Summary
माउस एम. cremaster microcirculation के intravital माइक्रोस्कोपी एक अद्वितीय और परिधीय अस्थि मज्जा स्टेम सेल प्रवास के विश्लेषण के लिए vivo मॉडल में अच्छी तरह से मानकीकृत प्रदान करता है.
Abstract
पुनर्योजी सेल थेरेपी के संदर्भ में intravascular सेल आवेदन प्रोटोकॉल के युग में, ऊतक nonmarrow के लिए स्टेम सेल प्रवास के अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है. हम यहाँ विवो में परिधीय अस्थि मज्जा स्टेम सेल प्रवास के विश्लेषण के लिए माउस cremaster microcirculation के लिए आवेदन किया intravital माइक्रोस्कोपी की तकनीक का वर्णन. एम. cremaster की intravital माइक्रोस्कोपी पहले संवहनी endothelium साथ श्वेतकोशिका बातचीत का प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए भड़काऊ अनुसंधान के क्षेत्र में शुरू किया गया है. पर्याप्त परिधीय स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल प्रवास यह अन्तःचूचुक साथ intravasculary प्रशासित स्टेम कोशिकाओं की बातचीत का अवलोकन और मात्रा का ठहराव के लिए एम. cremaster मॉडल को लागू करने के लिए बोधगम्य है अस्तर endothelial पर साथ और फर्म आसंजन रोलिंग के समान प्रारंभिक चरणों में शामिल है. विभिन्न रासायनिक घटकों चुनिंदा लक्ष्य टी के लिए लागू किया जा सकता हैसरल superfusion तकनीक द्वारा मुद्दा, यह अस्थि मज्जा के बाहर एक जीवित जीव में जगह लेने के लिए प्रारंभिक स्टेम सेल भर्ती के लिए आवश्यक microenvironmental पूर्व शर्त की स्थापना संभव है.
Introduction
वर्तमान अनुच्छेद के प्रयोजन के परिधीय अस्थि मज्जा स्टेम सेल प्रवास का प्रत्यक्ष अवलोकन और विश्लेषण के लिए माउस cremaster microcirculation पर लागू intravital माइक्रोस्कोपी की तकनीक (IVM) का वर्णन है.
स्टेम सेल की मौजूदा अवधारणा के आधार ऊतक और अंग उत्थान घायल ऊतक 1 के लिए अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के घर वापस आना शामिल है. सफल स्टेम सेल प्रवास के लिए एक महत्वपूर्ण कदम transendothelial प्रवास और अंततः अंग engraftment 2 द्वारा पीछा घायल अंग के भीतर स्थानीय अन्तःचूचुक साथ सेल बातचीत स्टेम शामिल हैं. इन स्टेम सेल के intravital विश्लेषण - endothelial सेल बातचीत vivo में अलग pathophysiological सेटिंग्स में एक स्टेम सेल आधारित पुनर्योजी प्रतिक्रिया की मात्रा का ठहराव के लिए एक आदर्श पैरामीटर रूपों. इसके अलावा, यह बोधगम्य है कि लगता है, भविष्य में, विशेष स्टेम सेल पी के प्रवासी क्षमता के intravital विश्लेषणमानकीकृत microcirculatory वातावरण के भीतर opulations, पूर्व आगे नैदानिक परीक्षण करने के लिए इन आबादियों को आगे बढ़ाने के लिए लागू किया जा सकता है.
Intravital माइक्रोस्कोपी शुरू में भड़काऊ अनुसंधान 3 के क्षेत्र में vivo में ल्युकोसैट endothelial सेल बातचीत का अवलोकन और मात्रा का ठहराव के लिए विकसित किया गया है. Intravital माइक्रोस्कोपी पढ़ाई के पहले सफल रिकॉर्डिंग एक प्रकाश माइक्रोस्कोप 4 के तहत 'मेंढक जीभ और mesenteries का अध्ययन, 19 वीं सदी में पहले से ही Cohnheim द्वारा सूचित किया गया. इसके पहले प्रयोग IVM एक जबरदस्त तकनीकी विकास और आज आया है के बाद से कुछ आवश्यक घटक मात्रात्मक IVM प्रदर्शन करने के क्रम में आवश्यक शर्तें फार्म: (i) ऊतक ऑप्टिकल उपयोग की अनुमति है कि तैयारी, (द्वितीय) एक माइक्रोस्कोप से पता लगाया जा सकता है कि आणविक जांच, (iii ) एक प्रणाली का पता लगाने और छवि डेटा से ब्याज के मापदंडों निकाल सकते हैं कि (चतुर्थ) कंप्यूटर आधारित विश्लेषण प्रणाली से जुड़ा एक माइक्रोस्कोप4 सेट.
ऊतक तैयारी की एक किस्म mesenteries और माउस और चूहा 5, माउस 6 और हैम्स्टर, खरगोश कान और कुछ नाम हैं हम्सटर गाल थैली के पृष्ठीय skinfold कक्षों का जिगर सहित IVM के अध्ययन के लिए पेश किया गया है.
हालांकि, तैयारी और दृश्य एक अच्छी तरह से मानकीकृत शल्य प्रक्रिया द्वारा संभव के रूप में निम्नलिखित में हम, intravital टिप्पणियों के लिए एक आदर्श ऊतक का प्रतिनिधित्व माउस cremaster मांसपेशियों, पर ध्यान दिया जाएगा, और सामान्य में आंदोलन कलाकृतियों की कोई समस्या नहीं होती. खुला cremaster मांसपेशियों तैयारी Baez द्वारा 1970 के दशक में पहली बार के लिए बाहर ले गए और उनके सहयोगियों ने 7 था. मूल रूप से चूहों के लिए वर्णित है, यह माउस से 8 भी सफलतापूर्वक अपनाया गया है. पिछले अध्ययनों मुख्य रूप से पोत दीवार के साथ श्वेतकोशिका बातचीत पर ध्यान केंद्रित किया था के बाद, अपने स्वयं के समूह ने हाल ही में एक valua के रूप में माउस cremaster मांसपेशियों तैयारी शुरू कीप्रत्यक्ष दृश्य और एक परिभाषित microenvironment 9 के भीतर स्टेम सेल अन्तःचूचुक बातचीत की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ble उपकरण. विभिन्न स्टेम सेल subpopulations murine सी किट + अस्थि मज्जा स्टेम सेल और mesenchymal स्टेम सेल, साथ ही मानव सीडी 133 + अस्थि मज्जा स्टेम सेल 10-12 सहित, इस मॉडल के उपयोग का अध्ययन किया गया है. दाता अस्थि मज्जा और दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग से सेल अलगाव के बाद, स्टेम सेल चुनिंदा जिससे दूरदराज के अंगों के भीतर किसी भी सेल फंसाने से परहेज, ऊरु धमनी के माध्यम से एक धमनी इंजेक्शन के उपयोग cremaster microcirculation में लागू कर रहे हैं. संभवतः संबंधित सेटिंग्स में स्थानीय स्टेम सेल प्रवास मध्यस्थता विभिन्न chemokines, topically सरल superfusion तकनीक से लक्ष्य ऊतकों को लागू किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, cremaster मांसपेशियों मॉडल विशेष रूप से उपयोगी है.
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Protocol
सेल अलगाव के बाद पूरे प्रोटोकॉल लगभग 2 घंटे लगते हैं.
1. Microsurgical तैयारी
- 9,12 कोशिकाओं पशु कार्रवाई की है समय के दौरान आराम करने की अनुमति मानकीकृत प्रोटोकॉल के अनुसार दाता अस्थि मज्जा और पृथक subpopulation की फ्लोरोसेंट लेबलिंग से स्टेम सेल अलगाव प्रदर्शन करना. फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए हम CFDA (Carboxyfluorescein Diacetate succinimidyl एस्टर) की सलाह देते हैं.
- Ketamine (75 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ 20-25 ग्राम वजन एक पुरुष माउस anesthetize. (आमतौर पर हर 30-60 मिनट) जरूरत के रूप में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान एनेस्थीसिया की खुराक से (प्रारंभिक इंजेक्शन का 10%, आईपी) बनाए रखा जाना चाहिए.
- धीरे सही अंडकोश की थैली के पूर्वकाल पहलू के साथ ही दाहिनी जांघ और कमर दाढ़ी. सभी एक सिक्त कपास झाड़ू के साथ बाल खो लीजिए. एक Plexiglass देखने के मंच पर माउस उदर पक्ष प्लेस और शुल्क को ठीकलोचदार कपड़ा का उपयोग टी. चरण पैर और अंडकोश दोनों की ऊंचाई के लिए बेस प्लेट की दुम किनारे पर एक बेस प्लेट और एक दूसरे की थाली से मिलकर, कस्टम बनाया है. 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर मंच प्लेस मंच पर निर्धारण के बाद, एक ऑपरेशन खुर्दबीन के नीचे पशु प्लेस और 10 का उपयोग करते हुए निम्नलिखित आपरेशन चरणों का प्रदर्शन - 16 गुना बढ़ाई.
- कमर को जब तक सही जांघ, घुटने से ऊरु जहाजों की बस पूर्वकाल में त्वचा कैंची का उपयोग प्रारंभिक चीरा.
- ऊरु धमनी को पहचानें और नरम ऊतक आसपास से धमनी जुटाने, proximally यह पालन करें. पहचानें और thermocautery का उपयोग बाएं अंडकोष के लिए एक बड़ी शाखा में कटौती. इसके बाद बाएं अंडकोष में अल्पज्ञता रहने के सिवनी जगह है. सौम्य कर्षण ऊरु धमनी के आगे समीपस्थ लामबंदी की सुविधा होगी.
- समीपस्थ जुटाने के पूरा होने के बाद, की पहचान करने और एक बड़ी शाखा चल mediall कटौतीthermocautery से जांघ पर y. इसके बाद दाहिनी जांघ के बाहर का भाग में ऊरु धमनी ligate. संयुक्ताक्षर पर कोमल कर्षण आगे तैयारी सहायता करेगा.
- फिर समीपस्थ ऊरु धमनी को अब ध्यान मुड़ें और के रूप में proximally संभव के रूप में धमनी के चारों ओर एक सीवन जगह है. एक गाँठ तैयार है लेकिन अभी तक यह नीचे टाई नहीं है. सिवनी कोमल कर्षण लागू करें और एक धमनी kinking बना.
- Kinking की स्थापना के बाद, धमनी ध्यान से एक microscissor उपयोग कर रहा है काटकर अलग कर देना. ऊरु नस नुकसान नहीं विशेष ध्यान रखना.
- चीरा के माध्यम से एक तैयार Microcatheter (भीतरी व्यास 0.28 मिमी) डालें. कैथेटर (0.9% सोडियम क्लोराइड, NaCl) deaired और 1 मिलीलीटर सिरिंज से पहले सम्मिलन से जुड़ा होना चाहिए.
- कैथेटर की सफल सम्मिलन के बाद, ध्यान से कैथेटर के पारित होने की सुविधा के क्रम में kinking ढीला. धमनियों से रक्त प्रवाह कैथेटर के भीतर तुरंत दिखाई जानी चाहिए. धीरे कैथेटर कुछ मिलीमीटर अग्रिमपिछले kinking परे है. इसके बाद, कैथेटर के निर्धारण के लिए तैयार संयुक्ताक्षर नीचे टाई.
- धीरे सही स्थिति की पुष्टि करने के लिए कैथेटर (0.9% NaCl) और महाप्राण फ्लश. इसके अलावा आपरेशन चरण के लिए कैथेटर सुरक्षित करने के लिए टेप का एक टुकड़ा का उपयोग करें.
- पर्याप्त निर्धारण के बाद, cremaster मांसपेशियों के निम्नलिखित तैयारी चरणों के लिए अलग कैथेटर डाला. थक्का बनने से रोकने के क्रम में नियमित निस्तब्धता और कैथेटर हर 5-10 मिनट की आकांक्षा को लागू करें.
- सही अंडकोश की थैली के लिए अब ध्यान बारी और सही अंडकोश की थैली के उदर पहलू ऊपर त्वचा और प्रावरणी काटने से एक चीरा बनाते हैं. किसी भी उपकरणों के साथ अंतर्निहित ऊतकों को छूने के लिए नहीं ख्याल रखना.
- ऊपर वंक्षण गुना करने और दुमदारी अंडकोश की थैली के बाहर का अंत करने के लिए चीरा बढ़ाएँ.
- इसे छू बिना cremaster बोरी ऊपर ध्यान से अलग अंतर्निहित नरम और संयोजी ऊतक,. Cremaster के बाहर का अंत पहचानें, और SL करने के लिए यहाँ रहने के सिवनी जगहightly मांसपेशियों का विस्तार. धीरे दुमदारी और पूर्व से मांसपेशी खींच कर पेशी बोरी के नीचे अब शेष नरम ऊतक बांटना.
- संयोजी ऊतक से पूर्ण अलगाव के बाद, कैंची का उपयोग कपाल किनारे पर एक बिंदु पर cremaster बोरी खुला. पेशी के बाहर का अंत करने के लिए इस उद्घाटन नीचे से चीरा बढ़ाएँ.
- उसके बाद कैंची का उपयोग मांसपेशियों और अंडकोष के बीच शेष कनेक्शन काटने, thermocautery का उपयोग अंडकोष और cremaster जोड़ने छोटे पोत सील.
- माइक्रोस्कोपी क्षेत्र से बाहर है, अंडकोष ध्यान न देना.
- खोला cremaster अब मंच पर फ्लैट देता है. Cremaster मांसपेशियों के ऊतकों का प्रसार करने के क्रम में ऊतक के किनारों पर चार 6-0 Prolene रहने टांके प्लेस और लोचदार कपड़ा के साथ उन्हें ठीक. अब से लगातार एक 1 मिलीलीटर सिरिंज (चित्रा 1) का उपयोग फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ ऊतक गीला करना.
- अब 15 मिनट के लिए आराम करने के लिए तैयारी की अनुमति दें. इसके बाद इंजेक्षनMicrovasculature के विपरीत वृद्धि के लिए छोड़ दिया ऊरु धमनी के माध्यम से 1% rhodamine-dextran के 0.05-0.1 मिलीलीटर. किसी भी chemokines या भड़काऊ एजेंट आवेदन के लिए योजना बनाई है, तो आप अब topically 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग संबंधित अभिकर्मक के साथ मांसपेशियों को गीला कर देना चाहिए. एक नियंत्रण प्रयोग के मामले में, पीबीएस के साथ moistening जारी है.
2. Intravital माइक्रोस्कोपी
- आपरेशन के मंच पर तय माउस रखें और महामारी रोशनी के लिए संशोधित और एक सीसीडी (आरोप डिवाइस युग्मित) वीडियो कैमरा से जुड़ा एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे चलते हैं. ऊरु धमनी कैथेटर भंग करने नहीं विशेष ध्यान रखना.
- एक पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर प्रयोगों का संचालन.
- Cremaster microcirculation की पर्याप्त दृश्य के लिए और सेल इंजेक्शन से पहले उद्देश्य समायोजन करने के बाद, stochastically फर्म स्टेम सेल के पालन के बाद के विश्लेषण के लिए छह postcapillary venules परिभाषित.
- फ्लोरोसेंट लेबल स्टेम कोशिकाओं प्रशासनऊरु धमनी कैथेटर का उपयोग लगातार पांच इंजेक्शन की कुल और 1 मिलीलीटर सिरिंज से इंजेक्शन प्रति 0.4 x 10 6 कोशिकाओं में, 200 μl पीबीएस में भंग. ध्यान से पूर्व पहले इंजेक्शन के लिए सेल नमूना हिला.
- रिकॉर्ड स्टेम सेल जिससे विशिष्ट सेलुलर के साथ संयोजन में endothelial अस्तर के साथ सेल वेग के एक से अधिक 50% की कमी के रूप में "रोलिंग" को परिभाषित करने, सेल इंजेक्शन के बाद तुरंत रोलिंग "छड़ी और रिलीज" आंदोलनों. रोलिंग स्टेम कोशिकाओं की गिनती और हर एक इंजेक्शन के बाद अवलोकन के 1 मिनट के दौरान एक पूर्वनिर्धारित venular दूरी गुजर सभी स्टेम कोशिकाओं को पूरा करें. स्टेम सेल रोलिंग की राशि सभी गुजर कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है. रोलिंग कोशिकाओं के रूप में यादृच्छिक संक्षिप्त tethering घटना का प्रदर्शन कोशिकाओं भरोसा मत करो.
- पिछले सेल इंजेक्शन गिनती तक दृढ़ता से पक्षपाती स्टेम कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण और वीं की गणना की endothelial सतह के संबंध में राशि का इजहार के बादई छह पूर्वनिर्धारित venules (व्यास एक्स लंबाई एक्स π) पक्षपाती कोशिकाओं / 2 मिमी के रूप में. कोई सेल आंदोलन 30 सेकंड के लिए detectable है जब फर्म आसंजन माना जाता है.
- Intravital माइक्रोस्कोपी के पूरा होने के बाद सावधानी से cremaster मांसपेशियों को हटा दें और इसे बाद में विश्लेषण (immunohistochemistry या आणविक जीव विज्ञान) के लिए पत्राचार में स्टोर. ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पशु बलि. स्टेम सेल रोलिंग और फर्म endothelial आसंजन, साथ ही इस तरह के लाल रक्त कोशिका वेग (मिमी / सेक), पोत की लंबाई (मीटर), पोत व्यास (माइक्रोन), दीवार शेयर की दर के रूप में microvascular hemodynamics, की मात्रा का ठहराव के लिए intravital माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग का विश्लेषण (एसईसी -1), एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग संबंधित प्रयोगात्मक ऊतक उपचार के लिए अंधा एक अन्वेषक द्वारा ऑफ़लाइन किया जाना चाहिए.
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Representative Results
सामान्य में, सीधे की बातचीत cremaster मांसपेशियों microcirculation भीतर संवहनी endothelium के साथ स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं को इंजेक्शन एक दुर्लभ घटना है और postcapillary venules (व्यास: 30-80 माइक्रोन) में विशेष रूप से होता है. कारण प्रतिदीप्ति लेबलिंग रोलिंग को और मजबूती से पक्षपाती स्टेम कोशिकाओं स्पष्ट रूप से (चित्रा 2) मनाया venules में अंतर्जात ल्यूकोसाइट परिसंचारी से जुदाई में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
रक्त प्रवाह वेग और दीवार कतरनी दर से प्रतिनिधित्व microcirculatory स्थिति आम तौर पर अलग केमोकाइन उपचार (तालिका 1) के साथ संबंधित प्रयोगात्मक समूहों के बीच काफी अलग नहीं है.
भड़काऊ प्रतिक्रिया की विभिन्न chemokines या मध्यस्थों के साथ cremaster मांसपेशियों के ऊतकों की स्थानीय उपचार, जैसे एसडीएफ 1α (stromal सेल व्युत्पन्न कारक -1 अल्फा) या TNF-α (ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा) विशिष्ट मील की नकल करने में सक्षम हैcroenvironmental शर्तों. इस तरह की स्थितियों के विशिष्ट केमोकाइन / मध्यस्थ के आधार पर एक अलग राशि में स्टेम सेल endothelial सेल बातचीत बढ़ाने आवेदन किया है और स्टेम सेल की आबादी (चित्रा 3) के 12 इंजेक्शन. स्पष्ट रूप से स्टेम सेल endothelial सेल बातचीत के इन भिन्न पैटर्न यों की संभावना नैदानिक परीक्षण करने के लिए आगे इन आबादियों को आगे बढ़ाने से पहले इन विवो में परिभाषित microenvironments भीतर विशिष्ट स्टेम सेल आबादी के प्रवासी क्षमता के मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.
इसके अलावा, इस तरह के नाइट्रिक ऑक्साइड की कमी के रूप में endothelial समारोह को प्रभावित निश्चित pathophysiological शर्तों के प्रभाव, पीटा जानवरों 9 के उपयोग के द्वारा दिखाया गया है.
चित्रा 1. माउस cremaster मुसलमानों में महत्वपूर्ण microsurgical कदम (वायुसेना) का चित्रणबाद में intravital माइक्रोस्कोपी के लिए CLE तैयारी.
चित्रा 2. एक murine cremaster मांसपेशियों तैयारी में सी किट + कोशिकाओं की intravital माइक्रोस्कोपी. Intravascular पृष्ठभूमि rhodamin-dextran द्वारा प्रदान की जाती है. छह (काला तीर) रोलिंग के साथ लगातार छवियों और venular vasculature. लैब निवेश, 2008, खंड 88 में मजबूती से पक्षपाती (सफेद तीर) carboxy-fluorescein D-एसीटेट succinimidylester लेबल सी किट + कोशिकाओं की (वायुसेना) एक श्रृंखला. Kaminski, ए, एम ए, एन, Donndorf, पी. एट अल.
चित्रा 3. Intravital प्रतिदीप्ति सूक्ष्म छवियों के आधार पर सी किट + सेल और endothelial कोशिकाओं के बीच बातचीत के मात्रात्मक विश्लेषण. (क) एसडीएफ 1α, TNF-α या का एक संयोजन के संपर्क में murine cremaster मांसपेशियों में (सब गुजर कोशिकाओं के प्रतिशत में व्यक्त) venular अन्तःचूचुक पर सी किट + कोशिकाओं रोलिंग की संख्या दोनों सी किट की तुलना + केमोकाइन pretreatment (नियंत्रण) के बिना सेल इंजेक्शन. अकेले एसडीएफ 1α के साथ उपचार और एसडीएफ 1α + TNF-α के संयोजन रोलिंग सी किट + कोशिकाओं का प्रतिशत वृद्धि हुई है. (ख) venular endothelial अस्तर के 2 मिमी प्रति दृढ़ता से पक्षपाती सी किट + कोशिकाओं की संख्या में काफी केवल एसडीएफ 1α + TNF-α के संयोजन के साथ इलाज के बाद बढ़ जाती है. मतलब ± SEM के रूप में डेटा व्यक्त कर रहे हैं (* पी <नियंत्रण बनाम 0.05). लैब निवेश, 2008, वॉल्यूम 88. Kaminski, ए, एम ए, एन, Donndorf, पी. एट अल.
| माउस के प्रकार | प्रायोगिक समूह | लाल रक्त कोशिका वेग(मिमी / सेक) | दीवार कतरनी दर (एसईसी -1) |
| जंगली प्रकार | नियंत्रण | 0.7 ± 0.2 | 43 ± 32 |
| जंगली प्रकार | एसडीएफ 1α | 0.5 ± 0.2 | 51 ± 31 |
| जंगली प्रकार | TNF | 0.4 ± 0.2 | 45 ± 24 |
| जंगली प्रकार | एसडीएफ -1 α + TNF α | 1.0 ± 0.5 | 117 ± 26 |
तालिका 1. आधारभूत पर murine cremaster मांसपेशियों की venules में रक्त कोशिका वेग और दीवार कतरनी दरों लाल. विश्लेषण एसडीएफ 1α, TNF-α के साथ उपचार के बाद जंगली प्रकार चूहों की मांसपेशियों की तैयारी में CapImage सॉफ्टवेयर (Zeintl, हीडलबर्ग, जर्मनी) का उपयोग किया गया था. अलग अलग समूहों के बीच मतलब ± एसडी मतभेद महत्वपूर्ण किया जा रहा नहीं पाए गए के रूप में डेटा व्यक्त कर रहे हैं.
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Discussion
Intravital प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रत्यक्ष दृश्य और स्टेम सेल अन्तःचूचुक बातचीत की मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. microsurgical जोखिम और तकनीक intravital दृश्य अच्छी तरह श्वेतकोशिका-अन्तःचूचुक बातचीत और विभिन्न रासायनिक घटकों पर शोध के दौरान चुनिंदा सरल superfusion तकनीक से लक्ष्य ऊतकों को लागू किया जा सकता है स्थापित किया गया है के बाद से cremaster मांसपेशियों मॉडल, विशेष रूप से उपयोगी है. कारण आंदोलन कलाकृतियों और गंभीर छवि शोर के अभाव के इस विशेष मॉडल, अन्य intravital माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स की तुलना में, सेल सेल बातचीत के दृश्य के लिए इष्टतम स्थितियों प्रदान करता है.
मॉडल एक जीवित जीव में जगह लेने के लिए प्रारंभिक स्टेम सेल भर्ती के लिए आवश्यक microenvironmental पूर्व शर्त, खुलासा अनुमति देता है. यदि आवश्यक हो, अंतर्जात ल्यूकोसाइट मान्यता के लिए सकारात्मक नियंत्रण की सेवा और स्टेम सेल व्यवहार के सिद्धांत का साबित हो सकता है.
jove_content "> एक तीव्र पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करना है और बदले शिरापरक आवेदन की प्रत्यक्ष धमनी इंजेक्शन के उपयोग, पुरानी सेल प्रवास मॉडल और / या प्रणालीगत सेल प्रसव की संभावित सीमाओं - कारण दूरदराज के अंगों के भीतर फंसाने के लिए जैसे सेल हानि -. अन्य पर बचा जा सकता है हाथ, तीव्र शल्य ऊतक आघात इसलिए, एक atraumatic शल्य चिकित्सा की तैयारी cremaster मांसपेशियों तैयारी प्रयोगात्मक समूहों के साथ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन पहले शुरू में हासिल करने की आवश्यकता है निम्नलिखित microcirculatory स्थितियां अनिवार्य और स्थिर है. ऊतक सक्रियण खुद की एक निश्चित डिग्री के लिए प्रेरित करने की संभावना है.postcapillary venules और नियंत्रण पशुओं में intravital माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग की शुरुआत में आसपास के ऊतकों को फ्लोरोसेंट डाई का महत्वपूर्ण रिसाव के भीतर व्यापक श्वेतकोशिका संचय की उपस्थिति प्रमुख शल्य ऊतक आघात से संकेत मिलता है.
हालांकि, सावधानीपूर्वक prepa लागू करने के लिए भी जबविभिन्न जांचकर्ताओं से निकाली गई राशन तकनीक, परिणाम जरूरी होने के कारण थोड़ा आधारभूत ऊतक सक्रियण भिन्न करने के लिए पूरी तरह से तुलनीय नहीं हैं. बाद के प्रयोगों जब भी संभव हो एक ही अन्वेषक द्वारा किया जाना चाहिए यही कारण है.
ऊतकों लक्ष्य स्टेम सेल भर्ती की प्रारंभिक कदम के विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए बनाया गया है, मौजूदा मॉडल निश्चित स्टेम सेल अंग engraftment पर बयानों की अनुमति नहीं है.
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Disclosures
इस पांडुलिपि के लिए आयोजित सभी पशु प्रयोगों, स्थानीय पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 | |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 | |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available | |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available | |
| Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
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