Abstract
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV) 1 kullanılarak beyinde kullanılmaktadır. PRV insanlar dahil olmak üzere büyük maymunları enfekte etmez, bu yüzden en yaygın küçük memeliler, özellikle kemirgenler üzerinde çalışmalarda kullanılmaktadır. Pseudorabies zorlanma PRV152 gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) raportör geni ifade ve sadece retrograd uzak enfeksiyon sitesinden 2,3 sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi ile fonksiyonel sinapsların geçer. Diğer PRV suşları farklı mikrobiyolojik özelliklere sahip ve her iki yönde (PRV-Becker ve PRV-Kaplan) 4,5 'de taşınabilir. Bu protokol PRV152 münhasıran ele alacağız. Böyle kas gibi, periferik yerinde virüsü teslim ederek, t içine virüsün girişini sınırlamak mümkündürnöronların belirli bir set üzerinden beyni. Beyin boyunca eGFP sinyalinin elde edilen şablon, bu durumda başlangıçta enfekte olan hücrelere bağlı nöronların giderir. Pseudorabies virüs transsinaptik izleme dağıtık yapısı zor bir tanımlanmış bir ağ içinde belirli bağlantı yorumlama yapar, biz kullanılarak tespit hücreleri arasındaki bağlantıları teyit için biyotinli dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak hassas ve güvenilir bir yöntem sunmak PRV152. Onlar uzak dendritler 6-11 olmak üzere hücresel süreçleri ortaya etkilidir çünkü peroksidaz ve DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ile BDA ve CTB immunokimyasal tespiti seçildi.
Introduction
Transsinaptik izleme multi-sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri düzenleyen santral eferent nöronları analiz etmek için kullanılan güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yaklaşım en yaygın, özellikle zayıflatılmış suş PRV-Bartha ilk kez 1961 yılında açıklanan domuz patojen pseudorabies virüsü (PRV), kullanılarak kemirgen beyinde kullanılmaktadır 12. Burada, belirli kasların motor kortikal temsilini belirlemek için bir protokol mevcut veya gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) raportör geninin 2 eksprese eden bir rekombinant pseudorabies virüs suşu (PRV152) ile kas grupları. Açıklanan yöntem çapraz sinaps fonksiyonel devre 3,4,13 içindeki diğer nöronlar bulaştırmak için bu bulaşıcı döl üreten nörotropik virüsler, davranışını patlatır. PRV-Bartha ile izojenik olan PRV152, sadece uzak enfeksiyon sitesinden 3,5 <dan retrograd sinaptik bağlantıların hiyerarşik dizisi boyunca sinaps haçlar/ sup>. Tam olarak enfeksiyonun periferal sitesi kontrol edilmesiyle motor nöronların spesifik bir alt kümesi üzerinden beyne virüs girişini sınırlamak mümkündür. Virüs sırayla bağlı nöronların zincirlerini bozar gibi, beynin boyunca eGFP sinyalinin ortaya çıkan desen sonra başlangıçta enfekte hücrelere bağlı olan nöronların ağı çözecektir.
Nöral izleme için virüs kullanılarak bir başka avantajı, enfekte olmuş hücreler içinde raportör proteininin (bu durumda EGFP) amplifikasyonu olup. Bu sinyal amplifikasyon bile seyrek projeksiyonlar algılanmasını sağlar duyarlılık düzeyi sağlar. Örneğin, bıyık kontrol yüz motor nöronlara bıyık motor korteks bir seyrek projeksiyon viral ifade yeşil flüoresan protein 14 ile sıçanlarda bulundu; önceki çalışmalar raportör gen amplifikasyonu 11,15 olmadan klasik izleyiciler kullanarak bu projeksiyonu bulamadılar. Ne yazık kiBirçok viral izleme vektörleri belirtilen çalışmada kullanılan gibi, bu şekilde, çok-sinaptik devreleri izlemek için kullanımlarını sınırlamaktadır sinaps geçmez.
