Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Flow cytometri af bimolekylær Fluorescens Complementation: En High Throughput Kvantitativ metode til at studere protein-protein interaktion

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

Flowcytometrisk analyse af bimolekylær Fluorescens komplementation giver en høj produktion kvantitativ metode til at studere protein-protein-interaktion. Denne metode kan anvendes til kortlægning proteinbindingssteder og til screening faktorer, der regulerer protein-protein-interaktion.

Abstract

Blandt metoder til at studere protein-protein interaktioner i celler, er bimolekylær Fluorescens Complementation (BiFC) relativt simpel og følsom. BiFC er baseret på produktion af fluorescens under anvendelse af to ikke-fluorescerende fragmenter af et fluorescerende protein (Venus, en gul fluorescerende protein variant, anvendes her). Ikke-fluorescerende Venus fragmenter (VN og VC) fusioneres til to interagerende proteiner (i dette tilfælde AKAP-Lbc og PDE4D3), hvilket giver fluorescens grund VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaktion og dannelsen af ​​en funktionel fluorescerende protein i celler.

BiFC giver oplysninger om den subcellulære lokalisering af protein komplekser og styrken af ​​protein interaktioner baseret på fluorescensintensitet. Men BiFC analyse ved hjælp mikroskopi at kvantificere styrken af ​​protein-protein-interaktion er tidskrævende og noget subjektivt grund heterogenitet i protein-ekspression og interaktion. Ved kobling flowcytometriskanalyse med BiFC metode, kan den fluorescerende BiFC protein-protein-interaktion signal måles nøjagtigt til en stor mængde af celler i en kort tid. Her viser vi en anvendelse af denne metode til at kortlægge områder i PDE4D3 der er nødvendige for interaktion med AKAP-Lbc. Denne high throughput metode kan anvendes til screening faktorer, der regulerer protein-protein-interaktion.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

650.000 protein-protein interaktioner skønnes at eksistere i den menneskelige interactome, spiller afgørende roller i at opretholde normal celle-funktioner 1,2. Udover co-immunopræcipitation (co-IP), til guldstandarden studere protein-protein-interaktion fra cellelysat, flere proteinfragment komplementering assays (PCA) er blevet udviklet for at forbedre følsomheden i påvisning protein-protein-interaktion inde celler 3.. Teknikker indbefatter Forster resonans energi overførsel (FRET), bioluminescens resonansenergioverførsel (BRET), og bimolekylær Fluorescens komplementation (BiFC) 4,5. BiFC er baseret på den faciliterede associering af to fragmenter af en fluorescerende protein (her bruger vi Venus, en YFP variant), der hver fusioneret til en potentiel interagerende protein partner (i dette eksempel bruger vi AKAP-Lbc og PDE4D3). Samspillet mellem de to proteiner af interesse i celler resulterer i funktionel fluorescens, som kan visualiseres ved fluorescence mikroskopi med enten levende eller fikserede celler 6,7,8. Sammenlignet med andre PCA'er, BiFC er følsom og mindre teknisk udfordrende, med potentiale til at studere cellulære lokalisering i levende celler. En væsentlig ulempe ved denne teknik er imidlertid, at når der dannes, kan den fluorescerende protein-komplekset ikke vendes. Derfor er det ikke en god metode til at studere dynamiske protein-protein-interaktion. I dette papir, bruger vi BiFC at kortlægge samspillet steder PDE4D3 med AKAP-Lbc ved at overvåge fluorescensintensiteterne af Venus. Sammenlignet med traditionel analyse ved anvendelse af fluorescensmikroskopi, hvilket er tidskrævende og arbejdskrævende (hvis de ikke udføres ved hjælp af automatiserede high throughput maskiner), giver flowcytometri en enkel kvantitativ analyse af tusindvis af celler i en heterogen population over en kort tid 9, 10.. Her, ved at udføre en side-by-side sammenligning af flowcytometrisk-BiFC analyse og traditionelle co-UP, viser vi, at de to metoder levere sammenlignelige data dog flowcytometrisk BiFC analyse ligger mindre tidskrævende og bruger mindre materiale, der kan være mere nyttigt, når celler af interesse er begrænset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Celletransfektion

  1. Plate celler dagen før transfektion udpladning færre celler til immunofluorescens.
    1. For immunfluorescens: i en 6-brønds plade, frakke dækglas (1 per brønd) med 0,02% gelatine ved 37 ° C i mindst 4 timer, vask en gang med medium og for hver brønd, x 10 5 plade 1 HEK 293T celler i 2 ml komplet vækstmedium [Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) plus 10% FBS].
    2. Til flowcytometrisk og Western blot-analyser: plade 1,2 x 10 5 HEK 293T celler / brønd i 2 ml komplet vækstmedium i 6-brønds plade (0.3 x 10 5 HEK 293T celler i 0,5 ml komplet vækstmedium per brønd i 24-brønds plade ).
  2. Forbered DNA til transfektion ifølge fremstilling s protokol: Effectene (Qiagen) bruges til immunofluorescens. Transit-LT1 (Mirus) anvendes til flowcytometrisk og Western Blot analyser. Mængden af ​​anvendt DNA anført nedenfor.
    24-brønds plade (ng) 6-brønds plade (ng)
    CFP-vector 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (fuldlængde PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminale fragment indeholdende UCR1 domæne) 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + KAT (a PDE4D3 C-terminale fragment indeholdende UCR2 og katalytisk domæner) 100
    Transfektion ved hjælp Effectene (6-brønd):
    1. Tilføj angivne mængde plasmid-DNA + 4 gl forstærker til 100 ul buffer EF, blandes og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Tilføj 5 ul Effectene, mix, og der inkuberes i 10 min vedstuetemperatur. Tilføj dråbevis til cellerne.
    Transfektion hjælp Transit-LT1 (6-well/24-well):
    1. Tilføj angivne mængde plasmid-DNA til 250 μl/50 pi Opti-MEM I serumfrit medium i en steril rør.
    2. Tilføj Transit-LT1 reagens den fortyndede DNA blandingen og pipette forsigtigt for at blande. (Transit-LT1 Reagent: DNA-forholdet er 3 pi Transit-LT1 reagens per 1 ug DNA).
    3. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, og der tilsættes dråbevis til cellerne.

2.. Cell Forberedelse til Flowcytometri, Western Blot, og Immunofluorescence

  1. 24 timer efter transfektion kontrollere fluorescens under epifluorescensmikroskop før høst celler.
  2. Cell forberedelse til flowcytometrisk analyse:
    1. Vask cellerne med 0,5 ml / 2 ml iskold PBS 24-well/6-well plader.
    2. Frigøre celler ved 50 μl/250 pi 0,05% trypsin.
    3. Neutraliser trypsin med 200 ul / 1 ml DMEM-medium.
    4. Collect 250 ul celler (både 24 brønde og 6-brønds plade) ved centrifugering ved 500 xg i 5 min, det bruger de tilbageværende celler (1 ml) til Western blot analyse.
    5. Resuspender celler i 250 pi FACS buffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], butik på is til flowcytometrisk analyse. Celler kan også fastgøres i 1% paraformaldehyd (i PBS) hvis flowcytometrianalyse ikke vil være umiddelbar.
  3. Cell forberedelse til Western blot-analyse: udført parallelt med celle forberedelse til flowcytometri analyse.
    1. Vask cellerne 1x med 2 ml iskold PBS, lyseres cellerne ved tilsætning af 100 pi cellelysis puffer [10 mM natriumphosphatbuffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
    2. Saml cellelysat ved centrifugering i 10 minutter ved 21.000 xg ved 4 ° C.
    3. Kvantificere proteinkoncentration ved Bradford proteinassay, indlæse lige store mængder af protein per bane til SDS-PAGE, og overførsel til nitrocellulose for immunblotning.
    4. Cell forberedelse til immunofluorescens.
      1. Skyl celler 3x med 2 ml PBS, fix celler i 1 ml 3,7% paraformaldehyd (i PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter vaske 3x med 2 ml PBS i 5 min.
      2. Monter dække slip på en glasplade, ved hjælp af montage medium. Seal dækglasset kanterne med neglelak, hvis nødvendigt.
      3. Opbevar dias ved 4 ° C forud for eksamen.

