Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Summary

Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.

Abstract

In der Ära der intravaskulären Zellanwendungsprotokolle im Rahmen der regenerativen Zelltherapie, die zugrunde liegenden Mechanismen der Stammzellmigration, um Gewebe nonmarrow nicht vollständig geklärt. Wir beschreiben hier die Technik der Intravitalmikroskopie an der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellmigration in vivo angewendet. Intravitalmikroskopie des M. cremaster zuvor im Bereich der Entzündungsforschung für die direkte Beobachtung der Leukozyten-Wechselwirkung mit dem vaskulären Endothel eingeführt. Da eine ausreichende Umfangs Stamm-und Vorläuferzellmigration umfasst ähnliche anfänglichen Schritte entlang rollen und feste Haftung am Endothel es denkbar, den M. cremaster Modell für die Beobachtung und Quantifizierung der Wechselwirkung intravasculary verabreicht Stammzellen mit dem Endothel anzuwenden. Verschiedene chemische Komponenten selektiv an das Ziel t aufgetragen werdenProblem durch einfache Superfusionstechniken ist es möglich, wesentliche Voraussetzungen für die Mikroumgebungs ersten Stammzellrekrutierung, um in einem lebenden Organismus außerhalb des Knochenmarks nehmen zu etablieren.

Introduction

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Technik der Intravitalmikroskopie (IVM) auf der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die direkte Beobachtung und Analyse der peripheren Knochenmark-Stammzellen angewendet Migration zu beschreiben.

Das aktuelle Konzept der Stammzell Gewebe-und Organregeneration beinhaltet die Homing von Knochenmark-Stammzellen in die verletzte Gewebe ^ein. Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Stammzell-Migration beinhaltet die Stammzell Interaktion mit der lokalen Endothel innerhalb des verletzten Organ, gefolgt von transendotheliale Migration und schließlich Organ Transplantation ^2. Intravital Analyse dieser Stammzellen - Endothelzell-Interaktionen bildet einen idealen Parameter für die Quantifizierung einer Stammzellregenerationsreaktion in verschiedenen pathophysiologischen Einstellungen in vivo. Ferner erscheint es denkbar, dass in der Zukunft, intravital Analyse der Migrationsfähigkeit spezifischer Stammzellen populations innerhalb der Mikrozirkulation standardisierten Umgebungen kann angewendet werden, bevor fort diese Bevölkerungs weitere klinische Tests.

Intravitalmikroskopie wurde ursprünglich für die Beobachtung und Quantifizierung der Leukozyten-Endothel-Zell-Wechselwirkung in vivo im Bereich der Entzündungsforschung ³ entwickelt. Erste erfolgreiche Aufnahmen von Intravitalmikroskopie Studien wurden von Cohnheim bereits im 19. Jahrhundert berichtet, Studium Froschzungen und Gekröse unter einem Lichtmikroskop ^4. Seit seinem ersten Einsatz IVM hat eine enorme technische Entwicklung durchgemacht und ist heute bestimmte wesentliche Komponenten bilden Voraussetzungen, um quantitative IVM durchführen: (i) Gewebezubereitungen, die optischen Zugang zu ermöglichen, (ii) molekulare Sonden, die mit einem Mikroskop erkannt werden können, (iii ) ein Mikroskop, um ein Detektionssystem und (iv) Computer-basierte Analyse-Systeme, die interessierenden Parameter aus den Bilddaten zu extrahieren anschließbarSet ^4.

Eine Vielzahl von Gewebepräparationen für IVM Studien einschließlich der Mesenterien und Leber der Maus und der Ratte ^5, den Rückenhautkammern ⁶ der Maus und Hamster, Kaninchenohr und der Hamsterbackentasche ein paar zu nennen eingeführt.

Doch im folgenden werden wir auf der Maus Cremaster-Muskel, was eine ideale Gewebe für die Intravital Beobachtungen zu konzentrieren, als Vorbereitung und Visualisierung von einem gut standardisierten chirurgischen Eingriff möglich ist, und in der Regel keine Probleme von Bewegungsartefakten kommen. Die offene Cremaster-Muskel-Präparat wurde zum ersten Mal in den 1970er Jahren von Baez Kollegen und ⁷ durchgeführt. Ursprünglich für Ratten beschrieben, wurde auch erfolgreich auf die Maus ⁸ angenommen. Nach früheren Studien hatte vor allem auf Leukozyten-Interaktionen mit der Gefäßwand konzentriert, vor kurzem unsere eigene Gruppe die Maus Cremaster-Muskel-Präparat als BewertungsBLE Werkzeug für die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen innerhalb einer definierten Mikro ^9. Verschiedene Stammzellpopulationen untersucht die Verwendung dieses Modells, einschließlich murinen c-kit ⁺ Knochenmarkstammzellen und mesenchymale Stammzellen, sowie Menschen CD 133 ⁺ Knochenmarkstammzellen ^10-12. Nach der Zellisolation aus Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung zur Anzeige, werden die Stammzellen selektiv in die Cremaster Mikrozirkulation unter Verwendung eines arteriellen Injektion über die Oberschenkelarterie eingesetzt, wodurch jede Zelle Einschließen in entfernte Organe vermieden. Darüber hinaus ist der Cremaster-Muskel-Modell besonders nützlich, da verschiedene Chemokine potenziell Vermittlung lokalen Stammzellmigration innerhalb der jeweiligen Einstellungen können lokal auf dem Zielgewebe durch einfache Superfusionstechnik angewendet werden.

Protocol

Das gesamte Protokoll nach der Zellisolation dauert ca. 2 Stunden.

1. Mikrochirurgische Vorbereitung

1. Führen Stammzellen isoliert von der Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung der isolierten Subpopulation nach standardisierten Protokollen ^9,12 sodass die Zellen während der Zeit der Tieroperation durchgeführt ruhen. Für die Fluoreszenzmarkierung empfehlen wir CFDA (Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester).
2. Betäuben einer männlichen Maus mit einem Gewicht von 20-25 g mit Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (2,5 mg / kg). Während der chirurgischen Verfahren und Versuchsprotokolle sollten Anästhesie durch Ergänzungen erhalten werden (10% der anfänglichen Injektion ip) nach Bedarf (in der Regel alle 30-60 min).
3. Rasur sanft die Vorderseite des rechten Hodensack sowie den rechten Oberschenkel und Leiste. Sammeln Sie alle verlieren Haare mit einem angefeuchteten Wattestäbchen. Platzieren Sie die Maus Bauchseite nach oben auf einem Plexiglas-Sicht Bühne und fixieren Sie die Gebührt mit elastischem Tuch. Die Bühne ist maßgeschneidert, bestehend aus einer Grundplatte und einer zweiten Platte am kaudalen Rand der Grundplatte für die Erhebung beider Beine und Hodensack. Zeigen die Bühne auf einem Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten Nach der Fixierung auf die Bühne, legen Sie das Tier unter einem Operationsmikroskop und die folgenden Arbeitsschritte unter Verwendung von 10 - bis 16-facher Vergrößerung.
4. Machen Sie den ersten Schnitt mit Haut Schere am rechten Oberschenkel, nur der vordere Oberschenkelgefäße vom Knie bis in die Leistengegend.
5. Identifizieren Sie die Oberschenkelarterie und folgen ihm proximal mobilisiert die Arterie von Weichgewebe umgeben. Identifizieren und schneiden Sie ein großer Ast auf den linken Hoden mit Thermokauter. Danach legen Sie einen Aufenthalt Naht oberflächlich am linken Hoden. Sanfte Traktion weiter proximal Mobilisierung der Oberschenkelarterie zu erleichtern.
6. Nach Abschluss des proximalen Mobilisierung, zu identifizieren und schneiden eine große Filiale läuft MEDIALLy am Oberschenkel von Thermokauter. Danach ligieren die Femoralarterie in den distalen Teil des rechten Oberschenkels. Sanfte Traktion auf der Ligatur wird Hilfe weitere Vorbereitung.
7. Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf den proximalen Arteria femoralis wieder und legen Sie eine Naht um die Arterie so proximal wie möglich. Bereiten Sie einen Knoten, sondern binden Sie es nicht noch nach unten. Bewerben leichten Zug an der Naht, und erstellen Sie eine arterielle Knicken.
8. Nach der Gründung der Knicken einzuschneiden die Arterie vorsichtig mit einem microscissor. Achten Sie besonders darauf, die Vena femoralis beschädigen.
9. Legen Sie eine vorbereitete Mikrokatheter (Innendurchmesser 0,28 mm) über den Schnitt. Der Katheter muss entlüftet werden (0,9% Natriumchlorid, NaCl) und mit einer 1 ml Spritze vor Einsetzen verbunden.
10. Nach erfolgreicher Einführung des Katheters vorsichtig den Knicken zu lösen, um den Durchgang des Katheters zu erleichtern. Arterielle Blutfluss innerhalb des Katheters sofort sichtbar sein. Sanft voran der Katheter ein paar Millimeters über die bisherige Knicken. Danach binden Sie die vorbereitete Ligatur zur Fixierung des Katheters.
11. Spülen Sie vorsichtig den Katheter (0,9% NaCl) und saugen, um die korrekte Position zu bestätigen. Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um weiter zu sichern, den Katheter in die Betriebsphase.
12. Nach ausreichender Fixierung, setzen Sie den Katheter beiseite für die folgenden Schritte zur Vorbereitung der Cremaster-Muskel. Bewerben regelmäßige Spülung und Aspiration des Katheters alle 5-10 min, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern.
13. Drehen Sie nun die Aufmerksamkeit auf die rechte Hodensack und einen Einschnitt durch Schneiden der Haut und Faszie über dem ventralen Aspekt der rechten Hodensack. Achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe mit allen Instrumenten berühren.
14. Erweitern der Einschnitt bis zur Leistenbeuge und kaudal zu dem distalen Ende des Hodensacks.
15. Sorgfältig separaten zugrunde liegenden weich und Bindegewebe über dem Cremaster Sack, ohne es zu berühren. Identifizieren Sie das distale Ende des Cremaster und legen hier einen Aufenthalt Naht an slightly verlängern die Muskeln. Resezieren jetzt noch weiche Gewebe unter der Muskel-Sack durch leichtes Ziehen die Muskeln kaudal und anterior.
16. Nach der vollständigen Trennung von Bindegewebe, öffnen Sie den Cremaster-Sack an einem Punkt auf der Schädel Rand mit einer Schere. Erweitern Sie den Schnitt von dieser Öffnung nach unten bis zum distalen Ende des Muskels.
17. Verschließen Sie den kleinen Schiff verbindet den Hoden und der Cremaster mit Thermokauter, danach schneiden Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen Muskel und Hoden mit einer Schere.
18. Beiseite legen den Hoden, aus dem Bereich der Mikroskopie.
19. Die geöffnete Cremaster legt nun flach auf der Bühne. Legen Sie vier 6-0 Prolene Haltefäden an den Rändern des Gewebes und befestigen Sie sie mit elastischen Tuch um den Cremaster-Muskel-Gewebe ausbreiten. Von nun an ständig befeuchten das Gewebe mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 1 ml Spritze (Abbildung 1).
20. Jetzt erlauben die Vorbereitung zur Ruhe für 15 min. Danach spritzen0,05-0,1 ml 1% Rhodamin-Dextran über die linke Oberschenkelarterie zur Kontrastverstärkung des Mikrogefäßsystems. Falls Chemokine oder entzündungshemmende Mittel sind für den Einsatz geplant, sollten Sie jetzt topisch befeuchten den Muskel mit der jeweiligen Reagens unter Verwendung einer 1 ml Spritze. Im Falle eines Kontrollversuchs, weiterhin Befeuchten mit PBS.

2. Intravitalmikroskopie

1. Halten Sie das für den Betrieb der Bühne fixiert Maus und bewegen sich unter einem Fluoreszenzmikroskop für Auflicht-Beleuchtung modifiziert und auf eine CCD (Charge-Coupled Device)-Videokamera verbunden. Achten Sie besonders darauf, den Oberschenkelarterienkatheter verrenken.
2. Führen Experimente mit einem Wasserimmersionsobjektiv.
3. Nach der Einstellung des Ziel für eine ausreichende Darstellung der Cremaster die Mikrozirkulation und vor der Zellinjektion, stochastisch definieren sechs postkapillären Venolen für die spätere Analyse der Unternehmensstammzellhaftung.
4. Verwalten Fluoreszenz-markierten Stammzellen,in 200 ul PBS gelöst, mit 0,4 × 10 ⁶ Zellen pro Injektion, mit insgesamt fünf aufeinanderfolgenden Injektionen unter Verwendung des Oberschenkelarterienkatheter und einer 1 ml-Spritze. Die Zellprobe vor der ersten Injektion vorsichtig schütteln.
5. Rekord Stammzellen sofort rollt nach Zellinjektion, wobei die Definition "Rollen" als mehr als 50% Reduktion der Zellgeschwindigkeit entlang der endothelialen Auskleidung in Kombination mit typischen zellulären "Stick and release" Bewegungen. Führen Zählung der Roll Stammzellen und Stammzellen alle Gabe eines vordefinierten venulären Distanz während 1 min Beobachtungs nach jeder einzelnen Injektion. Die Menge der Stammzellwalzen als Prozentsatz aller Durch Zellen exprimiert. Zählen Sie nicht Zellen, die zufällig kurz Tethering Phänomene als Rollzellen.
6. Nach der letzten Injektion Zelle bestimmen die Anzahl der festhaftenden Stammzellen durch Zählen und drücken die Menge im Verhältnis zu der berechneten endothelialen Oberfläche the sechs vordefinierten Venolen (Durchmesser x Länge x π) als adhärenten Zellen / mm ^2. Firm Haftung gilt, wenn kein Zellbewegung ist für 30 Sekunden nachweisbar.
7. Nach Abschluss der Intravitalmikroskopie vorsichtig den M. cremaster und speichern sie in Übereinstimmung mit späteren Analyse (Immunhistochemie und Molekularbiologie). Sacrifice das Tier durch Genickbruch. Die Analyse der Intravitalmikroskopie-Aufnahmen für die Quantifizierung der Stammzellroll und fest endotheliale Adhäsion, sowie mikrovaskuläre Hämodynamik, wie rote Blutkörperchen Geschwindigkeit (mm / s), der Schiffslänge (um), Gefäßdurchmesser (um), Wandanteil Rate (s ^-1); sollte offline von einem Ermittler auf die jeweilige experimentelle Gewebebehandlung mittels eines Bildverarbeitungssoftware blind durchgeführt werden.

Representative Results

Im allgemeinen Zusammenspiel von direkt eingespritzt Stamm-oder Vorläuferzellen mit dem vaskulären Endothel innerhalb der M. cremaster Mikrozirkulation ist ein seltenes Ereignis und tritt ausschließlich in postkapillären Venolen (Durchmesser: 30 bis 80 um). Aufgrund Fluoreszenzmarkierung Walzen und fest haftenden Stammzellen deutlich getrennt von zirkulierenden endogenen Leukozyten in den Venen beobachtet (Fig. 2) quantifiziert werden.

Die Mikrozirkulationsbedingungen durch die Blutströmungsgeschwindigkeit und Wandscherrate repräsentiert gewöhnlich nicht signifikant zwischen den jeweiligen Versuchsgruppen mit unterschiedlichen Chemokin-Behandlung (Tabelle 1).

Die lokale Behandlung des M. cremaster Gewebe mit verschiedenen Chemokinen oder Mediatoren der Entzündungsreaktion ist beispielsweise SDF-1α (stromal cell-derived factor-1 alpha) oder TNF-α (Tumor-Nekrose-Faktor-alpha), die auf spezifische mi imitierencroenvironmental Bedingungen. Solche Bedingungen erhöhen Stammzellen Endothelzellen-Wechselwirkungen in einer anderen Menge in Abhängigkeit von der spezifischen Chemokin / Mediator aufgetragen und der Stammzellpopulation injiziert (Fig. 3) ^12. Die Möglichkeit, diese unterschiedlichen Muster von Stammzellen Endothelzellen-Wechselwirkungen sind für quantifizieren können zur Bewertung des Migrationspotential bestimmter Stammzellpopulationen innerhalb definierter Mikroumgebung in vivo vor Weiterentwicklung dieser Populationen zu klinischen Tests fördern.

Ferner die Auswirkungen bestimmter pathophysiologischen Erkrankungen des endothelialen Funktion, wie Stickoxid-Mangel wurde durch die Verwendung von Knockout-Tieren ⁹ gezeigt.

Fig. 1 ist. Darstellung der wichtigsten Schritte mikro (af) in Maus-Cremaster-muscle Vorbereitung für nachfolgende Intravitalmikroskopie.

Abbildung 2. Intravitalmikroskopie von c-kit ^+-Zellen in einem murinen M. cremaster Vorbereitung. Die intravaskuläre Hintergrund wird durch Rhodamin-Dextran zur Verfügung gestellt. (Af) Eine Serie von sechs aufeinanderfolgenden Bildern mit sanften (schwarze Pfeile) und fest haft (weißer Pfeil) Carboxy-Fluorescein-d-Acetat Succinimidylester-markierten c-kit ⁺ Zellen in der Gefäß venulären. Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

3. Quantitative Analyse der Wechselwirkungen zwischen c-kit ^+-Zellen und endotheliale Zellen auf intravitalen fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. (a) Die Anzahl der rollenden c-kit ⁺ Zellen auf venulären Endothel in murinen Cremaster Muskeln SDF-1α, TNF-α oder eine Kombination ausgesetzt (in Prozent aller Zellen exprimiert vorbei), die beide im Vergleich zu c-kit ⁺ Zellinjektion ohne Chemokin Vorbehandlung (Kontrolle). Behandlung mit SDF-1α allein und die Kombination von SDF-1α + TNF-α erhöht Prozentsatz der Walz c-kit ^+-Zellen. (B) Die Anzahl der festhaft c-kit ^+-Zellen pro mm ² venulären Endothel signifikant nur nach Behandlung mit der Kombination von SDF-1α + TNF-α erhöht wird. Die Daten sind angegeben als Mittelwert ± SEM (* p <0,05 vs Kontrolle). Lab Invest, 2008, Vol. 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Maus-Typ	Versuchsgruppe	roten Blutkörperchen Geschwindigkeit(Mm / sec)	Wandscherrate (s -1)
Wildtyp-	Kontrolle	0,7 ± 0,2	43 ± 32
Wildtyp-	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Wildtyp-	TNF	0,4 ± 0,2	45 ± 24
Wildtyp-	SDF-1 α + TNF-α	1,0 ± 0,5	117 ± 26

Tabelle 1. Erythrozytengeschwindigkeiten und Wandscherraten in Venolen von Maus Cremaster Muskeln an der Grundlinie. Die Analyse wurde nach der Behandlung mit SDF-1α, TNF-α unter Verwendung CapImage Software (Zeintl, Heidelberg, Deutschland) in Muskelpräparaten von Wildtyp-Mäusen. Die Daten sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wurden nicht gefunden als signifikant. et al.

Discussion

Intravitalfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen. Der Cremaster-Muskel-Modell ist besonders nützlich, da mikrochirurgischen Techniken Intravital Belichtung und Visualisierung haben sich etabliert in der Forschung auf Leukozyten-Endothel-Interaktionen und verschiedenen chemischen Komponenten können durch einfache Superfusionstechnik selektiv an das Zielgewebe angewendet werden. Aufgrund der Abwesenheit von Bewegungsartefakten und schwere Bildrauschen diesem Modell im Vergleich zu anderen Intravitalmikroskopie Einstellungen bietet optimale Voraussetzungen für die Visualisierung von Zell-Zell-Interaktionen.

Das Modell ermöglicht enthüllt wesentliche Mikroumgebungs Voraussetzungen für erste Stammzellrekrutierung statt in einem lebenden Organismus zu nehmen. Falls erforderlich, kann endogenen Leukozyten als positive Kontrollen zur Validierung dienen und zu beweisen, der Grundsatz der Stammzellverhalten.

jove_content "> Stellvertretend für eine akute Tiermodell und Nutzung direkte arterielle Injektion anstelle von venösen Anwendung, die möglichen Grenzen der chronischen Zellmigration Modelle und / oder systemischen Zell Lieferung - zB Zellverlust durch Einschließen in entfernte Organe - kann vermieden werden, auf der anderen. Seits ist die akute chirurgische Gewebetrauma wahrscheinlich eine gewisse Gewebe Aktivierung selbst induzieren. Daher ist eine atraumatische Operationsvorbereitung obligatorisch und stabile Mikrozirkulationsbedingungen folgende Cremaster-Muskel-Präparat benötigen, um in einer reproduzierbaren Art und Weise vor Start mit experimentellen Gruppen erreicht werden.

Die Anwesenheit von Leukozyten umfangreiche Ansammlung innerhalb der postkapillaren Venolen und signifikante Leckage des Fluoreszenzfarbstoffs in das umliegende Gewebe zu Beginn der intravitalmikroskopischen Aufnahmen bei den Kontrolltieren zeigen chirurgische großen Gewebetrauma.

Aber auch bei der Anwendung akribische VorbereitungRation Techniken, Ergebnisse aus verschiedenen Forschern stammen, sind nicht notwendigerweise vollständig vergleichbar wegen leicht unterschiedlichen Ausgangsgewebe Aktivierung. Deshalb nachfolgenden Experimenten sollte von der gleichen Ermittler, wann immer möglich durchgeführt werden.

Entwickelt für die Analyse und Quantifizierung der ersten Schritte der Stammzellrekrutierung an Zielgewebe, ist das aktuelle Modell nicht Aussagen über bestimmte Stammzellorgan-Transplantation zu ermöglichen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500