Summary

Flödescytometrianalyser av Bimolecular Fluorescens Komplettering: En hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-protein interaktion

Published: August 15, 2013
doi:

Summary

Flödescytometrisk analys av Bimolecular Fluorescens Komplementering ger en hög genomströmning kvantitativ metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metodik kan tillämpas på kartläggning bindande protein platser och för screening av faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.

Abstract

Bland metoder för att studera protein-proteininteraktion inre celler, är Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) relativt enkel och känslig. BiFC är baserad på produktion av fluorescens med hjälp av två icke fluorescerande fragment av ett fluorescerande protein (Venus, en gul fluorescerande protein variant, används här). Icke-fluorescerande Venus fragment (VN och VC) smälts till två interagerande proteiner (i det här fallet, AKAP-Lbc och PDE4D3), vilket ger fluorescens grund VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samverkan och bildandet av ett funktionellt fluorescerande protein inuti celler.

BiFC ger information om subcellulära lokalisering av proteinkomplex och styrkan i proteininteraktioner baserat på fluorescensintensitet. Emellertid är BiFC analys med användning av mikroskopi för att kvantifiera styrkan i protein-proteininteraktion tidskrävande och något subjektiva på grund av heterogenitet i proteinuttryck och interaktion. Genom koppling flödescytometriskanalys med BiFC metodik, kan det fluorescerande BiFC protein-proteininteraktion signalen mätas noggrant för en stor mängd celler på kort tid. Här visar vi en tillämpning av denna metod för att kartlägga områden i PDE4D3 som krävs för samspelet med AKAP-Lbc. Denna höga genomströmning metodik kan tillämpas på screening faktorer som reglerar protein-proteininteraktion.

Introduction

650.000 protein-protein interaktioner beräknas existera i den mänskliga interactome, spela avgörande roller i att upprätthålla normala cellfunktioner 1,2. Förutom co-immunoprecipitation (co-IP), till guldmyntfoten studera protein-protein interaktion från cellysat, flera protein analyser fragmentkomplettering (PCA) har utvecklats för att förbättra känsligheten i detektion av protein-protein växelverkan inuti celler 3. Tekniker inkluderar Förster resonansenergiöverföring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), och Bimolecular Fluorescens Komplettering (BiFC) 4,5. BiFC är baserad på den förenklade sammanslutning av två fragment av ett fluorescerande protein (här använder vi Venus, en YFP variant) som var och en är fuserade till en potentiell interagerande protein partner (i detta exempel använder vi AKAP-Lbc och PDE4D3). Interaktion av de två proteiner av intresse inuti celler resulterar i funktionell fluorescens, som kan visualiseras genom fluorescence mikroskopi med antingen levande eller fixerade celler 6,7,8. Jämfört med andra PCA, är BiFC känslig och mindre tekniskt utmanande, med potential att studera cellulär lokalisering i levande celler. En stor nackdel med denna teknik är emellertid att en gång bildats, kan det fluorescerande proteinet komplexet inte vändas. Därför är det inte en bra metod för att studera dynamiska protein-protein växelverkan. I denna uppsats använder vi BiFC att kartlägga interaktionsställen av PDE4D3 med AKAP-Lbc genom att övervaka fluorescensintensiteterna av Venus. Jämfört med traditionell analys med fluorescens mikroskopi, vilket är tidskrävande och arbetsintensiv (om den inte utförs med hjälp av automatiserade hög genomströmning maskiner), ger flödescytometri en enkel kvantitativ analys av tusentals celler i en heterogen population under en kort tid 9, 10. Här, genom att utföra en sida-vid-sida jämförelse av flödescytometrisk-BiFC analys och traditionella co-IP, visar vi att de två metod jämförbara uppgifter, dock är flödescytometrisk BiFC analys mindre tidskrävande och använder mindre material, vilket kan vara mer användbart när celler av intresse är begränsade.

Protocol

Ett. Cell Transfektion Tavla celler dagen före transfektion, plätering färre celler för immunofluorescens. För immunofluorescens: i en 6-brunnar, päls glas täckglas (1 per brunn) med 0,02% gelatin vid 37 ° C under minst 4 timmar, tvätta en gång med medium, och för varje brunn, platta 1 x 10 5 HEK 293T celler i 2 ml fullständigt tillväxtmedium [Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) plus 10% FBS]. För flödescytometriska och Western blot-analyser: platta 1,2 x 10…

Representative Results

AKAP-Lbc och PDE4D3 konstruktionerna (Figur 1B) smältes till VN och VC fragment, respektive. Interaktion av AKAP-Lbc och PDE4D3 resulterar i funktionell YFP fluorescens (Figur 1A). Här använder vi BiFC metod att kartlägga AKAP-Lbc-bindningsställen i PDE4D3. Uppströms konserverad region 1 (UCR1), uppströms konserverad region 2 (UCR2) och katalytiska regionen (CAT) är konserverade bland PDE4-gruppens proteiner, därför, full längd (FL), UCR1 och UCR2 plus CAT användes för scre…

Discussion

BiFC är en enkel och känslig metod för att studera protein-proteininteraktion. Denna metod kan inte användas för att identifiera nya protein-protein växelverkan, dock är det särskilt lämpligt att bekräfta protein-protein växelverkan inuti celler och studera funktionella egenskaper, såsom subcellulära lokalisering av proteinkomplex, kartläggning av protein-protein växelverkan platser, och för screening av små molekyler / peptider som kan modulera protein-proteininteraktion. Eftersom VN och VC-fragmenten …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar O'Bryan labbet på UIC för kritisk experimentell utvärdering och diskussion. Detta arbete stöddes av American Heart Association Grant 11SDG5230003 till GKC och National Center för främjande Translational Science – UIC Centrum för klinisk och translationell vetenskaper Grant UL1TR000050.

Materials

      REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092  
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063  
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044  
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804  
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R  
α-tubulin Sigma DM1A, T9026  
Anti-GFP antibody Clontech 632569  
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184  
HEK 293T cells ATCC CRL-11268  
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663  
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144  
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300  
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052  
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF  
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931  
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15  
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P  
      EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow    
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc    
Electrophoresis and transfer unit Biorad    
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter    

References

  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O’Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

View Video