Motor devresinde katılan hücrelerin ağını tanımlamak için farklı avantajlar sunarken, transsinaptik dağıtık yapısı PRV-152 zorlu devre içinde belirli bağlantıları yorumlama yapar ile izleme. Bu nedenle, biz biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) ve kolera toksini alt birimi b (CTB) kullanılarak çift etiketleme PRV-152 kullanılarak tespit devreler içinde belirli bağlantıları doğrulamak için basit bir yöntem mevcut. BDA ve CTB kombine kullanımının nöronlar 6-8,11 özel setler arasındaki bağlantıları izlemek için köklü bir yaklaşımdır. Birlikte kullanıldığında, bu iki izleyiciler iki renkli DAB (3, 3'-diaminobenzidin) prosedürü 16 kullanarak aynı bölümünde görülebilir. Yüksek molekül ağırlıklı BDA (BDA10kDa) bu protokol için seçildi bu y çünkünöron 6,7,9 ayrıntılı etiketleme ields. BDA10kDa diğer avantajları arasında aşağıdakiler bulunmaktadır: bu tercihan anterograd yönünde 6-8 taşınır; o iyontoforetik veya basınçlı enjeksiyon 6-8 teslim edilebilir; basit bir avidin biotinillenmemiş HRP (ABC) prosedürü 17 tarafından görüntülenmiştir olabilir; ve ışık veya elektron mikroskobu 6,7,18 tarafından görüntülenebilir. Distal dendritler 10,19 gibi hücresel süreçleri ortaya çıkartılmasında etkili olduğu için peroksidaz ve DAB ile CTB immünokimyasal algılama motor nöronlar retrograd etiketlenmesi için seçildi. Biz son zamanlarda farelerde vokal motorlu yolu belirlemek ve daha önce 20 eksik olarak kabul edildi laringeal motor nöronların, primer motor korteks gelen seyrek bir bağlantı ortaya çıkarmak için bu yaklaşımı kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri gözden geçirilecek ve Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Depolama Pseudorabies'e Virüs
- Biz 1 x 10 9 pfu / m titrede Princeton Üniversitesi'nden Dr. Lynn Enquist laboratuvar canlı virüsü (PRV152) edinin. Virüs üretmek için bir protokol 2 yayımlanmıştır.
- Uygun biyogüvenlik koşulları altında -80 ° C'de BSL-2 biyogüvenlik kabini ve mağaza içindeki tüp başına 20 ul virüs alikotu.
- Hemen enjekte önce PRV bir kısım çözülme.
Muscle içine Enjeksiyonlar 2. Cerrahi Hazırlık
- (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak.
- Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun.
- T hazırlayınsaç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile cerrahi siteyi dezenfekte tarafından aseptik tekniğe uygun diye cerrahi alan. Cerrahi alanları kapsayacak şekilde steril örtüler kullandığınızdan emin olun. Prosedürler boyunca steril tekniklere uymak için emin olun.
- Bir cilt kesi yapmak ve ilgi kas ortaya koymaktadır. Örneğin, ilk sternohyoid kas örten kısmını çıkarmak için gerekli olan krikotiroid gırtlak kası erişmek için.
- VetBond doku yapıştırıcısı ile herhangi transected kasları kapatın.
Muscle içine PRV 3. Enjeksiyon
- 34 G paslanmaz çelik iğne takın, taze çözülmüş PRV çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin.
- Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikroenjektör ucu çıkar doğrulayın. Bioharzard atık olarak sıvı atın.
- Bir stereotaksik microp kullanılmasıositioning cihazı dikkatlice ilgi kasına mikroenjektör ucu yerleştirin ve hafif şişlik görülebilir olana kadar yavaş yavaş kas doldurun. Kas ve birimin boyutuna bağlı olarak değişir enjeksiyon oranı enjekte edilecek. Örneğin, 4 nl / sn bir hızda 200 nl (1 ul toplam) beş enjeksiyonları krikotiroid kas doldurmak için aynı sitede 1 dakika arayla yapılmalıdır. Ilgi sonraki kas şırınga (bu durumda yanal krikoaritenoid) hareket ettirin ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. Sadece bir kez, her kas delinme.
- Beş dakika sonra mikroenjektör geri çekin.
- VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak fasya mola Seal.
- Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak yarayı kapatmak. Yerel institional hayvan kullanım yönergelerine, dikiş veya yara klipleri bağlı kullanılabilir.
- Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak ve y gereği olarak bakımkurumsal hayvan kullanımı kurallar.
- Deneysel olarak belirlenen yaşam süresinden sonra (bu durumda, 90 saat 2 etiket nd kortikal nöronların sipariş), pentobarbital doz aşımı ile hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transcardially serpmek.
- Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin.
- En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect.
EGFP 4. immunokimyasal Algılama
- Sürgülü mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin. Monte edilmiş bölümleri kullanılarak boyanması daha ince bölümleri, örneğin, 30 um için kullanılabilmektedir.
- Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür.
- PBS VECTASTAIN Elit Kit normal keçi serumu ile% 0.3 Tween 20 ihtiva eden 30 dakika boyunca bölümler halinde spesifik olmayan antijenleri engelle (kiti VE).
- RT de kiti VE den daha sonra keçi anti-tavşan ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır.
- Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
- RT de kiti VE den daha sonra ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca kısımlar PBS ile üç kez yıkanır.
- % 0.05 DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ve% 0.015 H2O 2 ihtiva eden, 10 dakika süre ile fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın ve fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir.
- Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100).
- İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel.
- Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler. DAB reaksiyon ürünü inside hücreler kahverengi görünmelidir. Sayısallaştırılmış görüntüleri ince süreçleri vurgulamak için ters bir renk olabilir.
PRV İzleme tarafından keşfedilen Beyin Bölgeler içine izleyicilerin Enjeksiyon için 5. Cerrahi Hazırlık
- (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg ksilazin) ketamin-ksilazin intramüsküler enjeksiyon yoluyla, genel anestezi neden ve izofloran kullanılarak uygun bir anestezik düzlemi korumak.
- Bir oftalmik merhem ile korneaları koruyun.
- Uygun bir stereotaksik çerçeve içinde kafası sabitleyin.
- Saç kesme ve alternatif Betadine scrubs ve% 70 alkol (3 döngü az) ile site dezenfekte ederek aseptik tekniğe uygun cerrahi siteyi hazırlayın.
- Bir kafa derisi kesi yapmak ve ilgi beyin bölgesi üzerindeki deriyi geri çekin.
- Uygun stereotaksik koordinatlarda küçük bir kraniotomi gerçekleştirin. Örneğin, PRV bir izlemeyi tespit laryngeally bağlanan motor korteks koordinatların erişkin fare 1,2 mm yanal ve bregmaya 0.2 mm rostral bulunmaktadır.
Beyin içine Biyotinilat Dekstran Aminler 6. Enjeksiyon
- Steril tuz 333 ul BDA 25 mg (10.000 MW) eritilmesi ile% 7.5 biyotinlenmiş dekstran aminler (BDA) hazırlayın.
- Planlanan enjeksiyonlar için yeterli BDA çözeltisi ile Nanoject II mikropipet sistemi yükleyin.
- Yavaşça ölü boşluğu temizlemek ve bu çözüm mikropipet ucu çıkmadan doğrulayın.
- Stereotaksik micropositioning cihazı kullanarak dikkatlice ilgi beyin bölgesi içine mikropipet ucu düşürmek ve yavaş yavaş BDA enjekte edin. Bölgenin büyüklüğüne bağlı olarak enjeksiyon oranı etiketlenmesine ayarlayın. Örneğin, 4.6 nl 12 enjeksiyonları dışında 0.2 mm (postero-kaudal yönde) yetişkin farelerde laryngeally bağlı motor korteks kapsayacak şekilde dört farklı konumlarda olması yaptırdı olmalıdır. Nihai enjeksiyon hacmi ilgi beyin bölgesinin boyutuna göre ayarlanabilir olmalıdırEtiket beyin dokusu sayesinde ve etiketli nöronların süreçler boyunca difüzyon ile enjeksiyon çekirdek yayılabilir akılda tutmak.
- Diş çimento kullanarak kraniotomi Seal ve VetBond doku yapıştırıcı kullanılarak kafa derisi yarayı kapatmak.
- Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum.
Kas içine kolera toksin alt-birimlerinin b 7. Enjeksiyon
- Steril tuzlu su, 100 ul CTB, 1 mg çözülmesiyle 1% kolera toksin alt-birimlerinin b (CTB) hazırlayın.
