L'analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine
Summary
L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.
Abstract
Parmi les méthodes d'étude des interactions protéine-protéine dans les cellules, complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est relativement simple et sensible. BiFC est basée sur la production de fluorescence à l'aide de deux fragments non fluorescents d'une protéine fluorescente (Venus, une variante de la protéine fluorescente jaune, est utilisé ici). Venus fragments non fluorescents (VN et VC) sont fusionnés à deux protéines interagissant (dans ce cas, AKAP-Lbc et PDE4D3), ce qui donne fluorescence due à l'interaction VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 et la formation d'une protéine fluorescente fonctionnelle à l'intérieur des cellules.
BiFC fournit des informations sur la localisation subcellulaire des complexes de protéines et de la force des interactions de protéines sur la base de l'intensité de fluorescence. Cependant, l'analyse BiFC utilisant la microscopie à quantifier la force de l'interaction protéine-protéine est longue et quelque peu subjective en raison de l'hétérogénéité dans l'expression des protéines et de l'interaction. Par cytométrie de flux couplageanalyse à la méthodologie BiFC, le signal d'interaction protéine-protéine fluorescente BiFC peut être mesuré avec précision pour une grande quantité de cellules dans un court laps de temps. Ici, nous démontrons une application de cette méthodologie pour cartographier les régions en PDE4D3 qui sont nécessaires à l'interaction avec AKAP-Lbc. Cette méthode à haut débit peut être appliquée aux éléments de criblage qui régulent l'interaction protéine-protéine.
Introduction
650.000 interactions protéine-protéine sont estimés à exister dans le Interactome humaine, jouent des rôles cruciaux dans le maintien des fonctions normales 1,2 cellulaire. Outre co-immunoprécipitation (co-IP), l'étalon-or pour étudier l'interaction protéine-protéine de lysat cellulaire, plusieurs essais de complémentation de fragments de protéines (PCA) ont été développés pour améliorer la sensibilité dans la détection des interactions protéine-protéine dans les cellules 3. Les techniques comprennent Förster transfert de résonance de l'énergie (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), et complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) 4,5. BiFC est basé sur l'association facilité de deux fragments d'une protéine fluorescente (ici nous utilisons Vénus; une variante YFP) qui sont fusionnées chacune à un partenaire de protéine d'interaction potentielle (dans cet exemple, nous utilisons AKAP-Lbc et PDE4D3). L'interaction des deux protéines d'intérêt dans les cellules en résulte fluorescence fonctionnel, qui peut être visualisée par fmicroscopie luorescence en utilisant soit des cellules vivantes ou fixe 6,7,8. Comparé à d'autres ACI, BiFC est sensible et techniquement moins difficile, avec un potentiel d'étudier la localisation cellulaire dans les cellules vivantes. Un inconvénient majeur de cette technique est cependant que, une fois formé, le complexe protéine fluorescente peut pas être inversée. Par conséquent, il n'est pas une bonne méthode pour étudier l'interaction dynamique de la protéine-protéine. Dans cet article, nous utilisons BiFC pour cartographier les sites d'interaction de PDE4D3 avec AKAP-Lbc en contrôlant l'intensité de fluorescence de Vénus. Par rapport à l'analyse traditionnelle en utilisant la microscopie à fluorescence, qui prend beaucoup de temps et de main-d'œuvre (si elle n'est pas effectuée en utilisant des machines à haut débit automatisé), la cytométrie en flux permet une analyse quantitative simple de milliers de cellules dans une population hétérogène sur une courte période 9, 10. Ici, en effectuant une comparaison côte-à-côte de l'écoulement cytométrie-BiFC et co-IP traditionnel, nous démontrons que les deux mes méthodes fournissent des données comparables, toutefois, analyse des flux BiFC cytométrie prend moins de temps et utilise moins de matériaux qui peuvent être plus utiles lorsque les cellules d'intérêt sont limités.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC est un procédé simple et sensible pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode ne peut être utilisée pour identifier de nouvelles interactions protéine-protéine, cependant, il est particulièrement utile pour confirmer l'interaction protéine-protéine dans les cellules et d'étudier les propriétés fonctionnelles, telles que la localisation subcellulaire des complexes de protéines, la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine, et pour le criblage de petites…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le laboratoire O'Bryan à l'UIC pour l'évaluation expérimentale critique et à la discussion. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association Grant 11SDG5230003 à GKC et National Center for Advancing Translational Sciences – Centre des sciences de l'UIC clinique et translationnelle Grant UL1TR000050.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
References
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