Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon

doi: 10.3791/50529 Published: August 15, 2013

Summary

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation gir en høy gjennomstrømming kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon. Denne metoden kan brukes til kartlegging proteinbindingsseter og for screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.

Abstract

Blant metoder for å studere protein-protein interaksjon inne i celler, er bimolecular fluorescens complementation (BiFC) relativt enkel og følsom. BiFC er basert på produksjon av fluorescens ved hjelp av to ikke-fluorescerende fragmenter av et fluorescerende protein (Venus, en gul fluorescerende protein variant, blir brukt her). Non-fluorescerende Venus fragmenter (VN og VC) er smeltet til to interagerende proteiner (i dette tilfellet, AKAP-Lbc og PDE4D3), gir fluorescens grunn VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samhandling og dannelse av et funksjonelt fluorescerende protein inni cellene.

BiFC gir informasjon om subcellular lokalisering av protein komplekser og styrken av protein interaksjoner basert på fluorescens intensitet. Imidlertid er BiFC analyse ved hjelp av mikroskopi for å kvantifisere styrken av protein-protein interaksjonen tidkrevende og noe subjektivt på grunn av heterogeniteten i proteinekspresjon og interaksjon. Ved kopling flowcytometriskanalyse med BiFC metodikk, kan den fluorescerende BiFC protein-protein interaksjon signal måles nøyaktig for et stort antall av celler i en kort tid. Her viser vi en anvendelse av denne metodikken for å kartlegge områder i PDE4D3 som er nødvendige for samhandling med AKAP-Lbc. Denne høye gjennomstrømning metodikk kan anvendes til screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

650.000 protein-protein interaksjoner er anslått til å eksistere i den menneskelige interactome, spiller viktige roller i å opprettholde normal celle funksjoner 1,2. Foruten co-immunoutfelling (co-IP), for å studere den gull-standarden protein-protein interaksjon fra cellelysat, flere proteinfragment komplementering assays (PCA) er blitt utviklet for å forbedre følsomheten i å oppdage protein-protein interaksjon inne i celler 3. Teknikker inkluderer Förster resonans energi overføring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), og bimolecular Fluorescens complementation (BiFC) 4,5. BiFC er basert på den forenklede sammenslutning av to fragmenter av et fluorescerende protein (her bruke Venus, en YFP variant) som hver er kondensert til en potensiell interagerende protein partner (i dette eksempelet bruker vi AKAP-Lbc og PDE4D3). Interaksjon av de to proteiner av interesse inne i celler resulterer i funksjonell fluorescens, som kan visualiseres ved fluorescence mikroskopi ved hjelp av enten levende eller faste celler 6,7,8. Sammenlignet med andre PCAS, er BiFC sensitiv og mindre teknisk krevende, med potensial til å studere cellulær lokalisering i levende celler. En stor ulempe med denne teknikken er imidlertid at en gang dannet, kan den fluorescerende protein kompleks ikke reverseres. Derfor er det ikke er en god metode for å studere dynamisk protein-protein interaksjon. I denne artikkelen bruker vi BiFC å kartlegge samspillet områder av PDE4D3 med AKAP-Lbc ved å overvåke fluorescensintensiteter av Venus. Sammenlignet med tradisjonelle analyse ved hjelp av fluorescens-mikroskopi, som er tidkrevende og arbeidskrevende (hvis ikke utført ved hjelp av automatisert maskineri høy gjennomstrømning), gir strømningscytometri en grei kvantitativ analyse av tusener av celler i en heterogen populasjon over en kort tid 9, 10. Her, ved å utføre en side-ved-side-sammenligning av flowcytometrisk analyse-BiFC og tradisjonelle co-IP, viser vi at de to methods gi sammenlignbare data, er imidlertid flowcytometrisk analyse BiFC mindre tidkrevende og krever mindre materiale som kan være mer nyttig når celler av interesse er begrenset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Cell Transfection

  1. Plate celler dagen før transfeksjon, Plating færre celler for immunfluorescens.
    1. For immunfluorescens: I en 6-brønns plate, belegge glass dekkglass (1 per brønn) med 0,02% gelatin ved 37 ° C i minst 4 timer, vaskes en gang med medium, og for hver brønn, platen 1 x 10 5 HEK 293T celler i 2 ml komplett vekstmedium [Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) pluss 10% FBS].
    2. For flowcytometrisk og Western blot analyser: plate 1,2 x 10 5 HEK 293T celler / brønn i 2 ml komplett medium for vekst i 6-brønn plate (0,3 x 10 5 HEK 293T celler i 0,5 ml fullstendig vekst medium per brønn i 24-brønners plate ).
  2. Forbered DNA for transfeksjon i henhold til produksjon protokoll: Effectene (Qiagen) brukes for immunfluorescens. Transitt-LT1 (Mirus) brukes for flowcytometrisk og vestlige blot analyser. Mengden av DNA som brukes er listet nedenfor.
    24-brønns plate (ng) 6-brønns plate (ng)
    CFP-vektor 10 50
    VN N-AKAP-Lbc 200 1000
    VC N-PDE4D3-FL (full-lengde PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100
    VC N-PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminal fragment som inneholder UCR1 domene) 100
    VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (en PDE4D3 C-terminal fragment som inneholder UCR2 og katalytiske domener) 100
    Transfection hjelp Effectene (6-brønn):
    1. Legg angitte mengden av plasmid DNA + 4 mL enhancer til 100 pl buffer EC, blanding, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Tilsett 5 mL Effectene, mix, og inkuberes i 10 minutter vedromtemperatur. Legg dråpevis til cellene.
    Transfeksjon med transitt-LT1 (6-well/24-well):
    1. Legg angitte mengden av plasmid DNA til 250 μl/50 ul av OPTI-MEM I serumfritt medium i et sterilt rør.
    2. Legg transitt-LT1 reagens til den fortynnede DNA blandingen og pipette forsiktig for å blande. (Transitt-LT1 Reagens: DNA forholdet er tre ul av transitt-LT1 reagens per 1 mikrogram av DNA).
    3. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur og tilsett dråpevis til cellene.

2. Cell Forberedelse til flowcytometrisystemer, Western Blot, og Immunfluorescens

  1. 24 timer etter transfeksjon, sjekk fluorescens i henhold epifluorescence mikroskop før høsting celler.
  2. Celleforberedelsen for flowcytometrisk analyse:
    1. Vask cellene med 0,5 ml / 2 ml iskald PBS for 24-well/6-well plater.
    2. Løsner celler ved hjelp av 50 μl/250 ul 0,05% trypsin.
    3. Nøytralisere trypsin med 200 ul / 1 ml DMEM medium.
    4. Collect 250 pl celler (både 24-brønn-og 6-brønn plate) ved sentrifugering ved 500 xg i 5 min, bruke de gjenværende cellene (1 ml) for Western blot analyse.
    5. Resuspender celler i 250 mL FACS buffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], butikken på is for flowcytometrisk analyse. Celler kan også være løst i 1% paraformaldehyd (i PBS) hvis strømningscytometri-analyse ikke vil være umiddelbar.
  3. Cell forberedelse for Western blot-analyse: utført parallelt med celle forberedelse for strømningscytometri-analyse.
    1. Vask 1x cellene med 2 ml iskald PBS, lyse cellene ved å tilsette 100 ul celle-lyseringsbuffer [10 mM natrium-fosfatbuffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
    2. Samle cellelysat ved sentrifugering i 10 min ved 21.000 xg ved 4 ° C.
    3. Kvantifisere protein konsentrasjon av Bradford protein analysen, legger like mengder protein per kjørefelt for SDS-PAGE, og overføre til nitrocellulose for immunoblotting.
    4. Celleforberedelsen for immunfluorescens.
      1. Rens cellene 3 ganger med 2 ml PBS, fikse celler i 1 ml 3,7% paraformaldehyd (i PBS) i 10 min ved romtemperatur, deretter vaskes 3 ganger med 2 ml PBS i 5 min.
      2. Monter dekke slip på et glass lysbilde, ved hjelp av montering medium. Forsegle dekkglass kantene med neglelakk om nødvendig.
      3. Oppbevar lysbilder ved 4 ° C før eksamen.

    3. Flowcytometrisystemer og Immunfluorescens Mikroskopi

    1. Flowcytometri er utført ved hjelp av en Beckman Coulter Cyan ADP, utstyrt med 488 nm, 405 nm, og 642 nm solid-state laser. Summit programvare brukes for innsamling og analyse.
      1. Kalibrere flowcytometer ved hjelp av standard perler.
      2. Plot Forward scatter (FSC) / sideward scatter (SSC) på en lineær skala for gating levende celle befolkningen.
      3. Plot FSC / spenning puls bredde for gating ikke-aggregert levende celle befolkningen.
      4. Plot count/FL6 (CFP fluorescence, 405 nm) på en log skala for gating ikkeaggregerte levende CFP-positive celler.
      5. Plot count/FL1 (YFP fluorescens, 488 nm) på en log skala for BiFC intensitet.
      6. Kjør YFP-CFP-doble negative prøver, justere FSC, SSC, FL1 og FL6 fotomultiplikatorrøret (PMT) spenning for å sette terskelen for hvert signal.
      7. Kjør eneste positive (både YFP + og CFP +) prøver for fremtidig off-line kompensasjon
      8. Skaffe minst 10.000 gated hendelser (ikke-aggregerte live-CFP + celler) for analyse.
    2. Immunfluorescens mikroskopi utføres ved hjelp av en Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop. Merk: det er viktig å beholde alle innstillinger (for eksempel zoom, pinhole, detektor gevinst, forsterker offset, rammestørrelse, skanning hastighet, scan gjennomsnitt, og laser makt) konsistent mellom prøver for riktig sammenligning av alle data.

    4. Data Analysis (utført ved hjelp Summit Software)

    1. Sett opp analysen protokollen lik som for acquisition med riktig gating:
      Gate 1 i FSC / SSC dot tomt for levende celler.
      Gate 2 i FSC / pulsbredde for Gate 1 for ikke-aggregerte levende celler.
      Gate 3 i teller / CFP av Gate 3 for ikke-aggregert CFP + levende celler.
    2. Kompensere YFP og CFP signal ved hjelp YFP + og CFP + enkeltstående positive celler.
    3. Re-bestemme cut-off linjer for CFP / YFP-positive celler.
    4. Eksport YFP mener fluorescensintensitet (MFI) av CFP + celler til Excel for data-plotting.
    5. Normalisere YFP MFI til uttrykk nivåer av AKAP-Lbc, PDE4D3, og lasting kontroll α-tubulin, som bestemmes av Western blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AKAP-Lbc og PDE4D3 konstruksjoner (figur 1B) ble smeltet til VN og VC fragmenter, henholdsvis. Interaksjon av AKAP-Lbc og PDE4D3 resulterer i funksjonelle YFP fluorescens (figur 1A). Her bruker vi BiFC metode for å kartlegge AKAP-Lbc-bindende områder i PDE4D3. Upstream konservert region 1 (UCR1), oppstrøms konservert region 2 (UCR2) og katalytisk region (CAT) er bevart blant PDE4 familie proteiner, derfor full lengde (FL), UCR1 og UCR2 pluss CAT ble brukt til screening bindende området av PDE4D3 til AKAP-Lbc. Uttrykket av VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3-fragmenter i HEK 293T celler resulterer i fluorescens med forskjellig intensitet (figur 1C). BiFC indikerer at både UCR1 og UCR2 + CAT bidra til samspillet av PDE4D3 med AKAP-Lbc. Greater fluorescens intensitet som følge av AKAP-Lbc-UCR1 samspill, sammenlignet med AKAP-Lbc-UCR2 + CAT, indikerer at PDE-UCR1 binder seg til AKAP-Lbc bedre enn PDE-UCR2 + CAT.

(Figur 2A), og celleaggregater ble ekskludert ved hjelp av SSC vs Pulse Width dobbel prikk (figur 2B). Celler med BiFC signal eller CFP uttrykk alene var used å bestemme kompensasjon og cut-off for celler uten fluorescens (Tall 2C-2F). CFP vektor ble ko-transfektert med konstrukter BiFC og CFP ekspresjon ble brukt som en positiv markør for å indikere vellykket transfeksjon. Kun CFP +-celler ble brukt for måling av BiFC fluorescens. Transfeksjon av økende mengder PDE4D3 resulterte i økt Venus (YFP) BiFC signal (figur 3A), mens CFP signal forble uendret (Figur 3B). Uttrykk for VN-AKAP-Lbc og økende mengder av VC-PDE4D3 ble bekreftet av Western blot (Figur 3C). Totalt sett øker PDE ekspresjon resulterte i en lineær økning av fluorescens BiFC korrelering til PDE ekspresjonsnivåer (figur 3D). Disse resultatene validert ved bruk av flowcytometri å kvantifisere AKAP-Lbc-PDE4D3 samhandling ved å måle gjennomsnittlig fluorescens intensiteten (MFI) av BiFC. Vi har derfor brukt denne metoden til kart AKAP-LBC bindende områder innen PDE4D3 bruker VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruksjoner. Samsvar med våre observasjoner i figur 1C, uttrykk for VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3-UCR2 + CAT resulterte i lavere BiFC signal i forhold til VC-PDE4D3-FL og VC-PDE4D3-UCR1 (Figur 4B). Lignende protein uttrykket ble observert i alle flyt prøver (Figur 4C) og gjennomsnittlig fluorescens ble normalisert til de relative uttrykk nivåer av AKAP-Lbc, PDE4D3, og α-tubulin. Angir derfor normalisert BiFC MFI at det er ingen forskjell i fluorescens intensitet mellom AKAP-Lbc-PDE4D3-FL og AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR1, men mye lavere signal for AKAP-Lbc-PDE4D3-UCR2 + CAT interaksjon (Figur 4A ). Disse resultatene tyder på at det er flere regioner i PDE4D3 som samhandler med AKAP-Lbc, og at PDE4D3-UCR1 er den primære delen av interaksjon med AKAP-Lbc. Dette resultatet ble også bekreftet ved ko-IP, gull standard for protein-protein interaksjoner (figur 5).

Figur 1
Figur 1. BiFC analyse av AKAP-Lbc-PDE4D3-fragment samhandling ved immunfluorescens mikroskopi. A) Skjematisk representant for bimolecular Fluorescens complementation (BiFC). Venus fragmenter, VN og VC er smeltet til AKAP-Lbc og PDE4D3 henholdsvis. AKAP-LBC-PDE4D3 samhandling resulterer i funksjonelle YFP fluorescens. B) Skjematisk diagram av PDE4D3 konstruksjoner som brukes til kartlegging. C) Representative BiFC signaler om transfekterte HEK 293T celler. Celler ble samtidig tilført med VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruerer (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT) for BiFC analyse. CFP-vektor ble også co-tilført som en transfeksjon markør. 24-timers post-transfeksjon, celler ble fikset for bildebehandling. BiFC signal vises i grønt og CFP er vist i PseudoColor rødt i de sammenslåtte tall. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 2
Figur 2. Fastsettelse av porter og kompensasjon for FACS analyse. A) FSC vs SSC dot tomt til gate levende celler og for å utelukke rusk og døde celler. B) sidespredning vs pulsbredde prikk tomten til gate enkeltceller og for å utelukke aggregater. C) Celler som uttrykker CFP (CFP + celler) før kompensasjon. D ) Celler som uttrykker CFP (CFP + celler) etter YFP kompensasjon. Cut-off line for celler med YFP uttrykk ble re-bestemt. E) celler med BiFC signal (YFP + celler) før kompensasjon. F) celler med BiFC signal (YFP + celler) etter CFP kompensasjon. Cut-off line for celler med CFP uttrykk ble re-bestemt.target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.

Figur 3
Figur 3. Analyse av AKAP-Lbc-PDE4D3 interaksjon med BiFC-flowcytometrisystemer ved å variere mengden av PDE4D3 uttrykk. A) Økt BiFC signal inne CFP + celler tilført med økende mengder av VC-PDE4D3. Celler ble tilført med CFP (10 ng), VN-AKAP-Lbc (200 ng) og økende mengder av VC-PDE4D3 (2,5 ng til 80 ng). Ikke-aggregerte CFP + levende celler var gated og YFP fluorescens er vist som YFP vs Forward Scatter dobbel prikk tomten. YFP + celler er vist i grønt. Representative data fra 5 ng, 20 ng, og 80 ng VC-PDE4D3 vises. B) CFP fluorescens i levende celler er vist som CFP vs Forward Scatter dobbel prikk-plott, noe som indikerer konsekvent CFP fluorescens blant alle prøvene. C) Western blot analyse demonstrere økende PDE4D3 Expression med konsekvent uttrykk for AKAP-Lbc og α-tubulin (brukt som en lasting kontroll). D) Venus (YFP) Mean fluorescens intensiteten (MFI) av CFP + celler er korrelert med VC-PDE4D3 uttrykk. Fold endring av både YFP MFI fra CFP + celler er plottet sammen med CFP MFI fold endring fra ikke-aggregerte levende celler. Relative uttrykk nivåer av VC-PDE4D3 bestemmes av Image J analyse av Western blot er også plottet. Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. BiFC analyse av AKAP-Lbc interaksjon med PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT hjelp flowcytometrisystemer. A) AKAP-Lbc-PDE4D3-fragment interaksjon ble kvantifisert ved Venus-MFI normalisert til protein uttrykk (AKAP-Lbc, PDE4D3 fragmenter og lasting kontroll α-tubulin). Difference i BiFC signal ble undersøkt av en enveis variansanalyse (ANOVA) En p-verdi <0,01 er vurdert som svært viktig (**), mens ap verdi> 0,05 regnes ikke signifikant (ns). B) Representant BiFC signal i transfekterte HEK 293T celler. HEK 293T celler ble samtidig tilført med CFP, VN-AKAP-Lbc og VC-PDE4D3 konstruerer (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT). Ikke-aggregerte live-CFP + celler var inngjerdet, og deres BiFC fluorescens er vist i YFP vs Forward Scatter dobbel prikk tomten. C) Western blot viser sammenlignbare uttrykk for AKAP-Lbc og PDE4D3-fragmenter. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. Bekreftelse av flowcytometrisystemer analyse av co-immunoprecipitation. HEK 293T celler ble samtidig tilførtfor uttrykk av V5-AKAP-Lbc og GFP-PDE4D3 konstruerer (-FL, UCR1-,-UCR2 + CAT). 48 timer etter transfeksjon ble AKAP-Lbc immunutfelt hjelp V5-agarosekuler. Binding av PDE4D3-FL, UCR1 og UCR2 + CAT ble oppdaget av SDS-PAGE og Western blot ved hjelp av anti-GFP primære antistoff. Den tilsvarende PDE4D3 inngang brukes til immunoprecipitation er også vist, indikerer lik uttrykket for alle PDE4D3-fragmenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BiFC er en enkel og følsom metode for å undersøke protein-protein interaksjon. Denne metode kan ikke brukes for å identifisere nye protein-protein interaksjoner, er det imidlertid særlig hensiktsmessig å bekrefte protein-protein interaksjon inne i celler og for å studere funksjonelle egenskaper, slik som subcellulære lokalisering av proteinkomplekser, kartlegging av protein-protein interaksjon steder, og for screening av små molekyler / peptider som kan modulere protein-protein interaksjon. Fordi VN og VC-fragmenter er ikke-fluorescerende, er bakgrunnsfluorescens lav, og dermed hjelpe følsomheten av denne analyse. Tid er nødvendig for å modne / stabilisere VN-protein-VC-protein interaksjon, og dermed er det forsinkelse for å visualisere den protein-protein interaksjon, og optimal tids-punkter kan derfor må bestemmes empirisk. Det bør også bemerkes at VN-protein-VC-protein interaksjon er ikke reversibel, således dessverre med strøm Venus BiFC konstruerer denne analysen er ikke egnet to studere dynamiske kinetikk protein-protein interaksjon.

Forsvarlig kontroll viktig for BiFC analyse. En egnet negativ kontroll inkluderer ikke-samspill proteiner eller uspesifikke peptider i det aktuelle BiFC vektor, eller hvis mulig, en mutant som forstyrrer protein-protein interaksjon. Tom BiFC vektor er ikke en god kontroll som det resulterer i uspesifikk høy bakgrunnsfluorescens. Hvis BiFC ikke observeres i to interagerende proteiner, bør uttrykket skal analyseres. Dessuten kan BiFC signal variere avhengig av protein-protein interaksjon steder. Det bør bemerkes at romlig modulering av VN og VC interaksjonen kan også påvirke fluorescensintensiteten, derfor er det viktig først å utføre BiFC eksperimenter ved hjelp av både C-terminale og N-terminale VN / VC ekspresjonskonstruksjoner. For eksempel kan BiFC ikke oppstå hvis protein-protein interaksjon blokkerer re-foreningen av Venus fragmenter. Derfor konstruerer flere kombinasjoner av VN og VC should bli testet (dvs. både C-og N-terminal protein fusjoner).

Fluorescensintensiteten av BiFC er proporsjonal med styrken av protein-protein interaksjonen, med høyere BiFC intensitet som indikerer større samspill og en nedre fluorescensintensitet tyder svakere interaksjon. BiFC MFI er derfor brukt som indikator for protein-protein interaksjon. For nøyaktig analyse av protein-protein interaksjonen av BiFC, er det meget viktig at Western blot-analyse er utført for å sikre lik ekspresjon av forskjellige konstruksjoner, og at ingen proteinnedbrytingen er oppstått, noe som kan forstyrre riktig analyse. Lysat fra de samme prøvene er derfor foretrukket for Western blot-analyse for å bestemme lignende protein uttrykk for alle prøver som ble analysert. I tillegg er det viktig å bestemme passende mengder av plasmider for transfeksjon for å sikre lineært uttrykk og interaksjonen av proteinene, og mellom dette område korrelerer interaksjonen av proteinet with fluorescensintensiteten av BiFC signal.

Lav mengde CFP plasmid blir brukt som en markør for vellykket transfeksjon, slik at bare CFP positive celler ble analysert her. En annen fluorescerende protein, slik som RFP kan brukes til å minimere skinner igjennom mellom farger 11. For flowcytometrisystemer, er singel positive celler som trengs for å bli inkludert for kompensasjon. Hvis det er mulig, er minst 10.000 CFP positive celler telles for å sikre en god sample size.

I sammendrag, her vi vise at kopling BiFC metodikk med flowcytometrisk analyse kan benyttes som en god indikator av protein-protein interaksjonen inne i celler. Tradisjonell analyse av BiFC hjelp immunfluorescens mikroskop er tidkrevende, og størrelsen på utvalget er mye lavere enn det som tilsvarer flowcytometrisk analyse. Således kan kopling flowcytometri med BiFC være fordelaktig for analyse av protein-protein interaksjon når transfeksjon virkningsgrad er lav. I denneRapporten, vi tok fordel av BiFC-flowcytometrisystemer å kartlegge interaksjon steder i PDE4D3 for binding til AKAP-Lbc. Denne teknikken kan også bli utvidet til å screene for molekyler eller peptider som kan avbryte eller forbedre protein-protein interaksjon, for medisiner 12.. Denne metoden kan også brukes til å studere visse fysiologiske hendelser, slik som ligand-indusert internalisering av GPCR siste 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker O'Bryan lab ved UIC for kritisk eksperimentell evaluering og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 11SDG5230003 til GKC og National Center for å fremme translasjonell Science - UIC Senter for klinisk og translasjonell Sciences Grant UL1TR000050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R
α-tubulin Sigma DM1A, T9026
Anti-GFP antibody Clontech 632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
  4. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
  5. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
  6. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  7. Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
  8. Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
  9. Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
  10. Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
  11. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, (Unit 14), 11 (2008).
  12. Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
  13. Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).More

Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter