Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion
Summary
Flödescytometrisk analys av Bimolecular Fluorescens Komplementering ger en hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metodik kan tillämpas på kartläggning bindande protein platser och för screening av faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.
Abstract
Bland metoder för att studera protein-proteininteraktion inre celler, är Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) relativt enkel och känslig. BiFC är baserad på produktion av fluorescens med hjälp av två icke fluorescerande fragment av ett fluorescerande protein (Venus, en gul fluorescerande protein variant, används här). Icke-fluorescerande Venus fragment (VN och VC) smälts till två interagerande proteiner (i det här fallet, AKAP-Lbc och PDE4D3), vilket ger fluorescens grund VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samverkan och bildandet av ett funktionellt fluorescerande protein inuti celler.
BiFC ger information om subcellulära lokalisering av proteinkomplex och styrkan i proteininteraktioner baserat på fluorescensintensitet. Emellertid är BiFC analys med användning av mikroskopi för att kvantifiera styrkan i protein-proteininteraktion tidskrävande och något subjektiva på grund av heterogenitet i proteinuttryck och interaktion. Genom koppling flödescytometriskanalys med BiFC metodik, kan det fluorescerande BiFC protein-proteininteraktion signalen mätas noggrant för en stor mängd celler på kort tid. Här visar vi en tillämpning av denna metod för att kartlägga områden i PDE4D3 som krävs för samspelet med AKAP-Lbc. Denna höga genomströmning metodik kan tillämpas på screening faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.
Introduction
650.000 protein-protein interaktioner beräknas existera i den mänskliga interactome, spela avgörande roller i att upprätthålla normala cellfunktioner 1,2. Förutom co-immunoprecipitation (co-IP), till guldmyntfoten studera protein-protein interaktion från cellysat, flera protein analyser fragmentkomplettering (PCA) har utvecklats för att förbättra känsligheten i detektion av protein-protein växelverkan inuti celler 3. Tekniker inkluderar Förster resonansenergiöverföring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), och Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) 4,5. BiFC är baserad på den förenklade sammanslutning av två fragment av ett fluorescerande protein (här använder vi Venus, en YFP variant) som var och en är fuserade till en potentiell interagerande protein partner (i detta exempel använder vi AKAP-Lbc och PDE4D3). Interaktion av de två proteiner av intresse inuti celler resulterar i funktionell fluorescens, som kan visualiseras genom fluorescence mikroskopi med antingen levande eller fixerade celler 6,7,8. Jämfört med andra PCA, är BiFC känslig och mindre tekniskt utmanande, med potential att studera cellulär lokalisering i levande celler. En stor nackdel med denna teknik är emellertid att en gång bildats, kan det fluorescerande proteinet komplexet inte vändas. Därför är det inte en bra metod för att studera dynamiska protein-protein växelverkan. I denna uppsats använder vi BiFC att kartlägga interaktionsställen av PDE4D3 med AKAP-Lbc genom att övervaka fluorescensintensiteterna av Venus. Jämfört med traditionell analys med fluorescens mikroskopi, vilket är tidskrävande och arbetsintensiv (om den inte utförs med hjälp av automatiserade hög genomströmning maskiner), ger flödescytometri en enkel kvantitativ analys av tusentals celler i en heterogen population under en kort tid 9, 10. Här, genom att utföra en sida-vid-sida jämförelse av flödescytometrisk-BiFC analys och traditionella co-IP, visar vi att de två metod jämförbara uppgifter, dock är flödescytometrisk BiFC analys mindre tidskrävande och använder mindre material, vilket kan vara mer användbart när celler av intresse är begränsade.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC är en enkel och känslig metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metod kan inte användas för att identifiera nya protein-protein växelverkan, dock är det särskilt lämpligt att bekräfta protein-protein växelverkan inuti celler och studera funktionella egenskaper, såsom subcellulära lokalisering av proteinkomplex, kartläggning av protein-protein växelverkan platser, och för screening av små molekyler / peptider som kan modulera protein-proteininteraktion. Eftersom VN och VC-fragmenten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar O'Bryan labbet på UIC för kritisk experimentell utvärdering och diskussion. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 11SDG5230003 till GKC och National Center för främjande Translational Science – UIC Centrum för klinisk och translationell vetenskaper Grant UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
