L'analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l'interazione proteina-proteina
Summary
L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.
Abstract
Tra i metodi per studiare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule, bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è relativamente semplice e sensibile. BiFC è basato sulla produzione di fluorescenza con due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente (Venere, una variante Proteina Fluorescente Giallo, è usato qui). Non fluorescenti frammenti Venus (VN e VC) sono fusi a due proteine interagenti (in questo caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), cedendo fluorescenza dovuto all'interazione VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e la formazione di una proteina fluorescente funzionale all'interno delle cellule.
BiFC fornisce informazioni sulla localizzazione subcellulare di complessi proteici e la forza delle interazioni proteina basati sull'intensità di fluorescenza. Tuttavia, l'analisi BiFC utilizzando microscopia a quantificare la forza di interazione proteina-proteina è lunga e alquanto soggettiva causa di eterogeneità nell'espressione della proteina e di interazione. Con flusso citometria accoppiamentoanalisi con metodologia BiFC, il segnale di interazione proteina-proteina fluorescente BiFC può essere misurata con precisione per una grande quantità di cellule in breve tempo. Qui, dimostriamo una applicazione di questa metodologia per mappare le regioni in PDE4D3 che sono necessari per l'interazione con AKAP-Lbc. Questa metodologia throughput elevato può essere applicata a fattori di screening che regolano l'interazione proteina-proteina.
Introduction
650.000 interazioni proteina-proteina sono stimati ad esistere nel interattoma umano, gioca un ruolo critico nel mantenimento della normale funzionalità delle cellule 1,2. Oltre co-immunoprecipitazione (co-IP), il gold standard per studiare l'interazione proteina-proteina dal lisato cellulare, parecchi frammenti proteici saggi di complementazione (PCA) sono stati sviluppati per migliorare la sensibilità nella rilevazione di interazione proteina-proteina all'interno delle cellule 3. Le tecniche includono Förster Resonance Energy Transfer (FRET), bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), e bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) 4,5. BiFC si basa sull'associazione facilitato dei due frammenti di una proteina fluorescente (qui usiamo Venere; una variante YFP) che sono ognuno fuso ad un potenziale partner proteine interagenti (in questo esempio si usa AKAP-Lbc e PDE4D3). Interazione dei due proteine di interesse all'interno di cellule risultati nella fluorescenza funzionali, che possono essere visualizzati da fmicroscopia luorescence utilizzando sia cellule vive o fissa 6,7,8. Rispetto ad altri APC, BiFC è sensibile e tecnicamente meno impegnativo, con la possibilità di studiare la localizzazione cellulare in cellule vive. Un grave inconveniente di questa tecnica tuttavia è che una volta formato, il complesso proteina fluorescente non può essere invertito. Quindi non è un buon metodo per studiare l'interazione proteina-proteina dinamico. In questo lavoro, si usa BiFC per mappare i siti di interazione di PDE4D3 con AKAP-Lbc monitorando le intensità di fluorescenza di Venere. Rispetto ai tradizionali analisi mediante microscopia a fluorescenza, che richiede tempo e manodopera (se non effettuata con macchine ad alta velocità automatizzato), citometria a flusso fornisce un'analisi quantitativa diretto di migliaia di cellule in una popolazione eterogenea in un breve tempo 9, 10. Qui, effettuando un confronto side-by-side di analisi citofluorimetrica-BiFC e co-IP tradizionale, dimostriamo che i due metodi forniscono dati comparabili, tuttavia, il flusso di analisi BiFC citometria richiede meno tempo e utilizza meno materiale che potrebbe essere più utile quando le cellule di interesse sono limitati.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC è un metodo semplice e sensibile per studiare l'interazione proteina-proteina. Questo metodo non può essere usato per identificare nuove interazioni proteina-proteina, tuttavia, è particolarmente conveniente per confermare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule e per studiare le proprietà funzionali, quali localizzazione subcellulare dei complessi proteici, mappatura dei siti di interazione proteina-proteina, e per lo screening di piccole molecole / peptidi che possono modulare l&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il laboratorio O'Bryan a UIC per la valutazione sperimentale critica e discussione. Questo lavoro è stato sostenuto da American Heart Association Concessione 11SDG5230003 di GKC e National Center for Advancing Science Translational – Centro UIC per Scienze Cliniche e traslazionale sovvenzione UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
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