    3.. Flowcytometri og immunfluorescensmikroskopi

    1. Flowcytometri udføres under anvendelse af en Beckman Coulter Cyan ADP, udstyret med 488 nm, 405 nm, og 642 nm faststoflasere. Summit software bruges til indsamling og analyse.
      1. Kalibrere flowcytometer hjælp af standard perler.
      2. Plot Forward scatter (FSC) / Sidelæns scatter (SSC) på en lineær skala for gating levende celler befolkning.
      3. Plot FSC / spænding puls bredde for gating ikke-aggregeret levende celler befolkning.
      4. Plot count/FL6 (FFP fluorescence, 405 nm) på en logaritmisk skala for gating ikke-aggregerede levende CFP-positive celler.
      5. Plot count/FL1 (YFP fluorescens, 488 nm) på en logaritmisk skala for BiFC intensitet.
      6. Kør YFP-CFP-double negative prøver, juster FSC, SSC, FL1 og FL6 fotomultiplikatoren rør (PMT) spænding for at fastsætte tærsklen for hvert signal.
      7. Kør enkelt positiv (både YFP + og FFP +) prøver for fremtidens off-line kompensation
      8. Erhverve mindst 10.000 gatede hændelser (ikke-aggregerede levende FFP + celler) til analyse.
    2. Immunfluorescensmikroskopi udføres ved hjælp af et Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop Bemærk:. Det er vigtigt at holde alle indstillinger (såsom zoom, pinhole, detektor gain, forstærker offset, frame størrelse, scan hastighed, scan-gennemsnittet og laser power) konsistent mellem prøver til korrekt sammenligning af alle data.

    4.. Data Analysis (udføres ved hjælp af Summit Software)

    1. Opsæt analysen protokol svarende til den, for acquisition med ordentlig gating:
      Gate 1 i FSC / SSC dot plot for levende celler.
      Gate 2 i FSC / puls bredde Gate 1 for ikke-aggregerede levende celler.
      Gate 3 i count / CFP i Gate 3 for ikke-aggregeret CFP + levende celler.
    2. Kompensere YFP og CFP signal ved hjælp af YFP + og den fælles fiskeripolitiks + enkelt positive celler.
    3. Re-bestemme cut-off linjer for den fælles fiskeripolitiks / YFP-positive celler.
    4. Export YFP betyder (MFI) i den fælles fiskeripolitik + celler til Excel til data-plotning.
    5. Normalisere YFP MFI til ekspressionsniveauer af AKAP-Lbc, PDE4D3 og lastning kontrol α-tubulin, som bestemt ved Western blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AKAP-Lbc og PDE4D3 konstruktioner (figur 1B) blev fusioneret til VN og VC-fragmenter. Interaktion mellem AKAP-Lbc og PDE4D3 resultater i funktionel YFP fluorescens (figur 1A). Her bruger vi den BiFC metode til at kort AKAP-Lbc-bindingssteder i PDE4D3. Opstrøms konserveret region 1 (UCR1), opstrøms konserveret region 2 (UCR2) og katalytiske region (CAT) er konserveret blandt PDE4 familiens proteiner derfor fuld længde (FL), UCR1 og UCR2 plus CAT blev anvendt til screening af bindingsstedet for PDE4D3 til AKAP-Lbc. Ekspressionen af VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3-fragmenter i HEK 293T celler resulterer i fluorescens med forskellig intensitet (figur 1C). BiFC viser, at både UCR1 og UCR2 + CAT bidrage til interaktionen af ​​PDE4D3 med AKAP-Lbc. Større fluorescensintensitet følge AKAP-Lbc-UCR1 interaktion, når der sammenlignes med AKAP-Lbc-UCR2 + CAT, indikerer, at PDE-UCR1 binder til AKAP-Lbc bedre end PDE-UCR2 + CAT.

