Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها

Published: September 14, 2015 doi: 10.3791/50672
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 2Howard Hughes Medical Institute

Abstract

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج يستخدم بشكل مكثف في الدماغ من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV) 1. PRV لا تصيب القردة العليا، بما في ذلك البشر، لذلك فإن استخدامها الأكثر شيوعا في الدراسات على الثدييات الصغيرة، وخاصة القوارض. وPRV152 الكاذب سلالة يعبر عن تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) مراسل الجينات ويعبر فقط نقاط الاشتباك العصبي وظيفية retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 2،3. سلالات PRV أخرى لها خصائص الميكروبيولوجية متميزة ويمكن نقلها في كلا الاتجاهين (PRV-بيكر وPRV-كابلان) 4،5. وهذا البروتوكول يتعامل حصرا مع PRV152. من خلال تقديم الفيروس في موقع الطرفية، مثل العضلات، فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى ركان الدماغ من خلال مجموعة محددة من الخلايا العصبية. النمط الناتج من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم يحل الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية. لأن طبيعة وزعت من تتبع عبر التشابك مع فيروس داء الكلب الكاذب يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الشبكة التي تم تحديدها من الصعب، نقدم طريقة حساسة وموثوق بها توظيف الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) لتأكيد صلات بين الخلايا التي تم تحديدها باستخدام PRV152. وقد تم اختيار كشف مناعى من BDA وCTB مع الغلوثانيون وDAB (3، 3'-diaminobenzidine) لأنها فعالة في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 11/06.

Introduction

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج الأكثر استخداما على نطاق واسع في الدماغ القوارض من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV)، وخصوصا سلالة ضعيفة PRV-بارثا صفت لأول مرة في عام 1961 (12). وهنا، نقدم بروتوكول لتحديد التمثيل القشرية الحركية للعضلات محددة أو المجموعات العضلية باستخدام سلالة فيروس داء الكلب الكاذب المؤتلف (PRV152) معربا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) مراسل الجين 2. الطريقة الموصوفة يستغل سلوك الفيروسات موجه للعصب، والتي تنتج ذرية المعدية التي تصيب لنقاط الاشتباك العصبي عبر الخلايا العصبية الأخرى داخل الدائرة الفنية 3،4،13. PRV152، وهو إسوي مع PRV-بارثا، والصلبان فقط نقاط الاشتباك العصبي retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 3،5 </ سوب>. عن طريق التحكم بدقة الموقع الطرفية للعدوى فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى الدماغ من خلال مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية الحركية. كما يصيب فيروس بالتتابع سلاسل من الخلايا العصبية متصلة، فإن نمط الناتجة من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم حل شبكة من الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية.

ميزة إضافية لاستخدام الفيروسات لتتبع العصبي هو التضخيم من البروتين مراسل (EGFP في هذه الحالة) داخل الخلايا المصابة. يوفر هذا التضخيم إشارة مستوى من الحساسية التي تتيح الكشف عن التوقعات حتى متفرق. على سبيل المثال، تم العثور على إسقاط متفرق من القشرة شعرة أنفية المحرك إلى الخلايا العصبية الحركية في الوجه السيطرة على شعيرات في الفئران باستخدام أعرب فيروسي بروتين الفلورية الخضراء 14؛ فشلت الدراسات السابقة للعثور على هذا الإسقاط باستخدام استشفاف الكلاسيكية دون مراسل التضخيم الجينات 11،15. لسوء الحظ، والعديد من ناقلات تتبع الفيروسية، مثل تلك المستخدمة في الدراسة المذكورة، لا يعبرون نقاط الاشتباك العصبي، مما يحد من استخدامها لتعقب الدوائر المتعددة متشابك.

بينما تقدم مزايا واضحة لتحديد شبكة من الخلايا المشاركة في الدائرة الحركية، وطبيعة توزيع عبر التشابك البحث عن المفقودين مع PRV-152 يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الدائرة الصعبة. ولذلك، فإننا نقدم وسيلة بسيطة للتحقق من صحة اتصالات محددة داخل الدوائر التي تم تحديدها باستخدام PRV-152 عن طريق مزدوج وضع العلامات باستخدام الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والسمية الكوليرا الوحيدات ب (CTB). الجمع بين استخدام BDA وCTB هو نهج راسخ لتعقب الاتصالات بين مجموعات محددة من الخلايا العصبية 6-8،11. عند استخدامها معا، وهذه استشفاف اثنين يمكن تصور في نفس القسم باستخدام DAB اللونين (3، 3'-diaminobenzidine) إجراء 16. وقد تم اختيار ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (BDA10kDa) لهذا البروتوكول لأنه ذields وضع العلامات مفصل من العمليات العصبية 6،7،9. وتشمل مزايا إضافية من BDA10kDa ما يلي: يتم نقل تفضيلي في الاتجاه تقدمي 6-8. يمكن أن يتم تسليمها من قبل iontophoretic أو ضغط الحقن 6-8. ويمكن تصور كتبها a-البيروكسيديز أفيدين HRP بسيط (ABC) إجراء 17؛ ويمكن تصويرها بواسطة الضوء أو المجهر الإلكتروني 6،7،18. وقد تم اختيار كشف مناعى من CTB مع الغلوثانيون وDAB لوضع العلامات رجعي من العصبونات الحركية لأنه فعال في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 10،19. كنا مؤخرا هذا النهج لتحديد مسار السيارات صخبا في الفئران وللكشف عن اتصال متفرق من القشرة الحركية الأولية إلى الخلايا العصبية الحركية الحنجرة، والتي كان من المفترض سابقا أن تغيب 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك.

1. تخزين الكاذب الفيروسات

  1. نحصل على فيروسات حية (PRV152) من مختبر الدكتور لين Enquist في جامعة برينستون في عيار 1 × 10 9 PFU / م. وقد تم نشر بروتوكول لتوليد فيروس 2.
  2. قسامة الفيروس في 20 ميكرولتر في أنبوب داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية BSL-2 وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت الظروف المناسبة للسلامة الأحيائية.
  3. ذوبان الجليد قسامة من PRV مباشرة قبل الحقن.

2. إعداد الجراحية لحقن في العضلات

  1. حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane.
  2. حماية القرنيات مع مرهم البصريات.
  3. إعداد رانه موقع الجراحة وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتعقيم موقع الجراحة مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات). تأكد من استخدام الستائر معقمة لتغطية المناطق الجراحية. للتأكد من الالتزام تقنيات معقمة طوال الإجراءات.
  4. جعل شق الجلد وتكشف عن العضلات من الفائدة. على سبيل المثال، للوصول إلى عضلة الحنجرة الحلقية الدرقية فمن الضروري أولا إزالة جزء المغطي للعضلة القصية اللامية.
  5. ختم أي العضلات مقطوع مع VetBond نسيج لاصق.

3. حقن PRV في العضلات

  1. تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل PRV إذابة طازجة، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وتركيبها بعناية على الجهاز التجسيمي.
  2. مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن حل يخرج طرف محقنة مكروية. تجاهل السائل كنفايات bioharzard.
  3. باستخدام microp التجسيميجهاز ositioning تضع بعناية طرف محقنة مكروية في عضلة الفائدة وملء ببطء العضلات حتى تورم طفيف مرئيا. معدل الحقن سوف تختلف تبعا لحجم العضلات وحجم ليتم حقنه. على سبيل المثال، ينبغي بذل خمس حقن 200 NL (1 ميكرولتر الكل) بمعدل 4 NL / ثانية 1 دقيقة بعيدا في نفس الموقع لملء العضلات الحلقية الدرقية. نقل المحقنة إلى العضلات القادمة من الفائدة (على الحلقي الطرجهالي الجانبي في هذه الحالة) وتكرار إجراء الحقن. ثقب فقط كل عضلة مرة واحدة.
  4. التراجع عن محقنة مكروية بعد خمس دقائق.
  5. ختم كسر في العريضة باستخدام VetBond نسيج لاصق.
  6. بعد أن تم الانتهاء من جميع الحقن، وإغلاق الجرح باستخدام VetBond نسيج لاصق. اعتمادا على المبادئ التوجيهية الخاصة بك المحلية institional استخدام الحيواني، الغرز أو مقاطع الجرح يمكن استخدامها.
  7. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية التي تتطلبها ذمبادئ توجيهية لاستخدام الحيوانات لدينا المؤسسية.
  8. بعد وقت بقاء تجريبيا (في هذه الحالة، 90 ساعة لتسمية 2 الثانية تأمر الخلايا العصبية القشرية)، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS.
  9. إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة.
  10. Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل.

4. كشف مناعى من EGFP

  1. قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح انزلاق وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني. أقسام أرق، على سبيل المثال 30 ميكرون، ويمكن استخدامها عند تلطيخ أقسام محمولة.
  2. إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء.
  3. منع مستضدات غير محددة في الأقسام لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الماعز العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة (VE عدة).
  4. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية من VE عدة في RT.
  5. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  6. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC من VE عدة في RT.
  7. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2.
  8. أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  9. مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة.
  10. صورة الأقسام التي شنت على المجهر. المنتج رد فعل DAB insidه يجب أن تظهر الخلايا البني. يمكن للصور الرقمية يكون لون مقلوب لتسليط الضوء على العمليات الدقيقة.

5. إعداد الجراحية لحقن استشفاف في مناطق الدماغ التي اكتشفها PRV للبحث عن المفقودين

  1. حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane.
  2. حماية القرنيات مع مرهم البصريات.
  3. إصلاح الرأس في إطار التجسيمي المناسب.
  4. إعداد الموقع الجراحي وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتطهير الموقع مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات).
  5. جعل شق فروة الرأس وسحب الجلد فوق منطقة في الدماغ من الفائدة.
  6. أداء حج القحف صغير في الإحداثيات التجسيمي المناسبة. على سبيل المثال، الإحداثيات للاتصال laryngeally القشرة الحركية التي حددها PRV البحث عن المفقودين فين الماوس البالغين من 1.2 ملم و 0.2 ملم الوحشي منقاري إلى Bregma.

6. حقن البيروكسيديز ديكستران الأمينات في المخ

  1. إعداد 7.5٪ الأمينات ديكستران المعقدة البيروكسيديز (BDA) عن طريق إذابة 25 ملغ من BDA (10000 ميغاواط) في 333 ميكرولتر من محلول ملحي.
  2. تحميل نظام micropipette Nanoject II مع حلا كافيا BDA لحقن المخطط لها.
  3. مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن الحل يتم إنهاء غيض micropipette.
  4. باستخدام جهاز micropositioning التجسيمي خفض بعناية غيض micropipette في منطقة الدماغ من الفائدة وحقن ببطء BDA. ضبط معدل الحقن اعتمادا على حجم المنطقة ليكون المسمى. على سبيل المثال، 12 حقن 4.6 NL يجب أن أدلى تكون على أربعة مواقع مختلفة 0.2 مم وبصرف النظر (اتجاه rostro الذيلية) لتغطية القشرة الحركية ترتبط laryngeally في فئران بالغة. ينبغي تعديل حجم الحقن النهائي وفقا لحجم منطقة الدماغ من الفائدة، مع الأخذ في الاعتبار أن التسمية قد ينتشر من صميم حقن عن طريق الانتشار من خلال أنسجة المخ وعلى طول عمليات الخلايا العصبية المسماة.
  5. ختم حج القحف باستخدام الاسمنت الأسنان، وإغلاق الجرح فروة الرأس باستخدام VetBond نسيج لاصق.
  6. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك.

7. حقن الكوليرا السمية الوحدة الفرعية ب في العضلات

  1. إعداد 1٪ الكوليرا السمية فرعية ب (CTB) عن طريق إذابة 1 ملغ من CTB في 100 ميكرولتر من محلول ملحي.
  2. بعد ستة أيام BDA الحقن في الدماغ، نفذ إعداد الجراحية كما هو موضح أعلاه لحقن PRV في العضلات.
  3. تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل CTB، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وبعناية تركيبها على جهاز التجسيمي.
  4. أداء إبر دقيقة جدا في العضلات (ق) من الفائدة وإلغاء سابقامكتوب لPRV.
  5. مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك.
  6. بعد ثلاثة أيام من الحقن CTB، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS.
  7. إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة.
  8. Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل.

8. الكشف عن BDA وCTB في نفس المقاطع

  1. قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني.
  2. إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء.
  3. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC في RT. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine)، 0.015٪ H 2 O 2، و 0.05٪ كلوريد النيكل. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر الأسود.
  5. أقسام كتلة لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الأرنب العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة.
  6. احتضان سدت أبواب لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للCTB (1: 10000) في RT.
  7. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في أرنب مكافحة الماعز الضد الثانوية من VE عدة في RT.
  8. إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  9. غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليها لمدة 30 دقيقة في محلول ABC في RT.
  10. غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة تصل إلى 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3'-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر البني.
  11. أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما).
  12. مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة.
  13. صورة الأقسام التي شنت على المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يجب تلطيخ لEGFP تبدأ تظهر إشارة ضعيفة في الخلايا العصبية الحركية الأولية حوالي 72 ساعة بعد الحقن PRV152 في العضلات. تكرار والنقل عبر التشابك من الفيروسات وtiter- و 4 تعتمد على الوقت. ما يقرب من 90 ساعة بعد الحقن، وEGFP تلطيخ تكشف إشارة قوية من أجل الخلايا المصابة 2 الثانية. مرات البقاء على قيد الحياة أطول سوف تكشف عن 3 الثالثة وخلايا النظام أعلى ولكن تقتصر مرات البقاء على قيد الحياة من قبل فتك PRV في بعد حوالي 5 أيام التلقيح.

ويبين الشكل 1A الخلايا العصبية المصابة PRV152 معربا عن EGFP في ambiguus النواة، الذي يضم الخلايا العصبية الحركية الحنجرة، 94 ساعة بعد الحقن من PRV152 إلى اثنين من سبعة عضلات الحنجرة. لأن الفيروس دخل في الدماغ عن طريق الخلايا العصبية التي يعصب العضلات المصابة، وغيرها من حمامات الخلايا العصبية الحركية تصويتي، مثل نواة تحت اللسان، لا تعبر عن EGFP (الشكل 1B).

ويبين الشكل 2 النقل الوراء الفيروس إلى 2 الثانية أجل الدماغ الخلايا العصبية اللاحقة للإصابة الرئيسي في ambiguus النواة. كان حقن من جانب واحد، ونمط الناتجة من التسمية في الدماغ يظهر التهاب ambiguus نواة المماثل ونواة الانفرادي (الشكل 2A). أصيب أيضا interneurons شبكي وملطخة بشدة لEGFP (الشكل 2B). هذه interneurons ربط الهياكل المختلفة، بما في ذلك حمامات الخلايا العصبية الحركية وتصويتي نواة ambiguus المقابل. ومع ذلك، لا تزال أهداف صادر من غير المسماة لان الفيروس ينتشر فقط في الاتجاه الرجعي.

ويبين الشكل 3 الخلايا العصبية المصابة أمام الحركية في القشرة الحركية معربا عن EGFP جانب المقابل للموقع الحقن الطرفية. لأن PRV152 ينتشر عن طريق دوائر متعددة متشابك التي تؤثر على الخلايا العصبية الحركية الحنجرة في ambiguus النواة، فإنه يمكن بالبريد يفترض أن فقط السكان من الخلايا التي يتكون منها تمثيل القشرية الحركية للعضلات الحنجرة أصيب. عدم وجود إشارة EGFP في بقية القسم هو موضح (ومعظم الدماغ الأمامي لا يظهر) يدل على خصوصية وضع العلامات.

ويبين الشكل 4 محاور BDA المسمى في الدماغ على مستوى ambiguus النواة. المحاور اجراء اتصالات مع الخلايا العصبية الحركية الحظر الشامل للتجارب إيجابية المسمى retrogradely عن طريق الحقن في العضلات الحنجرة. وتظهر المحاور تشكيل دوالي وحبات محطة المفترضة بالقرب من التشعبات وسوما الخلايا العصبية الحركية الحنجرة. ويلزم مزيد من التجارب باستخدام المجهر الإلكتروني أو الكهربية لتحديد ما إذا كانت هذه دوالي تمثل حبات متشابك.

ويبين الشكل 5A الحقن الثنائي BDA وضعها في القشرة الحركية ترتبط laryngeally كما حددها transynaptic الوراء تتبع مع ​​PRV152. تيرو ause BDA ليست محددة إتجاهي، قد يكون المسمى على حد سواء وارد وصادر الاتصالات. على سبيل المثال، على حد سواء حقل الإسقاط (تقدمي) وأجسام الخلايا وينظر (رجعية) التسمية في المهاد (الشكل 5B).

الشكل 1
الشكل 1: الخلايا العصبية المصابة مع PRV152 تعرب عن EGFP (الخضراء) والكولين أسيتيل Immunopositive العصبونات الحركية (الأحمر) في (أ) Ambiguus (السفير) و (ب) تحت اللسان (XII) نوى الماوس جذع الدماغ 94 ساعة بعد حقن PRV152 في الحلقي الدرقي والجانبي الحلقي الطرجهالي الحنجرة العضلات. RF = التشكل الشبكي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

g2.jpg "/>
الشكل 2: Psuedorabies الفيروسات (PRV152) عدوى في الدماغ من ساعة ماوس 86 بعد الحقن PRV152 في الحلقي الدرقي والجانبي الحلقي الطرجهالي الحنجرة العضلات (أ) الخلايا العصبية معربا عن تعزيز الخضراء بروتين فلوري (أبيض، الألوان المقلوب من الصور brightfield الأصلية من المقاطع الملون ) في نواة ambiguus (السفير) المماثل لحقن العضلات، وتشكيل المحيطة شبكي (RF) ونواة الانفرادي (سول)، ولكن ليس نواة تحت اللسان (الثاني عشر). (ب) السفير وinterneurons شبكي في أعلى التكبير (السهام الحمراء، أجسام الخلايا في RF). أشرطة النطاق: 1 مم ل. 100 ميكرون لب. (معدلة من أرياغا وآخرون 2012). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
الرقم 3: القشرية الهرمية الخلايا العصبية تعرب عن EGFP (أبيض، الألوان المقلوب من الصور brightfield الأصلية من المقاطع الملون) في طبقة V القشرية من M1 التالية حقن Psuedorabies الفيروسات (PRV152) في الحلقي الدرقي والجانبي الحلقي الطرجهالي الحنجرة العضلات الحانات الحجم: 1 مم لل اللجنة الرئيسية. 200 ميكرون لأقحم. (معدلة من أرياغا وآخرون 2012).

الرقم 4
الرقم 4: M1 محاور عصبية في الدماغ (أ) منخفضة الطاقة من قسم الدماغ الاكليلية التي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية CTB المسمى في السفير (البني) من حقنة في عضلات الحنجرة والمحاور M1 (أسود) من حقنة من BDA إلى M1. ويمكن رؤية BDA محاور وصفت في القشرة-هرمي (فندق Pyr) المسار. الاختصارات: السفير، ambiguus النواة. فندق Pyr، الأهرامات، MRF، صتشكيل eticular الإنسي مباشرة إلى السفير. DRF، شبكي ظهري تشكيل لالسفير. (ب) التكبير عالية من BDA المسمى محور عصبي (الأسود ورؤساء السهم) من M1 الذي يجعل الاتصال (السهم) في الصعود إلى الخلايا العصبية الحركية السفير (CTB البني). (ج) M1 المحاور (الأسود) على طول (الأسهم) وبالقرب من (رؤساء السهم) كبيرة السفير الخلايا العصبية الحركية التغصنات الذي يشع الخروج من السفير الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: موقع الحقن واتصالات ثنائية الاتجاه إضافية كشف عن طريق الحقن BDA لم أر مع تتبع PRV transynaptic. (أ) كشفت الثنائية المعقدة البيروكسيديز ديكستران أمين (BDA) حقن (الأسود) في القشرة الحركية الأولية (M1) حقل كثيف محطة الإسقاط (الأسود) في المخطط الأساسي. (ب) كورتيالمحاور كال من M1 تنتهي في النواة الجانبية البطنية من المهاد (VL)؛ لوحظ كتلة من الخلايا المهادية (بني غامق وتميزت رأس السهم الأبيض) هذا المشروع إلى المنطقة الغناء M1 أيضا في VL. الكبسولة الداخلية (IC) وقد وصفت المحاور القادمة من القشرة. أشرطة النطاق: 1 مم ل. 200 ميكرون لب. (معدلة من أرياغا وآخرون 2012). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك عدد من القضايا التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند التخطيط لتجربة استخدام PRV152 4،21. الأهم من ذلك، فيروس داء الكلب الكاذب قاتلة. كما ذكر سابقا، القردة العليا، بما في ذلك البشر ليست عرضة للإصابة، ولكن يجب توخي الحذر المناسبة لحماية الحيوانات الأخرى. فئران بالغة البقاء على قيد الحياة عادة بعد 5-7 أيام التلقيح بسلالة PRV152 المخفف. ولذلك، PRV152 غير مناسب للتجارب التي تتطلب مرات البقاء على قيد الحياة أطول من أسبوع واحد. وعلاوة على ذلك، عرض الحيوانات المصابة عادة علامات المرض أثناء فترة البقاء على قيد الحياة، مما يحد من فائدة PRV152 للتجارب التي تتطلب مراقبة السلوك العادي.

بالإضافة إلى ذلك، PRV152 يتسبب في السامة للخلايا الاستجابة المناعية 22. بسبب تكرار وانتقال الفيروس يتم titer- و 4 تعتمد على الوقت، ونمط من الخلايا العصبية وكشف من خلال الكشف مناعى من فيراوالبروتينات لتر أو الجينات مراسل EGFP تتغير على مدار فترة البقاء على قيد الحياة مع تقدم الخلايا من خلال مراحل العدوى. بعد خمسة أيام التلقيح في العضلات، 3 الثالثة أو 4 الخلايا العصبية أجل عشر قد يكون قابل للكشف، ولكن قد تصبح أقرب الخلايا العصبية المصابة أفكارك. وهكذا ينبغي أن تحدد بقاء الوقت الأمثل تجريبيا لكل دراسة. فمن المستحسن لإجراء تحليل السلاسل الزمنية لتحديد تطور العدوى عن طريق دائرة وأفضل نقطة زمنية لوصفها الخلايا العصبية محددة من الفائدة دون المخاطرة الخلية أو حيوان الموت.

واحدة من أهم العوامل التي تؤثر على نجاح وضع العلامات مع PRV هو عيار الفيروسية. تم الإبلاغ عن تخفيضات كبيرة في عدد الخلايا المصابة عندما خفض عيار PRV-بارثا من 1.4 X 05-07 أكتوبر × 10 4 PFU / مل 23. ولذلك، فإننا نوصي باستخدام التتر أعلى من 1 × 10 7 PFU / مل وحفظ aliquoted السادسروس في -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها للحفاظ على العدوى لها. حتى عند استخدام عيار عالية، واحدة يجب أن نأخذ في الاعتبار أن ليس كل أنواع الخلايا قد تكون متساهلة للعدوى. لذلك، فإن الخلايا التي حددتها تتبع PRV قد لا تكون ممثلة تماما مدخلات هدفا المصاب.

ويركز الأسلوب هو موضح على فائدة PRV لتحليل efferents المركزية تنظم أهداف الطرفية، وتحديدا العضلات، من خلال الدوائر المتعددة متشابك. الدوائر العصبية الأخرى، مثل البصرية واللاإرادي 24، هي مناسبة تماما لهذه التقنية لأنها يمكن أيضا أن تصاب التلقيح الطرفية. ومع ذلك، PRV يمكن استخدامها بشكل فعال للحقن المباشر في الجهاز العصبي المركزي عند النظر في بعض القضايا بعناية، كما تمت مناقشته على نطاق واسع في مراجعة مسبقة 3. هؤلاء المؤلفين يذكر أن PRV-بارثا والسلالات ذات الصلة ملء نطاق واسع على العرش شجيري من الخلايا العصبية المصابة، مما يجعل PRV152 مناسبة تماما لidentifyiنانوغرام afferents إلى التشعبات البعيدة. هذا العقار للفيروس يجعل تقنية وصفها مفيدة بشكل خاص للاستدلال على لائحة أولية من المدخلات إلى التشعبات البعيدة تقع خارج منطقة خلايا الجسم التي عادة ما درس مع استشفاف التقليدية.

عند تتبع من الأهداف الطرفية، ينبغي النظر تعصيب متعاطف ونخلط ممكن. ولذلك، فإننا نوصي مقارنة في البداية أنماط وضع العلامات في حيوانات طبيعية وsympathectomized لتحديد ما إذا كان وضع العلامات PRV المدخلات متعاطفة سيؤثر على تفسير النتائج.

إشارة في الخلايا المصابة من EGFP التي أعربت عنها PRV152 يمكن تصويرها مباشرة باستخدام المجهر مضان دون الحاجة لالمناعية. ومع ذلك، وهذا إشارة قابلة للصورة تبيض ويحط على مر الزمن. والميزة الرئيسية لالمناعية جنبا إلى جنب مع DAB تلطيخ للبحث عن المفقودين المسالك هي طبيعة دائمة للمنتجات التفاعل. بينما هو أناالممكن أيضا استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات الفيروسية للكشف عن الخلايا المصابة، والعناصر الفيروسية مختلفة وليس بالضرورة شارك في توطين مع كل 25 آخرين أو مع إشارة EGFP. ولذلك، فإننا نوصي باستخدام الأجسام المضادة ضد EGFP للحفاظ على نمط العلامات التي لاحظها مضان.

لأن كل afferents إلى الخلية المصابة من المرجح أن تصبح قنوات لمرور عبر التشابك من الفيروسات، بما في ذلك تلك التي التشعبات الاتصال البعيدة، اعتبرنا أنه من المهم تحديد التتبع التقليدية التي البقع موثوق مثل هذه التشعبات لتأكيد لاحق من التبديلات في الدائرة التي تم تحديدها. اخترنا CTB لهذا الغرض، ووجد أنه يوفر تلطيخ جيد من التشعبات وعلى النقيض قوية مع كل من neuropil المحيطة والمحاور تنازلي من القشرة الحركية. على الرغم من أنه من الممكن عكس التلون من المحاور الملون وأجسام الخلايا (BDA = البني؛ CTB = أسود)، نجد أن الأسود يوفر أفضل شاركntrast لتصور المحاور عيار الجميلة.

نقطة مهمة أن نأخذ في الاعتبار عند تفسير أنماط وضع العلامات BDA هي أن BDA10kDa وهي تستخدم أساسا باعتبارها التتبع تقدمي ولكن يمكن أيضا تسمية الخلايا retrogradely (الشكل 6) 6. وعلاوة على ذلك، BDA يمكن نقلها retrogradely في خلية ثم توزيعها على طول محور عصبي ضمانات لموقع محطة أخرى. إذا كانت تلك الضمانات محوار موجودة في نفس المنطقة كهدف إسقاط المنطقة المحقونة، ثم أنه من الصعب تمييزها عن وضع العلامات تقدمي.

مذكرة فنية النهائية هي أن المعدن حقنة 34 G NanoFil أداء أفضل من العيار غرامة، وانسحبت الزجاج ماصة لحقن استشفاف في العضلات، ولكن تسبب التلف الميكانيكي الكثير عندما تستخدم لحقن داخل المخ في الحيوانات الصغيرة. ولذلك نوصي باستخدام حقنة معدنية لحقن الطرفية وماصة الزجاج لحقن المركزية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكتور توشيو Terashima من جامعة كوبي، اليابان، لتدريس تقنية جراحة الحنجرة، والدكتور لين Enquist من جامعة برينستون لتوريد PRV-بارثا. وأيد البحث من قبل جائزة الرواد NIH DP1 OD000448 لإريك D. جارفيس وجائزة زمالة أبحاث NSF العليا لغوستافو آرياغا. وتستخدم الأرقام من الأعمال السابقة الفضل بشكل مناسب تحت بلوس وان الوصول المفتوح جميل الترخيص (CC-BY) وفقا لسياسات التحرير في المجلة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NanoFil Microinjection System World Precision Instruments IO-Kit 34 G option
Stereotaxic frame David Kopf Instruments Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-204
Sliding microtome Leica SM2010 R
Name Company Catalog Number Comments
VetBond 3M 1469SB
Isofluorane (Forane) Baxter  1001936060
Betadine Swab Stick Cardinal Health 2130-01 200 count
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500
SuperFrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
Biotinylated dextran amines Invitrogen D-1956 10,000 MW
Pseudorabies virus Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) PRV152 Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) List Biological Laboratories 703
Cholera Toxin B Subunit List Biological Laboratories 103B
Anti-eGFP Open Biosystems ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine Sigma-Aldrich D5905 10 mg tablets
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H3410 30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl Sigma-Aldrich K4138 80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride Sigma-Aldrich 339350
Phosphate buffer Sigma-Aldrich P3619 1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital Sigma-Aldrich P3761 50 mg/ml dose
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylenes Sigma-Aldrich 534056 Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment Vet Depot 1017992

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  6. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
  7. Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
  8. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  9. Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
  10. Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
  11. Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
  12. Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
  13. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  14. Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
  15. Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  18. Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
  19. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
  20. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
  21. Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
  22. Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
  23. Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
  24. Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
  25. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).

Tags

علم الأعصاب، العدد 103، فيروس داء الكلب الكاذب، بكتيريا الكوليرا، الأمينات ديكستران المعقدة البيروكسيديز، تتبع الدائرة، التشريح العصبي.
عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arriaga, G., Macopson, J. J.,… More

Arriaga, G., Macopson, J. J., Jarvis, E. D. Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling. J. Vis. Exp. (103), e50672, doi:10.3791/50672 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter