקמה ולתקן אותן עם וילון אלסטי כדי להפיץ את רקמת שריר Cremaster. מעתה והלאה ברציפות ללחלח את הרקמות שבנאגר מלוח פוספט (PBS) באמצעות מזרק 1 מיליליטר (איור 1).
20. אפשר לחברת ההכנה למנוחה ל15 דקות. לאחר מכן להזריק0.05-0.1 מיליליטר של 1% Rhodamine-Dextran דרך עורק הירך השמאלי להגברת הניגודיות של נימי הדם. אם כל כמוקינים או סוכנים דלקתיים מתוכננים ליישום, אתה צריך עכשיו למריחה ללחלח את השריר עם מגיב בהתאמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר. במקרה של ניסוי בקרה, ימשיך הרטבה עם PBS.

2. מיקרוסקופית Intravital

1. שמור על העכבר קבוע בשלב הפעולה ולהעביר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הותאם לעלית תאורה ומחובר לCCD (מכשיר תשלום מצמידים) מצלמת וידאו. קח טיפול מיוחד שלא לנקוע את הקטטר עורק הירך.
2. לבצע ניסויים באמצעות מטרת טבילה במים.
3. לאחר ההתאמה האובייקטיבית להדמיה מספקת של זרימת דם Cremaster ולפני הזרקת תאים, stochastically להגדיר שש venules postcapillary לניתוח מאוחר יותר של דבקות תאי גזע איתנה.
4. לנהל בתאי גזע שכותרתו ניאון,מומס ב200 μl PBS, ב0.4 x 10 ⁶ תאים לכל הזרקה, עם סך של חמש זריקות רצופות ניצול צנתר עורק הירך ומזרק 1 מיליליטר. לנער בזהירות את מדגם התא לפני הזריקה הראשונה.
5. תאי גזע שיא מתגלגלים מייד לאחר הזרקת תאים, ובכך מגדירים את "גלגול" כהפחתה של יותר מ -50% מתא מהירות לאורך אנדותל הציפוי הפנימי בשילוב עם טיפוסי סלולארי "מקל ולשחרר את" תנועות. לבצע ספירה של תאי גזע מתגלגלים וכל תאי הגזע עוברים מרחק venular מוגדר מראש במהלך 1 דקות של ההתבוננות הבאה כל זריקה. כמות מתגלגל בתאי הגזע באה לידי ביטוי כאחוז מכל התאים שעוברים. אל תסמכו תאים מציגים תופעות קשירה קצרות אקראיות כמו תאים מתגלגלים.
6. בעקבות הזרקת התא האחרונה לקבוע את מספר תאי גזע חסיד בחוזקה על ידי ספירה ולהביע את הסכום ביחס למשטח אנדותל המחושב של הדואר שש venules המוגדרת מראש (π x אורך x קוטר) כתאים חסיד / ² מ"מ. הידבקות משרד נחשבת כאשר אין תנועת תא היא לגילוי ל30 שניות.
7. לאחר השלמת מיקרוסקופיה intravital להסיר בזהירות את שריר Cremaster ולאחסן אותו בהתכתבות לצורך הניתוח מאוחר יותר (אימונוהיסטוכימיה או ביולוגיה מולקולרית). להקריב את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. הניתוח של הקלטות מיקרוסקופיה intravital לכימות של מתגלגל תאי גזע והידבקות אנדותל משרד, כמו גם פרמטרים המודינמיים כלי הדם, כגון מהירות דם אדום תא (מ"מ / השני), אונייה שאורכה (מיקרומטר), קוטר כלי (מיקרומטר), שער מניית קיר (שניות ^-1); יש לבצעו במצב לא מקוון על ידי חוקר העיוור כדי טיפול רקמות ניסיוני בהתאמה ניצול תוכנת עיבוד תמונה.

Representative Results

באופן כללי, אינטראקציה של תאי גזע הוזרקה ישירות או אב עם האנדותל של כלי הדם בתוך זרימת דם השרירים Cremaster הוא אירוע נדיר ומתרחש באופן בלעדי בvenules postcapillary (קוטר: 30-80 מיקרומטר). בשל מתגלגל תיוג הקרינה ותאי גזע חסיד בחוזקה ניתן לכמת באופן ברור בהפרדה ממחזור leucocytes אנדוגני בvenules נצפתה (איור 2).

תנאי microcirculatory מיוצגים על ידי זרימת דם המהירות ושיעור גזירה קיר בדרך כלל לא היו שונים משמעותי בין קבוצות ניסוי בהתאמה עם טיפול שונה chemokine (טבלה 1).

טיפול מקומי ברקמת שריר Cremaster עם כמוקינים או מתווכים שונים של תגובה דלקתית, כגון: SDF-1α (אלפא סטרומה תאים שמקורם גורם-1) או TNF-α (גורם אלפא נמק גידול) הוא מסוגלים לחקות מיל ספציפיתנאי croenvironmental. תנאים כאלה לשפר את אינטראקציות גזע תאי אנדותל תא בסכום שונה, בהתאם לchemokine / המתווך הספציפי שיושם ושל אוכלוסיית תאי גזע מוזרקת (איור 3) ^12. האפשרות לכמת דפוסים שונים אלה של אינטראקציות תא תא אנדותל גזע ברור מאפשרת להערכה של פוטנציאל הנדידה של אוכלוסיות תאי גזע ספציפיות בתוך microenvironments מוגדר in vivo לפני קידום אוכלוסיות אלה כדי לקדם את הניסויים קליניים.

יתר על כן, את השפעתם של תנאים מסוימים המשפיעים pathophysiological התפקוד האנדותל, כגון מחסור בחנקן, תחמוצת, הוכח על ידי השימוש בבעלי החיים בנוקאאוט ^9.

איור 1. איור של צעדי microsurgical מפתח (AF) בmus Cremaster עכברהכנת CLE למיקרוסקופיה intravital שלאחר מכן.

איור 2. מיקרוסקופיה Intravital של c-kit תאים ⁺ בהכנת שרירים Cremaster עכברית. רקע intravascular מסופק על ידי rhodamin-dextran. (AF) סדרה של שש תמונות רצופות עם מתגלגל (חיצים שחורים) ו-c-kit תאים חסיד בחוזקה (חץ לבן) carboxy-והעמסת d-אצטט כותרת succinimidylester ⁺ בכלי דם venular. המעבדה Invest, 2008, כרך 88. קמינסקי, א ', מא, נ', Donndorf, פ et al.

איור 3. ניתוח כמותי של יחסי גומלין בין c-kit ⁺ תא ותאי האנדותל המבוססים על תמונות מיקרוסקופיות הקרינה intravital. (א) מספר מתגלגל c-kit ⁺ תאי האנדותל בvenular (בא לידי ביטוי באחוז של כל התאים שעוברים) בשרירי Cremaster עכבריים שנחשפו לSDF-1α, TNF-α או שילוב של שניהם בהשוואה לc-kit ⁺ הזרקת תאים ללא טיפול מקדים chemokine (שליטה). טיפול עם SDF-1α לבד והשילוב של SDF-1α + TNF-α גדלו אחוז c-kit ⁺ התאים מתגלגלים. (ב) מספר c-kit ⁺ תאים חסיד בתקיפות לכל ² מ"מ של רירית אנדותל venular הוא גדל באופן משמעותי רק לאחר טיפול עם השילוב של SDF-1α + TNF-α. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM (* P <0.05 לעומת שליטה). המעבדה Invest, 2008, כרך 88. קמינסקי, א ', מא, נ', Donndorf, פ et al.

עכבר סוג	קבוצה ניסיונית	מהירות של תאי דם אדום(מ"מ / השני)	שיעור גזירה קיר (sec -1)
סוג בר	בקרה	0.7 ± 0.2	43 ± 32
סוג בר	SDF-1α	0.5 ± 0.2	51 ± 31 ב
סוג בר	TNF	0.4 ± 0.2	45 ± 24
סוג בר	α α + TNF SDF-1	1.0 ± 0.5	117 ± 26

טבלת 1. אדומה מהירויות דם תא ושיעורי קיר גזירה בvenules של שרירי Cremaster עכבריים בתחילת המחקר. ניתוח בוצע באמצעות CapImage תוכנה (Zeintl, היידלברג, גרמניה) בהכנות שרירים של wild-type עכברים לאחר טיפול עם SDF-1α, TNF-α. הנתונים באים לידי ביטוי כהבדלים הממוצע ± SD בין הקבוצות בודדות שלא נמצאו להיות משמעותי. et al.

Discussion

מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital מאפשר הדמיה ישירה וניתוח כמותי של אינטראקציות תא האנדותל גזע. מודל שריר Cremaster הוא שימושי במיוחד, שכן חשיפת microsurgical והדמית intravital טכניקות כבר מבוססת היטב במהלך המחקר על אינטראקציות יקוציט-האנדותל ורכיבים כימיים שונים יכולים להיות מיושמים באופן סלקטיבי לרקמת המטרה על ידי טכניקת superfusion פשוטה. בשל היעדרם של חפצי תנועה ורעש בתמונה חמורה, דגם מיוחד זה, בהשוואה להגדרות intravital-מיקרוסקופית אחרות, מספק תנאים אופטימליים להדמיה של תאי תאי אינטראקציות.

המודל מאפשר חשיפת תנאים מוקדמים microenvironmental חיוניים, לגיוס תאי גזע ראשוניים להתקיים באורגניזם חי. במידת הצורך, leucocytes אנדוגני יכול לשמש כביקורת חיובית לאימות ולהוכיח עקרוני של תא גזע התנהגות.

jove_content "> ייצוג מודל חיה אקוטי וניצול הזרקה ישירה בעורקים במקום יישום ורידים, המגבלות הפוטנציאליות של דגמי נדידת תאים כרוניים ו / או מסירת התא מערכתי - למשל אובדן תא עקב הילכדות בתוך איברים מרוחקים - ניתן להימנע מצד השני. שני, טראומה לרקמות כירורגית חריפה עשויה לגרום למידה מסוימת של הפעלת רקמה עצמה. לכן, הכנה כירורגית atraumatic היא חובה ויציבה תנאי microcirculatory הבא הכנת השרירים Cremaster צריכה להיות מושגת בהתחלה לפני אופנה לשעתק עם קבוצות ניסוי.

הנוכחות של הצטברות יקוציט נרחבת בתוך venules postcapillary והזליגה משמעותית של צבע פלואורסצנטי לרקמה הסובבת בתחילת הקלטות מיקרוסקופיה intravital בבעלי חיים מצביעה על שליטת טראומה לרקמות כירורגים גדולה.

עם זאת, גם כאשר פונים לתכשירים מוקפדיםטכניקות מנה, תוצאות נגזרות מחוקרים שונים אינן בהכרח דומות לחלוטין בשל מעט שונה הפעלת רקמה בסיסית. זו הסיבה שהניסויים הבאים צריכים להתבצע על ידי אותו החוקר במידת האפשר.

מיועד לניתוח והכימות של הצעדים הראשוניים של גיוס תאי גזע לרקמות יעד, המודל הנוכחי אינו מאפשר אמירות על איבר קליטתם בתאי גזע מובהק.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500