Abstract
Transsynaptic трассировка стать мощным инструментом используются для анализа центральные эфференты, которые регулируют периферийные цели через несколько синаптических схем. Этот подход был наиболее широко применяемым в мозге путем использования свиной патогенных псевдобешенства (PRV) 1. ПРВ не заразить человекообразных обезьян, включая людей, поэтому он наиболее часто используется в исследованиях на мелких млекопитающих, особенно грызунов. Штамм псевдобешенства PRV152 выражает повышенную зеленый флуоресцентный белок (EGFP), репортер ген и только пересекает функциональные синапсы ретроградно через иерархической последовательности синаптических связей вдали от инфекции сайте 2,3. Другие штаммы PRV имеют различные свойства и микробиологические могут перевозиться в обоих направлениях (ПРВ-Беккер и ПРВ-Каплана) 4,5. Этот протокол будет заниматься исключительно PRV152. Предоставляя вирус на периферийном участке, такие как мышцы, можно ограничить проникновение вируса в Тон мозг через определенный набор нейронов. Полученную модель сигнала EGFP по всему мозгу затем разрешает нейроны, которые подключены к первоначально инфицированных клеток. Как распределенный характер transsynaptic трассировки с вирусом ложного бешенства делает интерпретации конкретных соединений в пределах определенного сети трудно, мы представляем чувствительный и надежный метод, использующий биотинилированных декстран амины (BDA) и холерный токсин субъединицы б (CTB) для подтверждения связи между клетками определенных с помощью PRV152. Иммунохимическое обнаружение АРП и CTB с пероксидазой и DAB (3, 3'-диаминобензидина) был выбран потому, что они эффективны при выявлении клеточных процессов, включая дистальных дендритов 6-11.
Introduction
Transsynaptic трассировка стать мощным инструментом используются для анализа центральные эфференты, которые регулируют периферийные цели через несколько синаптических схем. Этот подход был наиболее широко используются в мозге грызунов с использованием вируса свиного патогена псевдобешенства (PRV), особенно ослабленный штамм ПРВ-Барта, впервые описанного в 1961 году 12. Здесь мы приводим протокол для идентификации двигателя корковое представительство конкретных мышц или группы мышц с использованием вирусного рекомбинантные псевдобешенства штамма (PRV152), выражающая усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP) гена-репортера 2. Описанный метод использует поведение нейротропных вирусов, которые производят потомство, что инфекционный кросс синапсы инфицировать другие нейроны в функциональной схеме 3,4,13. PRV152, что изогенная с ПРВ-Барта, только пересекает синапсов ретроградно через иерархической последовательности синаптических связей от инфекции сайте <3,5/ SUP>. По строго контролировать периферийную сайт инфекции можно ограничить проникновение вируса в мозг через определенное подмножество моторных нейронов. Поскольку вирус инфицирует последовательно соединенных цепей нейронов, в результате структура сигнала EGFP по всему мозгу будет решить сеть нейронов, которые соединены с первоначально инфицированных клеток.
Дополнительным преимуществом использования вируса нейронной трассировки является усиление репортерного белка (EGFP в данном случае) в инфицированных клетках. Это усиление сигнала обеспечивает уровень чувствительности, что позволяет выявлять даже редкие прогнозов. Например, разреженный проекция из вибрисс моторной коре на лицевых мотонейронов, контролирующих усы было обнаружено у крыс с использованием вирусно выраженную зеленый флуоресцентный белок 14; Предыдущие исследования не смогли найти эту проекцию с использованием классических индикаторов без амплификации гена-репортера 11,15. К сожалениюМногие вирусные векторы трассировки, как тот, используемый в указанной работе, не пересекают синапсы, тем самым ограничивая их использование для отслеживания нескольких синаптические цепи.
Представляя различные преимущества для идентификации сети клеток, участвующих в моторном цепи, распределенный характер transsynaptic трассировки ПРВ-152 делает интерпретации конкретных соединений в цепи сложной. Таким образом, мы представляем простой метод для проверки конкретных соединений в пределах, определенных схем с использованием PRV-152 двойной маркировки с помощью биотинилированных декстран амины (BDA) и холерный токсин субъединицы б (CTB). Комбинированное использование BDA и СТВ хорошо создана подход для отслеживания соединений между конкретными множествами нейронов 6-8,11. При использовании вместе, эти два трейсеры могут быть визуализированы в том же разделе, используя два-DAB цвета (3, 3'-диаминобензидина) процедуры 16. Высокая молекулярная масса BDA (BDA10kDa) был выбран для этого протокола, потому что это уields подробную маркировку нейронных процессов 6,7,9. Дополнительные преимущества BDA10kDa включают в себя следующее: это преимущественно транспортируется в направлении антероградной 6-8; он может быть доставлен по ионтофоретическое или инъекции давления 6-8; он может быть визуализированы с помощью простого авидин биотинилированный-HRP (АВС) Процедура 17; и могут быть отображены с помощью световой микроскопии или 6,7,18 электронов. Иммунохимическое обнаружение CTB с пероксидазой и DAB был выбран для ретроградной маркировки мотонейронов, поскольку он эффективен при выявлении клеточных процессов, включая дистальных дендритов 10,19. Мы недавно использовали этот подход для идентификации вокальный двигательный путь у мышей и выявить редкие соединения из первичной моторной коры к гортани двигательных нейронов, которые ранее предполагалось, будет отсутствовать 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по Уходу за животными и использования Duke University по.
1. Сохранение Pseudorabies Вирус
- Мы получим живой вирус (PRV152) из лаборатории доктора Линн Энквист в Принстонском университете в титре 1 х 10 9 БОЕ / м. Протокол для создания вируса была опубликована 2.
- Алиготе вирус в 20 мкл на пробирку внутри BSL-2 биобезопасности кабинета и хранить при температуре -80 ° С при соответствующих условиях биобезопасности.
- Оттепель аликвоту PRV непосредственно перед инъекционных наркотиков.
2. Хирургическая подготовка для инъекций в мышцы
- Вызвать общий наркоз путем внутримышечной инъекции кетамина (ксилазина-100 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина) и поддерживать соответствующий анестетик плоскости с помощью изофлуораном.
- Защита роговицы с Офтальмология мази.
- Подготовьте тон хирургическая сайт в соответствии с асептической техники путем обрезки волос и дезинфекции хирургического сайт с чередующимися скрабы из Бетадин и 70% спирта (минимум 3 циклов). Будьте уверены, чтобы использовать стерильные шторы, чтобы покрыть хирургические области. Убедитесь, что придерживаться стерильных методов во всех процедурах.
- Сделайте разрез кожи и раскрыть мышцы интерес. Например, чтобы получить доступ к cricothyroid гортани мышцы надо сначала удалить облегающего часть грудино-подъязычная мышца.
- Печать любых перерезают мышцы с клеем VetBond ткани.
3. Введение PRV в мышцы
- Загрузите 10 мкл Nanofil систему микрошприца с недавно талой решения PRV, приложите 34 G иглу из нержавеющей стали, и тщательно закрепить его на стереотаксической устройства.
- Медленно снимите мертвое пространство и убедитесь, что решение выходит из микрошприца чаевые. Откажитесь жидкости в bioharzard отходов.
- Использование стереотаксической micropositioning прибор тщательно поместить кончик микрошприца в мышцу и медленно интерес заполнить мышцы, пока припухлость не видно. Скорость впрыска будет варьироваться в зависимости от размера и объема мышц, который будет введен. Например, пять инъекции 200 нл (1 мкл) общей со скоростью 4 л / сек должны быть сделаны 1 мин друг от друга на том же сайте, чтобы заполнить cricothyroid мышцы. Перемещение шприц к следующему мышцы интерес (боковая cricoarytenoid в данном случае) и повторите процедуру инъекции. Только прокол каждую мышцу раз.
- Отвести микрошприца через пять минут.
- Печать перерыв в фасции, используя клей VetBond ткани.
- После того как все инъекции были завершены, закрыть рану, используя клей VetBond ткани. В зависимости от ваших местных institional принципов использования животных, швов или раны клипов могут быть использованы.
- Монитор животное до грудины лежачее положение и обеспечить обезболивание, продукты питания, воду, и уход, как того требует унаши институциональные принципы использования животных.
- После экспериментально определенной продолжительности жизни (в данном случае, 90 ч, чтобы этикетка 2 го порядка корковых нейронов), пожертвовать животное от передозировки пентобарбитала и заливать транскардиальную 0,9% растворе с последующим 4% формальдегида в 0,1 М PBS.
- Снимите и пост-исправить мозг в 4% формальдегиде в течение 24 часов.
- Cryoprotect мозг в фосфатном буфере, содержащем 30% сахарозы, по крайней мере 48 часов.
4. Иммунохимический Обнаружение EGFP
- Вырезать разделы на 40 мкм на скользящей микротоме и сохранить плавающие разделов в 0,1 М PBS. Более тонкие участки, например 30 мкм, может быть использован при окраске смонтированные секции.
- Quench разделы для 30 мин в 0,3% H 2 O 2 в PBS, защищенных от света.
- Блок неспецифических антигенов в секциях в течение 30 мин в PBS, содержащий 0,3% Tween 20 с нормальной козьей сывороткой из набора Vectastain Elite (VE комплект).
- Промыть секций три раза в PBS в течение 5 мин, затем инкубируют их в течение 1 часа в козьего антитела против кроличьего вторичного антитела от VE комплект при комнатной температуре.
- Приготовьте раствор ABC от VE комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Промыть секций три раза в PBS в течение 5 мин, затем реакцию их в течение 1 часа в растворе ABC от VE комплект при комнатной температуре.
- Промыть секций три раза в фосфатном буфере в течение 10 мин, и разработать в течение 8 мин в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,05% DAB (3, 3'-диаминобензидин) и 0,015% H 2 O 2.
- Mount разделы на слайдах SuperFrost Plus и обезвоживает их через градуированной серии алкоголя (70%, 95%, 100% и 100% в течение 5 минут каждый).
- Очистите разделы через два ксилола моет (5 мин каждый) и покровное слайды с предметный столик Permount монтажа среды.
- Изображение смонтированные разделы на микроскоп. Продукт реакции DAB insidе клетки должны появиться коричневый. Оцифрованные изображения могут быть цвет инвертируется, чтобы выделить мелкие процессы.
5. Хирургическая подготовка для инъекций трассеров в мозг регионов обнаружен PRV Tracing
- Вызвать общий наркоз путем внутримышечной инъекции кетамина (ксилазина-100 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина) и поддерживать соответствующий анестетик плоскости с помощью изофлуораном.
- Защита роговицы с Офтальмология мази.
- Закрепите головку в соответствующем стереотаксической рамы.
- Подготовка операционного поля в соответствии с асептической техники путем обрезки волос и дезинфекции сайт с чередующимися скрабы из Бетадин и 70% спирта (минимум 3 циклов).
- Сделайте надрез кожи головы и убрать кожу над области мозга интерес.
- Выполните небольшой трепанацию черепа в соответствующих стереотаксических координат. Например, координаты для laryngeally подключенного моторной коры, идентифицированной ПРВ трассировки вп взрослой мыши являются 1,2 мм боковые и 0,2 мм ростральнее брегмы.
6. Введение Биотинилированные декстран аминов в мозге
- Подготовьте 7,5% биотинилированных декстран амины (BDA) путем растворения 25 мг BDA (10000 МВт) в 333 мкл стерильного физиологического раствора.
- Загрузите систему микропипетки Nanoject II с достаточной решение BDA для запланированных инъекций.
- Медленно снимите мертвое пространство и убедитесь, что решение выхода микропипетки наконечник.
- Использование стереотаксической микропозиционированное устройство осторожно опустите кончик микропипетки в области мозга интерес и медленно вдохнуть BDA. Регулировка скорости впрыска в зависимости от размера области, чтобы быть помечены. Например, 12 инъекций 4,6 нл должно быть Сделано четырех разных местах 0,2 мм друг от друга (ростро-каудальном направлении) для покрытия laryngeally подключенного двигателя кору у взрослых мышей. Конечный объем впрыска должен быть отрегулирован в соответствии с размером области мозга интерес, Имея в виду, что этикетка может передаваться от стержневой пресс путем диффузии через ткани мозга и вдоль процессов меченных нейронов.
- Уплотнение трепанации черепа с помощью стоматологического цемента и закрыть рану головы, используя клей VetBond ткани.
- Монитор животное до грудины лежачее положение и обеспечить обезболивание, продукты питания, воду, и уход в соответствии с требованиями вашей организации принципов использования животных.
7. Инъекции токсина холеры субъединицы б в мышцы
- Готовят 1% холерный токсин субъединицы B (CTB) растворением 1 мг CTB в 100 мкл стерильного физиологического раствора.
- Через шесть дней после инъекции АРП в мозг, выполнить хирургическую Получение, как описано выше для инъекций PRV в мышцы.
- Загрузите 10 мкл Nanofil систему микрошприца раствором CTB, приложите 34 G иглу из нержавеющей стали, и тщательно закрепить его на стереотаксической устройства.
- Выполните микроинъекции в мышцу (ы), представляющие интерес, как ранее деописано для PRV.
- Монитор животное до грудины лежачее положение и обеспечить обезболивание, продукты питания, воду, и уход в соответствии с требованиями вашей организации принципов использования животных.
- Через три дня после инъекции CTB, пожертвовать животное от передозировки пентобарбитала и заливать транскардиальную 0,9% растворе с последующим 4% формальдегида в 0,1 М PBS.
- Снимите и пост-исправить мозг в 4% формальдегиде в течение 24 часов.
- Cryoprotect мозг в фосфатном буфере, содержащем 30% сахарозы, по крайней мере 48 часов.
8. Выявление BDA и CTB в те же разделы
- Вырезать разделы на 40 мкм на микротоме и сохранить плавающие разделов в 0,1 М PBS.
- Quench разделы для 30 мин в 0,3% H 2 O 2 в PBS, защищенных от света.
- Приготовьте раствор ABC от VE комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Промыть секций три раза в PBS в течение 5 мин, затем реакцию их в течение 1 часа в растворе ABC при комнатной температуре. Промыть секций три раза в фосфатном буфере в течение 10 мин, и разработать в течение 8 мин в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,05% DAB (3, 3'-диаминобензидина), 0,015% H 2 O 2, и 0,05% хлорида никеля. Продукт реакции DAB внутри клеток должно появиться черный.
- Блок секции течение 30 мин в PBS, содержащем 0,3% Твин-20 с нормальной кроличьей сывороткой из набора Vectastain Elite.
- Инкубировать заблокирован секции в течение 2 ч в козьего антитела против CTB (1: 10000) при комнатной температуре.
- Промыть секций три раза в PBS в течение 5 мин, затем инкубируют их в течение 1 часа в кроличьей анти-козьего антитела из вторичного В.Е. комплект при комнатной температуре.
- Приготовьте раствор ABC от VE комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Промыть секций три раза в PBS в течение 5 мин, затем реакцию их в течение 30 мин в растворе ABC при комнатной температуре.
- Промыть секций три раза в фосфатном буфере в течение 10 мин, и разработать до 8 мин в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,05% DAB (3, 3"-diaminobenzidine) и 0,015% Н 2 О 2. Продукт реакции DAB внутри клеток должно появиться коричневый.
- Mount разделы на слайдах SuperFrost Plus и обезвоживает их через градуированной серии алкоголя (70%, 95%, 100% и 100% в течение 5 минут каждый).
- Очистите разделы через два ксилола моет (5 мин каждый) и покровное слайды с предметный столик Permount монтажа среды.
- Изображение смонтированные разделы на микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Окрашивание для EGFP должны начать показывать слабый сигнал в первичных двигательных нейронов примерно 72 ч после введения PRV152 в мышцы. Репликация и transsynaptic транспорт вируса titer- и зависит от времени 4. Около 90 ч после инъекции, окрашивание EGFP покажет четкого сигнала в клетках, зараженных порядка 2-го. Более длительные сроки выживаемости покажет 3-го и более высоких порядков, но клетки выживаемости ограничены летальности PRV приблизительно в 5 дней после прививки.
На рисунке 1а нейроны зараженных PRV152 выражения EGFP в ядро ambiguus, в котором находится гортани моторные нейроны, 94 ч после инъекции PRV152 в двух из семи гортани мышц. Поскольку вирус вошел в мозг через нейроны, которые возбуждают зараженные мышцы, другие голосовой бассейны двигательных нейронов, таких как подъязычного ядра, не выражают EGFP (1б).
3 показана зараженные премоторной нейронов в моторной коре, экспрессирующие EGFP контралатеральной к периферийному месте инъекции. Потому PRV152 распространяется через мульти-синаптических схем, падающих на гортани моторных нейронов в ядре ambiguus, это может бе Предполагается, что только популяция клеток, которые составляют двигатель коркового представительства гортани мускулатуры были инфицированы. Отсутствие сигнала EGFP в остальной части секции, показанной (и большинство из переднего мозга не показано) демонстрирует специфичность маркировки.
4 показан АРП-меченых аксонов в стволе мозга на уровне ядра ambiguus. Аксоны контакт с CTB-положительных моторных нейронов ретроградно меченных инъекций в гортани мышц. Аксоны показаны формирования варикоз и предполагаемые терминала бутоны возле дендритов и сомы гортани двигательных нейронов. Дальнейшие эксперименты с использованием электронной микроскопии или электрофизиологии необходимы для определения, являются ли эти варикоз представляют синаптические бутоны.
На рисунке 5а двустороннего инъекции BDA размещены в laryngeally подключенного моторной коры, как указано ретроградной транссинаптического трассировки с PRV152. Бек AUSE BDA не направленно конкретно, оба афферентные и эфферентные связи могут быть помечены. Например, как поле проекция (антероградной) и клеточных тел (ретроградная) этикетки замечены в таламусе (5б).
Рисунок 1: Нейроны Зараженные с PRV152 выражая EGFP (зеленый) и холинацетилтрансферазы иммунопозитивных мотонейронов (красный) в (а) Ambiguus (AMB) и (б) Подъязычный (XII), Ядра мыши ствола мозга 94 ч после введения PRV152 в Cricothyroid и боковой Cricoarytenoid гортани Мышцы. РФ = ретикулярная формация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
g2.jpg "/>
Рисунок 2:. Psuedorabies Вирус (PRV152) инфекции в стволе мозга мыши 86 ч после введения PRV152 в мышцах Cricothyroid и боковой Cricoarytenoid гортани (а) нейроны, экспрессирующие усиленный зеленый флуоресцентный белок (белые, цвета перевернутые из оригинальных светлого изображений окрашенных участков ) в ядро ambiguus (AMB) ипсилатерального закачиваемой мышцы, окружающие ретикулярная формация (РФ) и одиночные ядра (Соль), но не подъязычного ядра (XII),. (Б) Посол и ретикулярные интернейроны в высоком увеличении (красные стрелки, сотовые органы в РФ). Масштабные бары: 1 мм для; 100 мкм для б. (С изменениями из Арриага др. 2012). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Кортикальная пирамидальных нейронов выражая EGFP (белый, цвета перевернутые из оригинальных светлого изображений окрашенных участков) в корковом слое V М1 после инъекции Psuedorabies Virus (PRV152) в мышцах Cricothyroid и боковой Cricoarytenoid гортани Масштаб бары: 1 мм для Главная панель; 200 мкм для вставки. (С изменениями из Арриага др. 2012).
Рисунок 4:. М1 Аксоны в стволе головного мозга (а) низкой мощности корональной разделе ствола головного мозга, содержащего СТВ-меченых нейронов моторных в Р.М. (коричневый) от инъекции в гортани мышц и М1 аксонов (черный) от инъекции BDA в M1. BDA помечены аксоны можно увидеть в кортико-пирамидальный (Пи) дорожки. Сокращения: АТ-ядро ambiguus; Пи, пирамиды; MRF, гeticular формирование непосредственно медиальнее Р.М.; ФПИ, ретикулярная формация спинной к АТ. (Б) Высокое увеличение из BDA помечены аксон (черный, наконечники стрел) из M1, что делает контакт (стрелка) на А AMB двигательных нейронов (CTB-коричневых). (С) М1 аксоны (черный) вдоль (стрелки) и рядом (наконечники стрел) большой Посол двигательных нейронов дендриты, что излучает из Amb. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Инъекции сайта и дополнительные двунаправленные соединения, обнаруженные в BDA инъекций не видел с ПРВ транссинаптического трассировки. (а) Двусторонние биотинилированные декстран амин (BDA) инъекции (черный) в первичной моторной коры (М1) показал, густой терминала поле проекции (черный) в основной стриатуме. (б) Cortiческие аксоны от M1 прекратить в брюшной латерального ядра таламуса (ВЛ); Кластер таламуса клеток (темно-коричневый и отмечен белой стрелкой головы), что проект обратно в пение области M1 наблюдается также в VL. Внутренняя капсула (IC) имеет меченых аксонов, идущие от коры. Масштабные бары: 1 мм для; 200 мкм для б. (С изменениями из Арриага др. 2012). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть ряд вопросов, которые должны быть приняты во внимание при планировании эксперимента, используя PRV152 4,21. Самое главное, вирус смертелен псевдобешенства. Как упоминалось ранее, приматы, включая человека, не восприимчивы к инфекции, но соответствующий необходимо проявлять осторожность, чтобы защитить других животных. Взрослые, как правило, выживают мышей от пяти до семи дней после прививки с ослабленного штамма PRV152. Таким образом, PRV152 не подходит для экспериментов, которые требуют времени выживания более одной недели. Кроме того, инфицированные животные обычно демонстрируют признаки болезни в течение периода выживания, тем самым ограничивая полезность PRV152 для экспериментов, требующих наблюдения нормального поведения.
Кроме того, PRV152 вызывает цитотоксический иммунный ответ 22. Поскольку репликации и передачи вируса titer- и зависит от времени 4, схема нейронов выявлены иммунохимического обнаружения Viraл белки или репортер генов EGFP изменится в течение срока жизни по мере прохождения клетки стадиях инфекции. Через пять дней после прививки в мышцах, 3 или 4 нейроны го порядка может быть обнаружено, но самые ранние инфицированных нейронов может стать апоптическая. Таким образом, оптимальное время выживания должна быть определена экспериментально для каждого исследования. Рекомендуется провести анализ временных рядов для определения прогрессирования инфекции через цепи и лучшие точки для маркировки времени конкретные нейроны, представляющие интерес, не рискуя клеток или гибели животных.
Одним из наиболее важных факторов, влияющих на успешность маркировки с PRV является титр вируса. Отмеченные сокращение числа инфицированных клеток были зарегистрированы при уменьшении титра PRV-Барта от 1,4 × 10 5 до 7 · 10 4 БОЕ / мл 23. Поэтому, мы рекомендуем использовать титры выше 1 х 10 7 БОЕ / мл и аликвоты учета вирус при -80 ° С до тех пор, пока используется для поддержания его инфекционности. Даже при использовании высокий титр, следует иметь в виду, что не все типы клеток могут быть разрешительная инфекции. Таким образом, клетки, идентифицированные PRV трассировки не может быть полностью представитель входов к зараженному цели.
Описанный метод сосредотачивается на полезности PRV для анализа центральные регулирующие эфференты периферийных целей, в частности, через мышцы мульти-синаптических схем. Другие нейронные цепи, такие как визуальные и вегетативной 24, хорошо подходят для этой техники, так как они также могут быть инфицированы периферической инокуляции. Тем не менее, PRV могут быть эффективно использованы для прямого впрыска в центральной нервной системе, когда некоторые вопросы тщательно рассматриваются, как описано подробно в обзоре предварительного 3. Эти авторы отмечают, что ПРВ-Барта и связанные с ними штаммы широко заполнить дендритных беседки зараженных нейронов, делая PRV152 хорошо подходит для identifyiнг афферентов в дистальных дендритов. Это свойство вируса делает Описанная методика особенно полезна для выведения предварительный список входов в дистальных дендритов, расположенных за пределами региона тела клетки, что, как правило, изученных с обычными индикаторов.
При трассировке из периферических целей, симпатической иннервации следует считать возможным посрамить. Поэтому, мы рекомендуем сначала сравнивая образцы маркировки в нормальных и sympathectomized животных, чтобы определить ПРВ маркировка симпатических входов повлияет интерпретацию результатов.
Сигнал в инфицированных клетках из EGFP, выраженных PRV152 могут быть отображены непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии без необходимости иммуногистохимии; Однако, этот сигнал подвергается фото-отбеливание и ухудшает течение долгого времени. Основным преимуществом иммуногистохимии в сочетании с DAB окрашивания для отслеживания путей является постоянным природа продуктов реакции. В то время как это яТакже возможно использовать антитела против вирусных белков, чтобы обнаружить инфицированные клетки, различные вирусные элементы не обязательно совместно локализовать друг с другом или с 25 сигнала EGFP. Поэтому, мы рекомендуем использовать антитела против EGFP сохранить маркировки схеме, что и с помощью флуоресценции.
Потому что все афферентные в инфицированной клетки могут стать проводниками transsynaptic прохождения вируса, в том числе те, которые с нами дистальных дендритов, мы сочли важным, чтобы выбрать обычный трассирующими, которые надежно окрашивает такие дендриты для последующего подтверждения реле в цепи определены. Мы выбрали CTB для этой цели, и обнаружили, что он обеспечивает хорошее окрашивание дендритов и сильный контраст с обеих окружающей нейропиля и нисходящих аксонов из моторной коре. Хотя это можно переломить окраску окрашенных аксонов и клеточных тел (BDA = коричневый; CTB = черный), мы находим, что черный обеспечивает наилучшее сотрудничествоntrast для визуализации тонких аксонов калибра.
Важным моментом, чтобы сохранить в виду при интерпретации BDA шаблоны маркировки является то, что BDA10kDa в основном используется в качестве индикатора антероградной но также может маркировать клетки ретроградно (рис 6) 6. Кроме того, БДА могут транспортироваться ретроградно в клетку, то распределенной вдоль аксона обеспечения на другой терминал сайте. Если эти аксонов коллатерали присутствуют в той же области, в проекции цели введенного области, то трудно отличить их от антероградной маркировки.
Окончательное техническое примечание, что металл шприц 34 G Nanofil выполняет лучше, чем штраф, калибра, вытащил стеклянную пипетку для инъекции индикаторов в мышцах, но вызывает слишком много механических повреждений при использовании для инъекций в внутримозговых мелких животных. Поэтому мы рекомендуем использовать металлическую шприц для инъекций периферийных и стеклянную пипетку для центральных инъекций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Тосио Terashima Кобе университета, Япония, для обучения технику гортани хирургии, доктор Линн и Энквист из Принстонского университета для подачи PRV-Барта. Исследование было поддержано НИЗ пионером награждения DP1 OD000448 Эриха Д. Джарвис и премии NSF Высшее исследований стипендий в Густаво Арриага. Фигуры из соответствующим зачисленных предыдущей работе используются под PLoS ONE открытого доступа Creative Commons лицензии (CC-BY), в соответствии с редакционной политики журнала.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