(figur 2A), og celleaggregater blev udelukket ved hjælp af SSC vs Pulse Width dobbelt prik (figur 2B). Celler med BiFC signal eller FFP udtryk alene var used til at bestemme kompensation og cut-off for celler uden fluorescens (figur 2C-2F). FFP vektor blev cotransficeret med BiFC konstruktioner og FFP udtryk blev anvendt som en positiv markør for at angive en vellykket transfektion. Kun FFP +-celler blev anvendt til måling af BiFC fluorescens. Transfektion af stigende mængder PDE4D3 resulterede i øget Venus (YFP) BiFC signal (figur 3A), mens FFP signal forblev uændret (figur 3B). Ekspression af VN-AKAP-Lbc og stigende mængder af VC-PDE4D3 blev bekræftet ved Western blot (figur 3C). Samlet steg PDE ekspression resulterede i en lineær stigning i BiFC fluorescens korrelere til PDE ekspressionsniveauer (figur 3D). Disse resultater valideret anvendelse af flowcytometri at kvantificere AKAP-Lbc-PDE4D3 interaktion ved at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af BiFC. Vi har derfor brugt denne metode til kort AKAP-LBC bindingssteder inden PDE4D3 ved hjælp af VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruktioner. Overensstemmelse med vores observationer i figur 1C, udtryk for VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3-UCR2 + CAT resulterede i lavere BiFC signal i forhold til VC-PDE4D3-FL og VC-PDE4D3-UCR1 (figur 4B). Lignende protein ekspression blev observeret i alle flow prøver (figur 4C) og gennemsnitlig fluorescens blev normaliseret til de relative ekspressionsniveauer af AKAP-Lbc, PDE4D3, og α-tubulin. Derfor normaliseret BiFC MFI indikerer, at der ikke er nogen forskel i fluorescensintensiteten mellem AKAP-Lbc-PDE4D3-FL og AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1, men meget lavere signal for AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + CAT interaktion (figur 4A ). Disse resultater antyder, at der er flere regioner i PDE4D3 der interagerer med AKAP-Lbc, og at PDE4D3-UCR1 er den primære region interaktion med AKAP-Lbc. Dette resultat blev også bekræftet af co-IP, guldstandarden for protein-protein-interaktion (figur 5).

Figur 1
Figur 1. BiFC analyse af AKAP-Lbc-PDE4D3-fragmentet interaktion ved immunfluorescens mikroskopi. A) Skematisk repræsentant for bimolekylær Fluorescens komplementation (BiFC). Venus fragmenter, VN og VC fusioneres til AKAP-Lbc og PDE4D3 hhv. AKAP-LBC-PDE4D3 interaktion resulterer i funktionel YFP fluorescens. B) Skematisk diagram af PDE4D3 konstruktioner, der anvendes til kortlægning. C) Repræsentative BiFC signaler af transficerede HEK 293T celler. Celler blev cotransficeret med VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruktioner (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT) for BiFC analyse. CFP-vektor blev også cotransficeret som transfektion markør. 24 timer efter transfektion, blev cellerne fikseret til billeddannelse. BiFC signal er vist i grøn og den fælles fiskeripolitik, er vist i pseudo rødt i de sammenlagte tal. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Figur 2
Figur 2. Bestemmelse af porte og erstatning for FACS-analyse. A) FSC vs SSC dot plot til gate levende celler og til at udelukke snavs og døde celler. B) Side Scatter vs pulsbredde dot plot til gate enkelte celler og udelukke aggregater. C) Celler, der udtrykker den fælles fiskeripolitik (CFP + celler), før kompensation. D ) Celler, der udtrykker CFP (FFP + celler) efter YFP kompensation. Cut-off line for celler med YFP ekspression blev re-bestemt. E) celler med BiFC signal (YFP + celler), før erstatning. F) celler med BiFC signal (YFP + celler), efter den fælles fiskeripolitik kompensation. Cut-off line for celler med FFP ekspression blev re-bestemt.target = "_blank"> Klik her for at se større figur.

Figur 3
Figur 3. Analyse af AKAP-Lbc-PDE4D3 interaktion ved hjælp BiFC-Flowcytometri ved at variere mængden af PDE4D3 udtryk. A) Øget BiFC signal inde FFP + celler transficeret med stigende mængder af VC-PDE4D3. Celler blev transficeret med den fælles fiskeripolitik (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng), og stigende mængder af VC-PDE4D3 (2,5 ng til 80 ng). Non-aggregerede CFP + levende celler var gated og YFP fluorescens er vist som YFP vs Forward Scatter double dot plot. YFP +-celler er vist i grøn. Repræsentative data fra 5 ng, 20 ng, og 80 ng VC-PDE4D3 vises. B) FFP fluorescens i levende celler er vist som den fælles fiskeripolitik vs Forward Scatter dobbelt dot plot, der angiver konsekvent fælles fiskeripolitik fluorescens blandt alle prøverne. C) Western blot-analyse viser stigende PDE4D3 expression med konsekvent ekspression af AKAP-Lbc og α-tubulin (anvendt som en belastning kontrol). D) Venus (YFP) Middel fluorescensintensitet (MFI) FFP + celler er korreleret med VC-PDE4D3 ekspression. Fold ændring i både YFP MFI fra FFP + celler er plottet sammen med den fælles fiskeripolitik MFI fold ændring fra ikke-aggregerede levende celler. Relative ekspressionsniveauer af VC-PDE4D3 bestemt af Image J analyse af Western blot er også plottet. Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4.. BiFC analyse af AKAP-Lbc interaktion med PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT anvendelse af flowcytometri. A) AKAP-Lbc-PDE4D3-fragment interaktion blev kvantificeret ved Venus-MFI normaliseret til protein-ekspression (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragmenter og lastning kontrol α-tubulin). Difference i BiFC signal blev undersøgt af en variansanalyse (ANOVA) A p-værdi <0,01 anses for meget signifikant (**), mens ap-værdi> 0.05 anses ikke signifikant (NS). B) Repræsentant BiFC signal i transfekterede HEK 293T celler. HEK 293T celler blev cotransficeret med den fælles fiskeripolitik, VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruktioner (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT). Non-aggregerede levende FFP + celler blev gated og deres BiFC fluorescens vises i YFP vs Forward Scatter double dot plot. C) Western blot angiver sammenligneligt udtryk for AKAP-Lbc og PDE4D3-fragmenter. Klik her for at se større figur .

Figur 5
Figur 5. Bekræftelse af Flowcytometrianalyse ved co-immunofældning. HEK 293T celler blev cotransficeretfor ekspression af V5-AKAP-Lbc og GFP-PDE4D3 konstruktioner (-FL,-UCR1,-UCR2 + CAT). 48 timer efter transfektion blev AKAP-Lbc immunpræcipiteret med V5-agaroseperler. Binding af PDE4D3-FL UCR1 og UCR2 + CAT blev påvist ved SDS-PAGE og Western blot under anvendelse af anti-GFP-primært antistof. Den tilsvarende PDE4D3 indgang som anvendes for immunpræcipitering vises også, hvilket indikerer tilsvarende udtryk for alle PDE4D3-fragmenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BiFC er en enkel og følsom metode til at studere protein-protein-interaktion. Denne metode kan ikke anvendes til at identificere nye protein-protein interaktioner, men det er især praktisk at bekræfte protein-protein-interaktion i celler og at studere funktionelle egenskaber, såsom subcellulær lokalisering af protein-komplekser, kortlægning af protein-protein interaktion steder, og til screening af små molekyler / peptider, der kan modulere protein-protein-interaktion. Fordi VN og VC-fragmenter er ikke-fluorescerende, baggrundsfluorescens er lav, således medvirken følsomheden af ​​denne analyse. Tid er nødvendig for at modne / stabilisere VN-protein VC-protein-interaktion, der er således forsinkelse at visualisere protein-protein-interaktion, og optimale tidspunkter point Det kan derfor bestemmes empirisk. Det skal også bemærkes, at VN-protein-VC-protein-interaktion ikke er reversibel, således desværre med strøm Venus BiFC konstruerer dette assay er ikke egnet to undersøgelse dynamiske kinetik af protein-protein-interaktion.

