Intravital Mikroskopi av mikrocirkulationen i musen kremastermuskeln för analys av perifera stamcells Migration

Summary

Intravital mikroskopi av musen M. cremaster mikrocirkulation erbjuder en unik och väl standardiserat in vivo-modell för analys av perifera benmärg stamceller migration.

Abstract

I en tid präglad av intravaskulära cellapplikationsprotokoll i samband med regenerativ cellterapi, de bakomliggande mekanismerna för stamcells migration till nonmarrow vävnad har inte helt klarlagts. Vi beskriver här tekniken med intravital mikroskopi appliceras på musen cremaster mikrocirkulationen för analys av perifer benmärg stamceller migration in vivo. Intravital mikroskopi av M. cremaster tidigare har införts inom området inflammatorisk forskning för direkt observation av leukocyt interaktion med det vaskulära endotelet. Eftersom tillräcklig perifer stam och stamceller migration innehåller liknande initiala steg rullande längs och fast adhesion vid endothelial foder det är tänkbart att tillämpa M. cremaster modell för observation och kvantifiering av samverkan mellan intravasculary administrerade stamceller med endotelet. Eftersom olika kemiska komponenter kan selektivt appliceras på mål tproblemet genom enkla supertekniker, är det möjligt att fastställa viktiga microenvironmental förutsättningar, för första stamcells rekryteringen att ske i en levande organism utanför benmärgen.

Introduction

Syftet med denna artikel är att beskriva den teknik för intravital mikroskopi (IVM) tillämpas på musen cremaster mikrocirkulationen för direkt observation och analys av perifer benmärg stamceller migration.

Det nuvarande begreppet stamcellsbaserad vävnad och organregenere involverar målsökande av benmärg härrör stamceller i den skadade vävnaden ^1. Ett avgörande steg för lyckad stamcells migrering omfattar stamceller samverkan med det lokala endotel i den skadade organet följt av transendotelial migration och slutligen organ engraftment ^2. Intravital analys av dessa stamceller - endothelial cell interaktioner utgör en idealisk parameter för kvantifiering av en stamcellsbaserad regenerativ respons i olika patofysiologiska inställningar in vivo. Dessutom verkar det tänkbart, att, i framtiden, intravital analys av migrationskapacitet specifika stamcells populations inom standardiserade mikrocirkulatoriska miljöer, kan tillämpas innan avancera dessa befolkningar att ytterligare kliniska tester.

Intravital mikroskopi har ursprungligen utvecklats för observation och kvantifiering av leukocyt-endotel interaktion cell in vivo inom området inflammatoriska forskning ^3. Första lyckade inspelningar av intravital mikroskopi studier rapporterades av Cohnheim redan på 19-talet, studerar grod tungor och mesenteries under ett ljusmikroskop ^4. Sedan den första användningen IVM har genomgått en enorm teknisk utveckling och idag vissa viktiga komponenter utgör förutsättningar för att utföra kvantitativa IVM: (i) vävnadspreparat som medger optisk access, (ii) molekylära sonder som kan upptäckas genom ett mikroskop, (iii ) ett mikroskop som är ansluten till ett system för upptäckt och (iv) datorbaserade analyssystem som kan extrahera parametrar av intresse från bilddataset ^4.

En mängd olika vävnadspreparat har införts för IVM studier inklusive mesenteries och lever i mus och råtta ^5, de dorsala skinfold kamrar mus ⁶ och hamster, kanin öron och hamsterkindpåsen för att nämna några.

I det följande kommer vi att fokusera på musen kremastermuskeln, som representerar en idealisk vävnad för intravital observationer, som förberedelse och visualisering är möjligt genom en väl standardiserat kirurgiskt ingrepp, och i allmänhet inga problem med rörelseartefakter uppstå. Den öppna kremastermuskeln förberedelse genomfördes för första gången på 1970-talet av Baez och kollegor ^7. Ursprungligen beskrivet för råttor har det antagits framgångsrikt även till ^mus-8. Efter tidigare studier hade främst fokuserat på leukocyt interaktion med kärlväggen, vår egen grupp nyligen infört musen kremastermuskeln förberedelse som en värderingble verktyg för direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner inom ett definierat mikro ^9. Olika stamcellspopulationer har studerats utnyttja denna modell, inklusive murina c-kit ⁺ benmärg stamceller och mesenkymala stamceller, samt den mänskliga CD 133 ⁺ benmärgsstamceller ^10-12. Efter cellisolering från givare benmärg och fluorescerande märkning för visualisering, är stamceller selektivt tillämpat i cremaster mikrocirkulationen utnyttjar en arteriell injektion via lårbensartären, och därmed undvika någon cell entrapment inom avlägsna organ. Dessutom är kremastermuskeln modellen särskilt användbart eftersom olika kemokiner potentiellt förmedla lokala stamceller migration inom respektive inställningar, kan lokalt applicerad till målvävnaden genom enkel superfusionsteknik.

