Abstract
Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau en utilisant le virus de la pseudorage porcine pathogène (PRV) 1. PRV ne pas infecter les grands singes, dont les humains, il est le plus souvent utilisé dans les études sur les petits mammifères, en particulier les rongeurs. La souche de la pseudorage PRV152 exprime la protéine fluorescente (eGFP) gène rapporteur verte améliorée et que traverse synapses fonctionnelles manière rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques de distance à partir du site d'infection de 2,3. D'autres souches de PRV ont des propriétés distinctes et microbiologiques peuvent être transportés dans les deux directions (PRV-Becker et Kaplan-PRV) 4,5. Ce protocole traitera exclusivement avec PRV152. En fournissant le virus à un site périphérique, par exemple muscle, il est possible de limiter l'entrée du virus dans til cerveau à travers un ensemble spécifique de neurones. Le motif de signal de eGFP résultant dans tout le cerveau résout alors les neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement. Comme la nature distribuée de traçage transsynaptique par le virus de la pseudo rend l'interprétation des connexions spécifiques au sein d'un réseau identifié difficile, nous présentons une méthode sensible et fiable utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la toxine du choléra sous-unité B (CTB) pour confirmer les connexions entre les cellules identifiées à l'aide PRV152. La détection immunochimique de BDA et la CTB à la peroxydase et DAB (3, 3 'diaminobenzidine) a été choisi parce qu'ils sont efficaces à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 6-11.
Introduction
Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant utilisé pour analyser efferents centrales qui régulent cibles périphériques par le biais des circuits multi-synaptiques. Cette approche a été le plus largement utilisé dans le cerveau de rongeurs en utilisant le virus de la pseudo pathogènes porcine (PRV), en particulier la souche atténuée PRV-Bartha décrite pour la première en 1961 12. Ici, nous présentons un protocole pour identifier la représentation corticale motrice des muscles spécifiques ou groupes de muscles à l'aide d'une souche de virus de la pseudorage recombinant (PRV152) exprimant la protéine de renforcement fluorescente verte (EGFP) gène rapporteur 2. La méthode décrite exploite le comportement des virus neurotropes, qui produisent une descendance infectieuse que les synapses croisées pour infecter d'autres neurones dans un circuit fonctionnel 3,4,13. PRV152, qui est isogénique avec PRV-Bartha, seule traverse synapses rétrograde à travers la séquence hiérarchique des connexions synaptiques en dehors du site d'infection 3,5 </ sup>. En contrôlant avec précision le site de l'infection périphérique, il est possible de limiter la pénétration du virus dans le cerveau à travers un sous-ensemble spécifique des motoneurones. Comme le virus infecte de manière séquentielle de chaînes de neurones connectés, le motif de signal de eGFP dans le cerveau résultant sera alors de résoudre le réseau de neurones qui sont reliés aux cellules infectées initialement.
Un avantage supplémentaire de l'utilisation de virus pour le traçage de neurones est l'amplification de la protéine rapporteur (eGFP dans ce cas) dans les cellules infectées. Cette amplification de signal fournit un niveau de sensibilité qui permet la détection des projections même clairsemés. Par exemple, une projection creuse de vibrisses de cortex moteur aux neurones moteurs faciaux contrôlant les whiskers a été trouvé chez les rats en utilisant viralement exprimé la protéine fluorescente verte 14; études précédentes ont échoué à trouver cette projection utilisant des traceurs classiques sans amplification du gène rapporteur 11,15. Malheureusement, De nombreux vecteurs de traçage virales, comme celui utilisé dans l'étude citée, ne traversent pas les synapses, ce qui limite leur utilisation pour le traçage des circuits multi-synaptiques.
Bien que présentant des avantages distincts pour identifier le réseau de cellules participant à un circuit de moteur, la nature distribuée transsynaptique de traçage avec PRV-152 rend l'interprétation de liaisons spécifiques dans le circuit difficile. Par conséquent, nous présentons une méthode simple pour valider les connexions spécifiques au sein de circuits identifiés en utilisant PRV-152 par double marquage utilisant des amines biotinylés dextran (BDA) et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). L'utilisation combinée de BDA et la CTB est une approche bien établie pour tracer des liens entre des ensembles spécifiques de neurones 6-8,11. Lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces deux traceurs peuvent être visualisées dans la même section en utilisant un DAB à deux couleurs (3, 3 'diaminobenzidine) procédure 16. Haut poids moléculaire BDA (BDA10kDa) a été choisi pour ce protocole parce qu'il yOMAINES étiquetage détaillé des processus neuronaux 6,7,9. Des avantages supplémentaires de BDA10kDa sont les suivants: il est de préférence transporté dans le sens antérograde 6-8; il peut être livré par iontophorèse ou l'injection de pression 6-8; il peut être visualisée par une simple avidine-HRP biotinylé de (ABC) 17 procédure; et il peut être imagée par microscopie optique ou électronique 6,7,18. La détection immunochimique de la CTB à la peroxydase et DAB a été choisi pour marquage rétrograde des motoneurones parce qu'il est efficace à révéler les processus cellulaires, y compris les dendrites distales 10,19. Nous avons récemment utilisé cette approche pour identifier la voie de moteur vocal chez la souris et de révéler une connexion clairsemée du cortex moteur primaire des neurones moteurs du larynx, qui était auparavant supposées être absent 20.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Duke.
1. Enregistrement des virus de la pseudo
- Nous obtenons virus vivant (PRV152) du laboratoire du Dr Lynn Enquist à l'Université de Princeton à un titre de 1 x 10 9 pfu / m. Le protocole pour générer le virus a été publiée deux.
- Aliquoter le virus à 20 pi par tube à l'intérieur d'une armoire et un magasin BSL-2 biosécurité à -80 ° C dans des conditions de biosécurité appropriées.
- Décongeler une aliquote de PRV immédiatement avant injection.
2. Préparation chirurgicale pour injections dans le muscle
- Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane.
- Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique.
- Préparer til site chirurgical selon la technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site chirurgical avec gommages alternées de Bétadine et 70% d'alcool (minimum de 3 cycles). Veillez à utiliser des champs stériles pour couvrir les zones chirurgicales. Assurez-vous d'adhérer à des techniques stériles tout au long des procédures.
- Faire une incision de la peau et de révéler le muscle d'intérêt. Par exemple, pour accéder au muscle laryngé cricothyroïdienne il est nécessaire d'enlever d'abord la partie recouvrant le muscle sterno de.
- Sceller toutes les muscles sectionnés avec colle tissulaire Vetbond.
3. Injection de PRV dans le muscle
- Charger le système d'microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution de PRV fraîchement décongelé, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et monter avec précaution sur l'appareil stéréotaxique.
- Lentement effacer l'espace mort et vérifiez que la solution quitte la pointe microseringue. Jeter fluide comme un déchet bioharzard.
- Utilisation d'un microP stéréotaxiqueDispositif OSITIONNEMENT placer soigneusement la pointe de la microseringue dans le muscle d'intérêt et remplir lentement le muscle jusqu'à ce qu'une légère enflure est visible. La vitesse d'injection varie en fonction de la taille du muscle et le volume à injecter. Par exemple, cinq injections de 200 nl (1 pi totale) à un taux de 4 nl / s devraient être faites 1 min part sur le même site pour remplir le muscle cricothyroïdienne. Déplacez la seringue à la prochaine musculaire d'intérêt (le crico-aryténoïdienne latéral dans ce cas) et répétez la procédure d'injection. Seulement une fois perforer chaque muscle.
- Rétracter la microseringue après cinq minutes.
- Sceller la rupture de l'aponévrose en utilisant un adhésif de tissu Vetbond.
- Après toutes les injections ont été réalisées, fermer la plaie avec de la colle tissulaire Vetbond. Selon vos INSTITUTIONNEL directives d'utilisation des animaux locaux, des sutures ou des clips plaie peut être utilisé.
- Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par ynos institutionnels directives d'utilisation des animaux.
- Après le temps de survie déterminée expérimentalement (dans ce cas, 90 h à l'étiquette d'ordre 2 neurones corticaux), sacrifier l'animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS.
- Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures.
- Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures.
4. immunochimique Détection de eGFP
- Couper des sections à 40 um sur un microtome à glissière et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS. Sections plus minces, par exemple de 30 um, peuvent être utilisés lorsque la coloration sections montées.
- Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière.
- Bloquer antigènes non spécifiques dans les sections pendant 30 min dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de chèvre normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite (VE kit).
- Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin de la VE kit à température ambiante.
- Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
- Lavez sections trois fois dans PBS pendant 5 min, en les ensuite réagir pendant 1 heure dans une solution ABC de la VE kit à température ambiante.
- Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2.
- Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d'alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun).
- Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage.
- Image les sections montées sur un microscope. Le produit de réaction DAB inside les cellules doivent apparaître brun. Les images numérisées peuvent être de couleur inversé pour mettre en évidence les processus fines.
5. Préparation chirurgicale pour injection de traceurs dans les régions cérébrales Découvert par PRV Tracing
- Induire une anesthésie générale par injection intramusculaire de kétamine-xylazine (100 mg / kg de kétamine, 10 mg / kg de xylazine) et maintenir un plan anesthésique approprié en utilisant isofluorane.
- Protéger les cornées avec une pommade ophtalmique.
- Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique appropriée.
- Préparer le site chirurgical selon une technique aseptique en coupant les cheveux et la désinfection du site avec des gommages alternées de Bétadine et 70% d'alcool (minimum de 3 cycles).
- Faire une incision du cuir chevelu et se rétracter la peau sur la région du cerveau d'intérêt.
- Effectuer une petite craniotomie les coordonnées stéréotaxiques appropriées. Par exemple, les coordonnées de laryngeally relié cortex moteur identifié par un PRV en traçantn souris adulte sont de 1,2 mm et 0,2 mm latérale rostrale à Bregma.
6. L'injection de dextrane Amines biotinylés en réflexion
- Préparer 7,5% Amines dextran biotinylé (BDA) en dissolvant 25 mg de BDA (10.000 MW) dans 333 ul de solution saline stérile.
- Charger le système d'micropipette Nanoject II avec une solution BDA suffisante pour les injections prévues.
- Lentement effacer l'espace mort et vérifier que la solution est de quitter la pointe de la micropipette.
- L'utilisation d'un dispositif de micropositionnement stéréotaxique abaisser soigneusement la pointe de la micropipette dans la région du cerveau d'intérêt et injecter lentement BDA. Ajuster le débit d'injection en fonction de la taille de la zone à marquer. Par exemple, 12 injections de 4,6 nl devraient être faites à quatre endroits différents de 0,2 mm de distance (direction rostro-caudale) pour couvrir le cortex moteur laryngeally connecté chez la souris adulte. Le volume d'injection final doit être ajustée en fonction de la taille de la région du cerveau d'intérêt, En gardant à l'esprit que l'étiquette peut se propager à partir du noyau d'injection par diffusion à travers les tissus du cerveau et le long des processus de neurones marqués.
- Sceller le craniotomie utilisant ciment dentaire, et de fermer la plaie du cuir chevelu avec de la colle tissulaire Vetbond.
- Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l'utilisation des animaux.
7. L'injection de toxine cholérique Subunit b dans le muscle
- Préparer une sous-unité de choléra% toxine B (CTB) en dissolvant 1 mg de CTB dans 100 ul de solution saline stérile.
- Six jours après l'injection dans le cerveau BDA, effectuer la préparation chirurgicale décrite ci-dessus pour les injections dans le muscle PRV.
- Charger le système d'microseringue Nanofil de 10 pi avec une solution CTb, fixer une aiguille en acier inoxydable de 34 G, et soigneusement le monter sur le dispositif stéréotaxique.
- Effectuez les micro-injections dans le muscle (s) d'intérêt comme précédemment déprescrite pour PRV.
- Surveiller l'animal jusqu'à décubitus sternal et de fournir l'analgésie, de la nourriture, de l'eau, et aux soins requis par vos directives institutionnelles de l'utilisation des animaux.
- Trois jours après l'injection CTb, sacrifier l'animal par une overdose de pentobarbital et perfuser transcardiaque avec saline à 0,9% suivi par 4% de formaldéhyde dans 0,1 M de PBS.
- Retirez et post-fixer le cerveau de 4% de formaldéhyde pendant 24 heures.
- Cryoprotect du cerveau dans du tampon phosphate contenant 30% de saccharose pendant au moins 48 heures.
8. Détection de BDA et la CTB dans les mêmes sections
- Couper des sections à 40 um sur un microtome et économisez sections flottantes dans 0,1 M PBS.
- Étancher sections pendant 30 min dans 0,3% H 2 O 2 dans PBS protégées de la lumière.
- Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
- Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 1 heure dans une solution ABC à TA. Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et développer pendant 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine), 0,015% de H 2 O 2, et 0,05% de chlorure de nickel. Le produit de la réaction DAB à l'intérieur des cellules devrait apparaître en noir.
- Sections de bloc pendant 30 minutes dans du PBS contenant 0,3% de Tween 20 avec du sérum de lapin normal à partir du Kit VECTASTAIN Elite.
- Incuber sections bloqué pendant 2 heures dans de chèvre anti-CTB (1: 10,000) à la température ambiante.
- Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis les incuber pendant 1 heure dans un anticorps secondaire de lapin anti-chèvre de la VE kit à température ambiante.
- Préparer la solution du kit ABC VE selon les instructions du fabricant.
- Lavez sections trois fois dans du PBS pendant 5 min, puis leur réagir pendant 30 min dans une solution ABC à TA.
- Laver les sections trois fois dans du tampon phosphate pendant 10 minutes, et pour développer jusqu'à 8 min dans un tampon phosphate, pH 7,4, contenant 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) et 0,015% de H 2 O 2. Le produit de la réaction DAB à l'intérieur des cellules devrait apparaître brun.
- Sections de montage sur des lames Superfrost Plus et les déshydrater à travers une série d'alcool graduée (70%, 95%, 100% et 100% pendant 5 minutes chacun).
- Désactivez les sections à travers deux lavages xylène (5 minutes chacun) et les diapositives avec lamelle Permount milieu de montage.
- Image les sections montées sur un microscope.
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Representative Results
Coloration pour eGFP devrait commencer à montrer des signaux faibles dans les neurones moteurs primaires d'environ 72 heures après l'injection dans le muscle PRV152. La réplication et de transport transsynaptique du virus sont titer- et dépendante du temps 4. Environ 90 heures après l'injection, eGFP coloration va révéler signal fort dans les cellules infectées par ordre 2 e. Prolongement de la durée de survie révéleront 3 ème et cellules d'ordre supérieur mais les heures de survie sont limitées par la létalité du PRV à environ 5 jours après l'inoculation.
La figure 1a montre neurones infectés par PRV152 exprimant eGFP dans ambigu noyau, qui abrite les neurones moteurs du larynx, 94 h après l'injection de PRV152 dans deux des sept muscles laryngés. Parce que le virus est entré dans le cerveau par les neurones qui innervent les muscles infectés, d'autres groupes de neurones moteurs phonatoires, comme le noyau de l'hypoglosse, ne pas exprimer eGFP (figure 1b).
La figure 3 montre les neurones prémotrices infectés dans le cortex moteur exprimant eGFP contralatérale au site d'injection périphérique. Parce PRV152 propage à travers des circuits multi-synaptiques empiétant sur les neurones moteurs du larynx dans ambiguus noyau, il peut be suppose que seule la population de cellules qui composent la représentation de moteur cortical de la musculature du larynx ont été infectées. L'absence de signal de eGFP dans le reste de la section représentée (et la plupart du cerveau antérieur non représenté) démontre la spécificité de l'étiquetage.
La figure 4 montre les axones BDA-marqué dans le tronc cérébral au niveau du noyau ambigu. Les axones sont en contact avec les neurones moteurs CTB-positives marquées de façon rétrograde par injections dans les muscles laryngés. Les axones sont présentés formant varicosités et boutons terminaux putatifs près les dendrites et soma des neurones moteurs du larynx. D'autres expériences à l'aide de la microscopie électronique ou électrophysiologie sont nécessaires pour déterminer si ces varicosités représentent boutons synaptiques.
La figure 5a montre une injection bilatérale de BDA placée dans le cortex moteur laryngeally connectée identifiée par rétrograde transsynaptique traçage avec PRV152. Bec ause BDA est pas directionnelle spécifique, les deux connexions afférentes et efférentes peuvent être étiquetés. Par exemple, à la fois un champ de projection (antérograde) et les corps cellulaires (rétrograde) étiquette sont vus dans le thalamus (Figure 5b).
Figure 1: Les neurones infectés par PRV152 Exprimant eGFP (vert) et de la choline acétyltransférase immunopositives motoneurones (rouge) dans le (a) ambiguus (AMB) et (b) Hypoglossal (XII) Les noyaux de la souris Brainstem 94 heures après l'injection de PRV152 dans le cricothyroïdienne et latéral crico-aryténoïdienne laryngés muscles. RF = de formation réticulée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2:. Psuedorabies Virus (PRV152) infection dans le tronc d'un h souris 86 après l'injection PRV152 dans les muscles cricothyroïdienne et latéral crico-aryténoïdienne laryngés (a) neurones exprimant améliorées protéine fluorescente verte (blancs, couleurs inversées à partir d'images en fond clair originaux de coupes colorées ) à noyau ambigu (AMB) ipsilatérale au muscle injecté, la formation environnante réticulaire (RF) et le noyau solitaire (Sol), mais pas le noyau hypoglosse (XII). (B) Amb et interneurones réticulaires à plus fort grossissement (flèches rouges, corps cellulaires dans RF). Les barres d'échelle: 1 mm pour un; 100 um pour b. (Modifié à partir de Arriaga et al. 2012). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3:. Corticale pyramidale neurones exprimant eGFP (blanc; couleurs inversées à partir d'images en fond clair originaux de coupes colorées) dans la couche V corticale de M1 suite à l'injection de Psuedorabies Virus (PRV152) dans les muscles cricothyroïdienne et latéral crico-aryténoïdienne laryngés barres d'échelle: 1 mm pour panneau principal; 200 um pour encart. (Modifié à partir de Arriaga et al. 2012).
Figure 4:. M1 axones dans le tronc cérébral (a) de faible puissance d'une section de tronc coronaire contenant les motoneurones CTB-marqués dans Amb (brun) à partir d'une injection dans les muscles laryngés et des axones M1 (noir) à partir d'une injection de BDA dans M1. BDA axones marqués peuvent être vus dans la voie cortico-pyramidale (Pyr). Abréviations: AMB, ambiguus noyau; Pyr, pyramides; mRF, rformation eticular médial directement à l'ambassadeur; dRF, réticulaire formation dorsale à Amb. (B) Fort grossissement BDA étiqueté axone (noir, têtes de flèche) de M1 qui est en contact (flèche) sur un Amb neurones moteurs (CTB brunes). (C) M1 axones (noir) longeant (flèches) et près de (têtes de flèches) une grande Amb dendrites du neurone moteur qui irradie à partir Amb. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: au site d'injection et des connexions bidirectionnelles supplémentaires révélées par injections BDA pas vu avec transsynaptique PRV traçage. (a) amine dextran (BDA) biotinylés injections bilatérales (noir) dans le cortex moteur primaire (M1) ont révélé un champ dense terminal de projection (noir) dans le striatum sous-jacent. (b) Cortiaxones cal de M1 se terminent dans le noyau ventral latéral du thalamus (VL); Un amas de cellules thalamiques (brun foncé et blanc marqué par tête de flèche) ce projet à la région de chant M1 est également observée dans VL. La capsule interne (IC) a marqué axones en provenance du cortex. Les barres d'échelle: 1 mm pour un; 200 um pour b. (Modifié à partir de Arriaga et al. 2012). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il ya un certain nombre de questions qui doivent être prises en considération lors de la planification d'une expérience utilisant PRV152 4,21. Plus important encore, virus de la pseudorage est létale. Comme mentionné précédemment, les grands singes, dont les humains ne sont pas sensibles à l'infection, mais des soins appropriés doivent être exercés pour protéger les autres animaux. Les souris adultes survivent généralement de cinq à sept jours après l'inoculation avec la souche atténuée PRV152. Par conséquent, PRV152 est pas approprié pour les expériences qui nécessitent des temps de survie de plus d'une semaine. En outre, les animaux infectés présentent habituellement des signes de maladie pendant la période de survie, ce qui limite l'utilité de PRV152 expériences exigeant pour l'observation d'un comportement normal.
En outre, PRV152 déclenche une réponse immunitaire 22 cytotoxique. Étant donné que la replication et la transmission du virus sont titer- et 4 en fonction du temps, le modèle de neurones révélée par détection immunochimique de viral protéines ou le gène rapporteur eGFP vont changer au cours de la période de survie que les cellules progressent à travers les étapes de l'infection. Cinq jours après l'inoculation dans le muscle, 3 e ou 4 e neurones de commande peuvent être détectable, mais les neurones infectés premiers peuvent devenir apoptotique. Ainsi, le temps de survie optimale doit être déterminée expérimentalement pour chaque étude. Il est recommandé d'effectuer une analyse de séries chronologiques pour déterminer la progression de l'infection à travers un circuit et le meilleur point de temps pour le marquage des neurones spécifiques d'intérêt sans risque de cellule ou un animal mort.
Un des facteurs les plus importants qui affectent le succès de l'étiquetage avec PRV est le titre viral. Réductions marquées dans le nombre de cellules infectées ont été rapportés lors de la diminution du titre de PRV-Bartha de 1,4 x 10 5 à 7 x 10 4 pfu / ml 23. Par conséquent, nous recommandons d'utiliser des titres ci-dessus 1 x 10 7 pfu / ml et la tenue poolées virus à -80 ° C jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour maintenir son infectivité. Même lors de l'utilisation d'un titre élevé, il faut garder à l'esprit que tous les types de cellules ne peuvent pas être permissive à une infection. Par conséquent, les cellules identifiées par tracé de PRV peuvent ne pas être tout à fait représentatif des entrées à une cible infectée.
Le procédé décrit porte sur l'utilité de PRV pour analyser efférents centrales de régulation cibles périphériques, en particulier les muscles, par l'intermédiaire des circuits multi-synaptiques. Autres circuits neuronaux, tels que visuelle et autonome 24, sont bien adaptés à cette technique, car ils peuvent également être infectés par inoculation périphérique. Cependant, PRV peut être utilisé efficacement pour l'injection directe dans le système nerveux central lorsque certaines questions sont examinés minutieusement, comme nous le verrons en détail dans un examen préalable 3. Ces auteurs mentionnent que PRV-Bartha et des souches apparentées remplissent largement les arbres dendritiques des neurones infectés, faisant PRV152 bien adapté pour identifying afférences à dendrites distales. Cette propriété du virus rend la technique décrite particulièrement utile pour déduire une liste préliminaire des entrées à dendrites distales situées à l'extérieur de la région de corps de la cellule qui est généralement étudié avec traceurs classiques.
Lors du traçage des cibles périphériques, innervation sympathique devrait être considéré comme un confondre possible. Par conséquent, nous vous recommandons d'abord comparer les modèles d'étiquetage chez les animaux normaux et sympathectomisés pour déterminer si l'étiquetage PRV d'entrées sympathiques aura une incidence sur l'interprétation des résultats.
Signal dans les cellules infectées de eGFP exprimées par PRV152 peut imager directement par microscopie à fluorescence sans qu'il soit nécessaire pour l'immunohistochimie; cependant, ce signal est soumis à la photo-blanchiment et se dégrade au fil du temps. Le principal avantage de l'immunohistochimie combiné avec DAB coloration pour le traçage des voies est la nature permanente des produits de réaction. Bien qu'il is également possible d'utiliser des anticorps dirigés contre des protéines virales pour détecter les cellules infectées, les différents éléments viraux ne seront pas nécessairement co-localiser les uns aux autres ou 25 avec le signal eGFP. Par conséquent, nous recommandons d'utiliser des anticorps contre eGFP pour préserver le modèle de marquage observé par fluorescence.
Parce que toutes les afférences à une cellule infectée sont susceptibles de devenir des conduits pour le passage transsynaptique du virus, y compris ceux qui sont en contact dendrites distales, nous avons jugé important de sélectionner un traceur classique qui colore de manière fiable ces dendrites pour confirmation ultérieure de relais dans le circuit identifié. Nous avons sélectionné CTb à cette fin, et nous avons trouvé qu'il offre une bonne coloration des dendrites et fort contraste tant avec le neuropile environnant et les axones descendant du cortex moteur. Bien qu'il est possible d'inverser la coloration des axones colorées et des corps cellulaires (BDA = marron; CTb = noir), nous trouvons que le noir offre le meilleur contrast pour visualiser fines axones de gros calibre.
Un point important à garder à l'esprit lors de l'interprétation des modèles d'étiquetage BDA est que BDA10kDa est principalement utilisé comme un traceur antérograde, mais peut aussi marquer les cellules rétrograde (Figure 6) 6. En outre, BDA peut être transporté de façon rétrograde dans une cellule puis distribués le long d'une garantie de l'axone à un autre emplacement du terminal. Si ces collatérales axonales sont présents dans la même région que l'objectif de projection de la région injectée, alors il est difficile de les distinguer de marquage antérograde.
Une note technique final est que la seringue de métal 34 G Nanofil performant que d'une amende de calibre, tiré pipette en verre pour l'injection de traceurs dans les muscles, mais provoque trop de dégâts mécaniques lorsqu'il est utilisé pour les injections intracérébrales chez les petits animaux. Nous vous recommandons donc d'utiliser la seringue de métal pour les injections périphériques et la pipette de verre pour les injections centrales.
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Acknowledgments
Nous remercions le Dr Toshio Terashima de l'Université de Kobe, au Japon, pour l'enseignement de la technique de la chirurgie du larynx, et le Dr Lynn Enquist de l'Université de Princeton pour fournir PRV-Bartha. Recherche a été soutenue par le NIH prix pionnier DP1 OD000448 Erich D. Jarvis et un prix NSF Graduate Research Fellowship à Gustavo Arriaga. Les chiffres de travail précédente de manière appropriée crédités sont utilisés dans le cadre du libre accès PLoS ONE licence Creative Commons (CC-BY) en conformité avec les politiques éditoriales de la revue.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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