Ordentlig kontrol er vigtige for BiFC analyse. En egnet negativ kontrol omfatter ikke-interagerende proteiner eller ikke-specifikke peptider i den pågældende BiFC vektor, eller om muligt en mutant, der forstyrrer protein-protein-interaktion. Tomme BiFC vektor er ikke en god kontrol, som det resulterer i ikke-specifik høj baggrundsfluorescens. Hvis BiFC ikke er observeret i to interagerende proteiner, bør ekspression analyseres. Desuden kan BiFC signalet afhængigt af de protein-protein interaktion steder. Det skal bemærkes, at rumlig modulation af VN og VC interaktion også kan påvirke fluorescensintensitet og derfor er det i første omgang vigtigt at udføre BiFC eksperimenter med både C-terminale og N-terminale VN / VC ekspressionskonstruktioner. For eksempel kan BiFC ikke forekomme, hvis protein-protein interaktion blokerer re-sammenslutning af Venus fragmenter. Derfor flere kombinationer af VN og VC konstruerer skuldred testes (dvs. både C og N-terminale proteinfusioner).

Fluorescensintensitet BiFC er proportional med styrken af ​​protein-protein-interaktion, med højere BiFC intensitet angiver stærkere interaktion og en lavere fluorescensintensitet tyder svagere interaktion. BiFC MFI bruges derfor som indikator for protein-protein-interaktion. For præcis analyse af protein-protein-interaktion ved BiFC, er det meget vigtigt, at Western blot-analyse udføres for at sikre lige udtryk for forskellige konstruktioner, og at ingen protein nedbrydning, der sker, der kan interferere med korrekt analyse. Lysat fra de samme prøver foretrækkes derfor til Western blot-analyse for at bestemme lignende proteinekspression for alle analyserede prøver. Desuden er det vigtigt at fastsætte passende mængde af plasmider til transfektion at sikre lineær ekspression og interaktion af proteiner, og blandt dette interval, korrelerer interaktionen af ​​protein with fluorescensintensitet BiFC signal.

Lav mængde af FFP plasmid anvendes som en markør for vellykket transfektion, så kun FFP positive celler blev analyseret her. En anden fluorescerende protein, såsom RFP kunne anvendes til at minimere gennemsivning mellem farver 11. For Flowcytometri er enkelt positive celler skulle medtages for kompensation. Hvis det er muligt, er mindst 10.000 fiskeripolitiks positive celler tælles for at sikre en god stikprøve.

Sammenfattende vi her viser, at kobling BiFC metode med flowcytometrisk analyse kan anvendes som en god indikator for protein-protein-interaktion i celler. Traditionel analyse af BiFC hjælp immunofluorescens mikroskop er tidskrævende, og prøve størrelse er meget lavere end den, der svarer til flowcytometrisk analyse. Således kan kobling flowcytometri med BiFC være fordelagtig til analyse af protein-protein-interaktion, når transfektionseffektivitet er lav. I detterapport, tog vi fordel af BiFC-Flowcytometri at kortlægge samspillet steder i PDE4D3 for binding til AKAP-Lbc. Denne teknik kan også udvides til screening for molekyler eller peptider, som kan forstyrre eller forøge protein-protein-interaktion, for lægemiddelforskning 12.. Denne metode kan også anvendes til at studere visse fysiologiske begivenheder, såsom ligand-induceret internalisering af GPCR s 13..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker O'Bryan laboratorium på UIC til kritisk eksperimentel evaluering og diskussion. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Grant 11SDG5230003 til GKC og National Center for Fremme Translationel Science - UIC Center for klinisk og translationel Sciences Grant UL1TR000050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, (Unit 14), 11 (2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Flow cytometri af bimolekylær Fluorescens Complementation: En High Throughput Kvantitativ metode til at studere protein-protein interaktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter