Summary

L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine

Published: August 15, 2013
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Summary

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

Abstract

Parmi les méthodes d'étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l'aide de deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l'interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d'une protéine fluorescente fonctionnelle à l'intérieur des cellules.

BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l'intensité de fluorescence. Cependant, l'analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l'interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l'hétérogénéité dans l'expression des protéines et de l'interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d'interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l'interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l'interaction protéine-protéine.

Introduction

650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales 1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l'étalon-or pour étudier l'interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules 3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l'énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) 4,5. BiFC est basé sur l'association facilité de deux fragments d'une protéine fluorescente (ici nous utilisons Vénus; une variante YFP) qui sont fusionnées chacune à un partenaire de protéine d'interaction potentielle (dans cet exemple, nous utilisons AKAP-Lbc et PDE4D3). L'interaction des deux protéines d'intérêt dans les cellules en résulte fluorescence fonctionnel, qui peut être visualisée par fmicroscopie luorescence en utilisant soit des cellules vivantes ou fixe 6,7,8. Comparé à d'autres ACI, BiFC est sensible et techniquement moins difficile, avec un potentiel d'étudier la localisation cellulaire dans les cellules vivantes. Un inconvénient majeur de cette technique est cependant que, une fois formé, le complexe protéine fluorescente peut pas être inversée. Par conséquent, il n'est pas une bonne méthode pour étudier l'interaction dynamique de la protéine-protéine. Dans cet article, nous utilisons BiFC pour cartographier les sites d'interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc en contrôlant l'intensité de fluorescence de Vénus. Par rapport à l'analyse traditionnelle en utilisant la microscopie à fluorescence, qui prend beaucoup de temps et de main-d'œuvre (si elle n'est pas effectuée en utilisant des machines à haut débit automatisé), la cytométrie en flux permet une analyse quantitative simple de milliers de cellules dans une population hétérogène sur une courte période 9, 10. Ici, en effectuant une comparaison côte-à-côte de l'écoulement cytométrie-BiFC et co-IP traditionnel, nous démontrons que les deux mes méthodes fournissent des données comparables, toutefois, analyse des flux BiFC cytométrie prend moins de temps et utilise moins de matériaux qui peuvent être plus utiles lorsque les cellules d'intérêt sont limités.

Protocol

1. La transfection cellulaire Cellules de la plaque le jour avant la transfection, le placage moins de cellules pour immunofluorescence. Pour immunofluorescence: dans un des lamelles de verre manteau plaque à 6 puits (1 par puits) avec 0,02% de gélatine à 37 ° C pendant au moins 4 heures, laver une fois avec le milieu, et pour chaque puits, la plaque 1 x 10 5 HEK 293T cellules dans 2 ml de milieu de croissance complet [media de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) plus 10% de FBS]. …

Representative Results

AKAP-Lbc et PDE4D3 constructions (figure 1B) ont été fusionnées au VN et fragments de capital-risque, respectivement. Interaction des AKAP-Lbc et PDE4D3 résultats en fonction YFP fluorescence (figure 1A). Ici, nous utilisons la méthode BiFC pour cartographier les sites AKAP-Lbc contraignantes dans PDE4D3. Région en amont conservé 1 (DUC1), région en amont conservé 2 (DUC 2) et la région catalytique (CAT) sont conservées parmi PDE4 protéines de la famille, donc, pleine longue…

Discussion

BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l'interaction protéine-protéine dans les cellules et d'étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le laboratoire O'Bryan à l'UIC pour l'évaluation expérimentale critique et à la discussion. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association Grant 11SDG5230003 à GKC et National Center for Advancing Translational Sciences – Centre des sciences de l'UIC clinique et translationnelle Grant UL1TR000050.

Materials

      REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) Invitrogen 11965-092  
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x Invitrogen 15070-063  
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 16000-044  
Anti-Flag antibody Sigma M2, F1804  
Anti-HA antibody Covance 16B12, MMS-101R  
α-tubulin Sigma DM1A, T9026  
Anti-GFP antibody Clontech 632569  
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated Thermo Fisher Scientific 130184  
HEK 293T cells ATCC CRL-11268  
Maxiprep plasmid purification kit, high speed Qiagen 12663  
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x Invitrogen 14190-144  
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) Gibco 25300  
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352052  
Paraformaldehyde Fisher Scientific S74337MF  
Prolong gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931  
Superfrost plus Microscope slides Fisher Scientific 12-550-15  
Fisherfinest premium cover glass Fisher Scientific 12-548-5P  
      EQUIPMENT
CO2 air-jacketed Incubator NuAIR DH autoflow    
Confocal microscope LSM510 META Carl Zeiss, Inc    
Electrophoresis and transfer unit Biorad    
Cyan ADP Flow Cytometer Beckman Coulter    

References

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Cite This Article
Wang, L., Carnegie, G. K. Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction. J. Vis. Exp. (78), e50529, doi:10.3791/50529 (2013).

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