Protocol

Hela protokollet efter cellisolering tar ungefär 2 timmar.

1. Mikro Framställning

1. Utför stamcellsisolering från donatorn benmärg och fluorescerande märkning av den isolerade subpopulation enligt standardiserade protokoll ^9,12 tillåter celler att vila under den tid djuret utförs. För fluorescerande märkning rekommenderar vi CFDA (karboxyfluorescein diacetate succinimidylester).
2. Söva en manlig mus väger 20-25 g med ketamin (75 mg / kg) och xylazin (2,5 mg / kg). Under hela kirurgiska ingrepp och experimentella protokoll bör anestesi upprätthållas genom tillskott (10% av de initiala injektionen ip) som behövs (vanligtvis varje 30 till 60 min).
3. Raka försiktigt den främre delen av högra pungen och höger lår och ljumske. Samla alla tappa hår med en fuktad bomullspinne. Placera musen ventrala sidan uppåt på en plexiglas visning scen och fixa avgiftent med hjälp av elastisk drapering. Scenen är skräddarsydd, som består av en bottenplatta och en andra platta på den bakre spetsen på basplattan för förhöjning av både ben och pungen. Placera scenen på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C. Efter fixering på scenen, placera djuret under en operation mikroskop och utför följande steg med hjälp av 10 - till 16-faldig förstoring.
4. Gör den första snittet med hjälp av hud sax på höger lår, bara anterior av lårbens fartyg från knäet tills till ljumsken.
5. Identifiera lårbensartären och följ den proximalt, mobilisera artären från omgivande mjukvävnad. Identifiera och skär en stor gren till vänster testikel använder thermocautery. Därefter placeras en vistelse sutur ytligt på vänster testikel. Gentle dragkraft kommer att underlätta ytterligare proximal mobilisering av lårbensartären.
6. Efter fullbordande av den proximala mobilisering, identifiera och skära en stor gren som kör medially vid låret med thermocautery. Därefter ligera femoralartären i den distala delen av den högra låret. Försiktigt dra i ligatur kommer att hjälpa ytterligare beredning.
7. Vänd uppmärksamheten nu till den proximala lårbensartären igen och placera en sutur runt artären så proximalt som möjligt. Förbered en knut men bind inte ner ännu. Applicera försiktigt dra till suturen och skapa en arteriell veck.
8. Efter upprättandet av snor, incisionsfilm artären försiktigt med en microscissor. Var särskilt försiktig med att inte skada lårbensvenen.
9. Sätt i en förberedd mikrokateter (innerdiameter 0,28 mm) via snittet. Katetern måste avluftades (0,9% natriumklorid, NaCl) och ansluten till en 1 ml injektionsspruta före införing.
10. Efter lyckad införing av katetern, lossa försiktigt kinkning för att underlätta passage av katetern. Arteriella blodflöde bör omedelbart synlig i katetern. Försiktigt föra katetern några millimeters bortom den tidigare snor. Därefter surra förberedd ligatur för fixering av katetern.
11. Spola försiktigt katetern (0,9% NaCl) och aspirera för att bekräfta korrekt läge. Använd en bit tejp för att ytterligare säkra katetern till operationen skede.
12. Efter adekvat fixering, satte katetern åt sidan för följande förberedande steg kremastermuskeln. Applicera regelbunden spolning och aspiration av katetern varje 5-10 min för att förhindra koagelbildning.
13. Vänd uppmärksamheten nu till rätt pungen och gör ett snitt genom att skära huden och fascia över den ventrala aspekten av rätten pungen. Se till att inte röra den underliggande vävnaden med några instrument.
14. Förläng snittet upp till det inguinala vecket och kaudalt till den distala änden av pungen.
15. Försiktigt separata underliggande mjuk-och bindväv ovanför cremaster säcken, utan att röra den. Identifiera den distala änden av cremaster, och placera en vistelse sutur här för att slightly förlänga muskeln. Resect nu återstående mjuk vävnad under muskeln säcken genom att försiktigt dra i muskeln kaudalt och anteriort.
16. Efter fullständig separation från bindväv, öppna cremaster säck i en punkt på hjärn kanten med hjälp av en sax. Förläng snittet från denna öppning ned till distala änden av muskeln.
17. Täta små kärl som förbinder testikeln och cremaster med hjälp thermocautery, därefter skär de återstående anslutningarna mellan muskeln och testikeln med sax.
18. Lägga bort testikeln, ur mikroskopi fältet.
19. Den öppnade cremaster lägger nu platt på scenen. Placera fyra 6-0 Prolene vistelse suturer vid kanterna av vävnaden och fixera dem med elastisk drapering för att sprida kremastermuskeln vävnaden. Från och med nu kontinuerligt fukta vävnaden med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en 1 ml spruta (Figur 1).
20. Låt nu förberedelser för att vila i 15 min. Därefter injicerar0,05-0,1 ml 1% Rhodamine-dextran via den vänstra lårbensartären för kontrastförbättring av mikrocirkulation. Om några kemokiner eller inflammatoriska medel planeras för ansökan bör du nu lokalt fukta muskeln med respektive reagens med hjälp av en 1 ml spruta. Vid ett kontrollexperiment, fortsätt att fukta med PBS.

2. Intravital Mikroskopi

1. Håll musen fixerad på skede av driften och röra sig under ett fluorescensmikroskop modifierad för epi-belysning och ansluten till en CCD (charge-coupled device)-videokamera. Var särskilt noga med att inte rubba lårbensartären kateter.
2. Genomföra experiment med hjälp av en vattenimmersionsobjektiv.
3. Efter justering av målet för tillräcklig visualisering av cremaster mikrocirkulationen och före cellinjektion, stokastiskt definiera sex postkapillära venoler för senare analys av fast stamcells följsamhet.
4. Administrera fluorescensmärkta stamceller,upplöst i 200 l PBS, vid 0,4 x 10 ⁶ celler per injektion, med totalt fem på varandra följande injektioner använder lårbensartären kateter och en 1 ml spruta. Försiktigt skaka provcellen före den första injektionen.
5. Registrering stamcell rullande omedelbart efter cellinjektion, därigenom definierande "rullning" som en minskning mer än 50% av cell hastigheten längs endotelbeklädnaden i kombination med typiskt cellulärt "stick and release" rörelser. Utför räkning av rullande stamceller och alla stamceller som passerar ett fördefinierat venular avstånd under 1 min för observation efter varje injektion. Mängden stamcells rullande uttrycks som procentandel av alla passerande celler. Räkna inte celler uppvisar slump korta tjudra fenomen som rullande celler.
6. Efter den sista cellen injektionen bestämma antalet fast vidhäftande stamceller genom att räkna och ange beloppet i förhållande till den beräknade endothelial ytan av the sex fördefinierade venoler (diameter x längd x π) som vidhäftande celler / mm ^2. Fast vidhäftning anses när ingen cellrörelse är detekterbar för 30 sek.
7. Efter slutförandet av intravital mikroskopi försiktigt bort kremastermuskeln och förvara den i motsvarighet till senare analys (immunohistokemi eller molekylärbiologi). Offra djuret genom halshuggning. Analysen av intravital mikroskopi inspelningar för kvantifiering av stamceller rullning och fast endotelial adhesion samt mikrovaskulära hemodynamik, såsom röda blodkroppar hastigheten (mm / sek), fartygets längd (im), kärldiameter (| im), vägg andel hastighet (s ^-1), bör utföras offline med en utredare förblindas till respektive experimentell vävnadsbehandling utnyttjar ett bildbehandlingsprogram.

Representative Results

I allmänhet samverkan av direkt injiceras stam-eller stamfaderceller med det vaskulära endotelet inom kremastermuskeln mikrocirkulationen är en sällsynt företeelse och förekommer uteslutande i postkapillära venoler (diameter 30-80 ^ m). På grund av fluorescensmärkning rullande och fast vidhäftande stamceller tydligt kan kvantifieras i separation från cirkulerande endogena leukocyter i de observerade venoler (Figur 2).

De mikrocirkulatoriska villkor som representeras av blodflödeshastigheten och vägg skjuvhastighet oftast inte skiljer sig markant mellan de olika försöksgrupperna med olika chemokine behandling (Tabell 1).

Lokal behandling av kremastermuskeln vävnaden med olika kemokiner eller förmedlare av inflammatorisk respons, är t.ex. SDF-1α (stromal cell-derived factor-1-alfa) eller TNF-α (tumörnekrosfaktor-alfa) kapabel att härma specifika milcroenvironmental förhållanden. Sådana villkor öka stamcells-endothelial cell interaktioner i ett annat belopp, beroende på den specifika chemokine / medlare tillämpas och stamcellspopulationen injiceras (Figur 3) ^12. Möjligheten att tydligt kvantifiera dessa olika mönster av stamcells-endothelial cell interaktioner möjliggör för utvärdering av migrationspotentialen i specifika populationer stamceller inom definierade mikromiljöer i vivo innan föra dessa befolkningar att ytterligare kliniska tester.

Dessutom kommer effekterna av vissa patofysiologiska förhållanden som påverkar endotel funktion, såsom salpeter-oxid-brist, visats med användning av knockout-djur ^9.

Figur 1. Illustration av de viktigaste mikrosteg (AF) i mus cremaster muscle förberedelse för efterföljande intravital mikroskopi.

Figur 2. Intravital mikroskopi av c-kit ^+-celler i en murin kremastermuskeln beredning. Intravaskulär bakgrund ges av rodamin-dextran. (Af) En serie av sex bilder i följd med valsning (svarta pilar) och starkt adherenta (vit pil) karboxi-fluorescein-d-acetat succinimidylester-märkt c-kit ^+-celler i venular vaskulaturen. Lab Invest, 2008, vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Figur 3. Kvantitativ analys av samspelet mellan c-kit ⁺ celler och endotelceller som bygger på intravital fluorescens mikroskopiska bilder. (a) Antalet rullande c-kit ^+-celler på venular endotel (uttryckt i procentandel av alla passerande celler) i murina cremaster muskler som utsätts för SDF-1α, TNF-α, eller en kombination av båda i förhållande till c-kit ⁺ cell injektion utan kemokinreceptorantagonist förbehandling (kontroll). Behandling med SDF-1α ensamt och kombinationen av SDF-1α + TNF-α ökad procentandel av böljande c-kit ^+-celler. (B) Antalet starkt adherenta c-kit ^+-celler per mm ² av venular endotelbeklädnaden ökar signifikant endast efter behandling med kombinationen av SDF-1α + TNF-α. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (* P <0,05 jämfört med kontroll). Lab Invest, 2008, vol 88. Kaminski, A., Ma, N., Donndorf, P. et al.

Mus Typ	Experimentell Grupp	röda blodkroppar hastighet(Mm / s)	vägg skjuvhastighet (s -1)
Vildtyp	Kontroll	0,7 ± 0,2	43 ± 32
Vildtyp	SDF-1α	0,5 ± 0,2	51 ± 31
Vildtyp	TNF	0,4 ± 0,2	45 ± 24
Vildtyp	SDF-1 α + TNF-α	1,0 ± 0,5	117 ± 26

Tabell 1. Röda blodkroppar hastigheter och vägg skjuvhastigheter i venoler av murina cremaster muskler vid baslinjen. Analys utfördes med användning CapImage Mjukvara (Zeintl, Heidelberg, Tyskland) i muskelberedningar av vildtyp möss efter behandling med SDF-1α, TNF-α. Data uttrycks som medelvärde ± SD Skillnader mellan enskilda grupper inte befanns vara signifikant. et al.

Discussion

Intravital fluorescensmikroskopi möjliggör direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner. Kremastermuskeln modell är särskilt användbar, eftersom mikrokirurgisk exponering och tekniker intravital visualisering har blivit väl etablerat under forskning på leukocyt-endotel interaktioner och olika kemiska komponenter kan selektivt anbringas till målvävnaden genom enkel superfusionstekniken. På grund av avsaknaden av rörelse artefakter och svår bildbrus, just denna modell, i jämförelse med andra intravital-mikroskopi inställningar, ger optimala förutsättningar för visualisering av cell-cell interaktioner.

Modellen gör det möjligt att avslöja viktiga microenvironmental förutsättningar, för första stamcells rekryteringen att ske i en levande organism. Vid behov kan endogena leukocyter fungera som positiva kontroller för validering och bevisa av principen om stamcells beteende.

jove_content "> Före en akut djurmodell och använda direkt arteriell injektion istället för venös ansökan, eventuella begränsningar av kronisk cellmigrationsmodeller och / eller systemisk cell leverans - t.ex. cellförlust på grund av entrapment i avlägsna organ - kan undvikas Å andra. sidan är akut kirurgiskt vävnadstrauma som skulle kunna medföra en viss grad av vävnads aktivering själv. Därför är en atraumatisk kirurgisk förberedelse obligatoriska och stabil mikrocirkulatoriska förhållanden efter kremastermuskeln förberedelse måste uppnås på ett reproducerbart sätt före start med experimentella grupper.

Förekomsten av omfattande leukocyt-ackumulering inom de postkapillära venoler och betydande läckage av det fluorescerande färgämnet till den omgivande vävnaden vid början av intravital mikroskopi inspelningar i kontrolldjur indikera större kirurgiskt vävnadstrauma.

Men även när de tillämpar noggrann förbereransoneringstekniker, resultat som härrör från olika utredare är inte nödvändigtvis helt jämförbara på grund av något olika utgångsvävnad aktivering. Detta är anledningen till efterföljande experiment bör utföras av samma undersökare närhelst möjligt.

Designad för analys och kvantifiering av de första stegen i stamcells rekrytering till målvävnader, gör den nuvarande modellen tillåter inte uttalanden om definitiv stamcells orgel-engraftment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C1157
Rhodamine 6 G (1%)	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	83697
Ketamin (Ketanest)	Pfizer, Berlin, Germany	not available
Xylacin (Rompun)	Bayer, Leverkusen, Germany	not available
Dulbecco's Phosphate - buffered saline (PBS)	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P04-36500