- Altı gün beyine BDA enjeksiyonundan sonra, kas içine enjeksiyon için PRV yukarıda tarif edildiği gibi, cerrahi hazırlama gerçekleştirin.
- 34 G paslanmaz çelik iğne takın, CTB çözeltisi ile 10 ul Nanofil mikroenjektör sistemini yükleyin ve özenle stereotaksik cihaz üzerinde monte edin.
- Daha önce de olduğu gibi ilgi kas (lar) microinjections gerçekleştirinPRV için kayıtsız kalamayız.
- Sternum yatma kadar hayvan izleyin ve analjezi, gıda, su sağlamak, ve kurumsal hayvan kullanımı kurallarına gereği önemsiyorum.
- Üç gün CTB enjeksiyonundan sonra, pentobarbital aşırı doz hayvan kurban ve 0.1 M PBS içinde% 4 formaldehit, ardından% 0.9 tuzlu su ile transkardiyal serpmek.
- Çıkarın ve 24 saat süreyle% 4 formaldehit beyin post-düzeltin.
- En az 48 saat süre ile% 30 sukroz ihtiva eden fosfat tamponu içinde beyin cryoprotect.
Aynı bölümlerde BDA ve CTB 8. Algılama
- Bir mikrotomda 40 mikron bölümleri kesmek ve 0.1M PBS içine yüzen bölümleri kaydedin.
- Işıktan koruyarak PBS içinde% 0.3, H2O 2 30 dakika boyunca bölümler söndürülür.
- Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
- Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 1 saat süre ile reaksiyona bunları, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın. 10 dakika boyunca fosfat tamponu içinde olan bölüm üç kez yıkayın, ve% 0.05 DAB (3, 3'-diaminobenzidin),% 0.015 H2O 2, ve% 0.05 nikel klorür içeren fosfat tampon maddesi içinde 8 dakika, pH 7.4 gelişir. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü siyah görünmelidir.
- VECTASTAIN Elit Kit normal tavşan serumu ile Tween 20% 0.3 içeren PBS içinde 30 dakika boyunca blok bölümleri.
- RT'de: inkübe keçi 2 saat boyunca anti-CTB (10,000 1) bölümleri engelledi.
- RT de kiti VE den daha sonra tavşan anti-keçi ikincil antikor, 1 saat boyunca inkübe, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın.
- Üreticinin talimatlarına göre kit VE ABC çözeltisi hazırlayın.
- Daha sonra oda sıcaklığında, ABC çözeltisi içinde 30 dakika boyunca, onları tepki, 5 dakika boyunca PBS içinde olan bölüm üç kez yıkayın.
- % 0.05 DAB (3, 3 ihtiva eden, 10 dakika boyunca kısımlar fosfat tamponu içinde üç kez yıkayın ve fosfat tamponu içinde 8 dakika, pH 7.4 için geliştirmek'-diaminobenzidine) ve% 0.015 H2O 2. Hücre içinde DAB reaksiyon ürünü kahverengi görünmelidir.
- Kademeli alkol serisi ile Dağı SuperFrost artı slaytlar üzerinde bölümleri ve kuruturlar (% 70,% 95,% 100 ve 5 dakika her biri için,% 100).
- İki ksilen yıkar (5 dk) ile bölümleri temizleyin ve Permount montaj ortamı ile slaytlar lamel.
- Görüntü mikroskop üzerine monte bölümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGFP için boyama kasına PRV152 enjekte sonra birincil motor nöronların yaklaşık 72 saat zayıf sinyali gösteren başlamalıdır. Çoğaltma ve virüsün transsinaptik taşıma titer- ve zamana bağlı 4 bulunmaktadır. Yaklaşık 90 saat enjeksiyonundan sonra, eGFP boyama 2. sırası ile enfekte hücrelerde sağlam sinyal ortaya çıkaracaktır. Daha uzun yaşam süreleri 3 rd ve yüksek mertebeden hücreleri ortaya çıkaracaktır ama sağkalım süreleri yaklaşık 5 gün aşılamadan sonra PRV ölümcül ile sınırlıdır.
Şekil 1a PRV152 laringeal motor nöronları, yedi laringeal kasların ikiye PRV152 enjeksiyonundan sonra 94 saat evler nukleus ambiguus içinde eGFP ifade ile enfekte nöronlar gösterir. Virüs enfekte kasları gibi hipoglosal nükleus gibi diğer phonatory motor nöron havuzları, innerve nöronların yoluyla beyne girilen Çünkü eGFP ifade etmeyen (Şekil 1b).
Şekil 3 periferik enjeksiyon sitesine eGFP kontralateral ifade motor kortekste enfekte premotor nöronlar gösterir. PRV152 çekirdeği ambiguus laringeal motor nöronları üzerinde çarpan çok sinaptik devreler yoluyla yayılır, çünkü olabilir be laringeal kas motor kortikal temsilini oluşturan hücrelerin sadece nüfus enfekte olduğunu varsaydık. (Ve ön beyin çoğu gösterilmemiştir) gösterilen bölümün geri kalanında eGFP sinyal eksikliği etiketleme özgüllüğünü göstermektedir.
Şekil 4 çekirdek ambiguus düzeyinde beyin sapındaki aksonlar BDA etiketli gösterir. Aksonlar retrograd laringeal kas içine enjeksiyonlar etiketli CTB-pozitif motor nöronlar ile temas. Aksonlar laringeal motor nöron varicosities ve dendrit yakın varsayılan Terminal boutons ve soma oluşturan gösterilmektedir. Elektron mikroskobu ya da elektrofizyoloji kullanarak ayrıntılı deneyler bu varisler sinaptik boutons temsil olup olmadığını belirlemek için gereklidir.
Şekil 5a PRV152 ile izleme retrograd transynaptic tarafından tanımlanan laryngeally bağlı motor korteks yerleştirilen BDA ikili enjeksiyon gösterir. Bec ause BDA hem afferent ve efferent bağlantıları etiketlenebilir, yönsel spesifik değildir. Örneğin, bir projeksiyon alanı (anterograd) ve hücre gövdeleri hem (retrograd) etiketi talamus görülür (Şekil 5b).
Şekil 1: PRV152 (a) ambiguus (Amb) 'de eGFP (yeşil) ve Kolin Asetiltransferaz immünopozitif motonöronlannda (kırmızı) ifade ile Enfekte Nöronlar ve (b) içine PRV152 Enjeksiyon sonrası Fare Beyin Sapı 94 saatlik Hipoglossal (XII) Çekirdekler krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal kasları. RF = retiküler formasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
g2.jpg "/>
Şekil 2:. Krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal Kaslar içine PRV152 enjekte sonra fare 86 saatlik Beyin Sapı içinde Psuedorabies Virüsü (PRV152) Enfeksiyon (a) Nöronlar geliştirilmiş ifade eden yeşil flüoresan protein (beyaz, lekeli bölümler orijinal aydınlık görüntüleri ters renkler ) enjekte kas nükleus ambiguus (Amb) ipsilateral, çevredeki retiküler formasyon (RF) ve yalnız çekirdek (Sol), fakat hipoglosal çekirdeği (XII). (B) Amb ve yüksek büyütmede retiküler internöron (kırmızı oklar, RF hücre gövdeleri). Ölçek çubukları: bir 1 mm; B 100 um. (Arriaga ve ark. 2012 den Modifiye). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Şekil 3:. Kortikal Piramidal nöronlar eGFP (beyaz, lekeli bölümler orijinal aydınlık görüntüleri ters renkler) ifade krikotiroid ve Yanal krikoaritenoid laringeal Kaslar içine Psuedorabies Virüsü (PRV152) Enjeksiyon aşağıdaki M1'in Kortikal Tabaka V Ölçek çubukları: 1 mm ana panel; Girintinin 200 um. (Arriaga ve ark dan Modifiye. 2012).
Şekil 4:. Beyin Sapı M1 Aksonlar (a) M1 içine BDA bir enjeksiyon laringeal kasları ve M1 akson (siyah) bir enjeksiyon Amb (kahverengi) CTB-etiketli motor nöronların içeren koronal beyin bölümünün Düşük güç. BDA etiketli aksonlar kortiko-piramit (Pir) parça görülebilir. Kısaltmalar: Amb, nukleus ambiguus; Pyr, piramitler; HÖH, reticular oluşumu doğrudan Amb medial; DRF, Amb için retiküler formasyon dorsal. (B) BDA Yüksek büyütme bir Amb motor nöronlar (CTB kahverengi) üzerine kontakt (ok) yapar M1 akson (siyah ok başları) etiketli. (C) M1 aksonlar (siyah) (oklar) boyunca çalışan ve yakın (ok başları) Amb dışarı yayar büyük Amb motor nöron dendrit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Enjeksiyon sitesi ve PRV transynaptic izleme görülmeyen BDA enjeksiyonları ortaya ek iki yönlü bağlantıları. (a) primer motor korteks (M1) bilateral biyotinlenmiş dekstran amin (BDA) enjeksiyonları (siyah) altta yatan striatum yoğun terminali projeksiyon alanı (siyah) saptandı. (b) CortiM1 cal aksonlar talamus (VL) ventral lateral nukleus içinde sona; Talamik hücreler bir küme (koyu kahverengi ve beyaz ok başkanı tarafından işaretlenmiş) geri M1 şarkı bölgeye bu proje aynı zamanda VL görülmektedir. Iç kapsül (IC) korteks gelen aksonlar etiketli etti. Ölçek çubukları: bir 1 mm; B 200 um. (Arriaga ve ark. 2012 den Modifiye). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PRV152 4,21 kullanarak bir deney planlanırken dikkate alınması gereken konulardan bir dizi vardır. Daha da önemlisi, pseudorabies virüs öldürücü. Daha önce belirtildiği gibi, insanlar da dahil olmak üzere büyük maymunlar, enfeksiyona duyarlı değildir, ancak uygun bakım diğer hayvanları korumak için dikkatli olunmalıdır. Yetişkin farelerde tipik haliyle beş ila yedi gün, zayıflatılmış PRV152 suşu ile aşılamadan sonra hayatta. Bu nedenle, PRV152 bir haftadan daha uzun bir hayatta kalma süresi gerektirir deneyler için uygun değildir. Ayrıca, enfekte hayvanların tipik böylece normal davranış gözlem gerektiren deneyler için PRV152 yararını sınırlayan, yaşam süresi boyunca hastalık belirtileri gösterir.
Buna ek olarak, PRV152 bir sitotoksik immün tepkisini 22 tetikler. Çoğaltma ve virüsün bulaşma zamana bağlı 4 titer- ve olduğundan, nöronların desen vira immünokimyasal tespiti ortayaHücreler enfeksiyon aşamaları yoluyla ilerleme olarak l proteinler veya eGFP raportör gen yaşam dönemi boyunca değişecektir. Beş gün kas aşılamadan sonra, 3. veya 4. sırası nöronlar tespit edilebilir, ancak ilk enfekte nöronlar apoptotik hale gelebilir. Bu nedenle en iyi hayatta kalma süresi her bir çalışma için deneysel olarak tespit edilmelidir. Bir devre boyunca enfeksiyonun ilerlemesi ve hücre veya hayvan ölümü riski olmadan ilgi belirli nöronlar etiketleme için en iyi zaman noktasını belirlemek için bir zaman serisi analizi gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
PRV ile etiketleme başarısını etkileyen en önemli faktörlerden biri, viral titre olduğunu. 1,4 x 05-7 Ekim x 10 4 pfu / ml 23'ten PRV-bartha titresini azaltılması enfekte olmuş hücrelerin sayısında belirgin azalmalar bildirilmiştir. Bu nedenle, biz 1 x 10 7 pfu / ml ve tutma aliquoted vi yukarıdaki kullanarak titreleri tavsiyerus -80 ° C onun enfeksiyon korumak için kullanılan transfer edilir. Yüksek titresi kullanırken bile, bir değil, tüm hücre tipleri enfeksiyon müsamahakar olabileceğini akılda tutmak gerekir. Bu nedenle, PRV izleme tarafından belirlenen hücreleri enfekte hedef girdilerin tamamıyla temsil olmayabilir.
Açıklanan yöntem çok sinaptik devreler aracılığıyla çevresel hedefleri, özellikle kasları, düzenleyen merkez eferent nöronları analiz PRV yararı üzerinde duruluyor. Onlar da periferik aşılama ile enfekte olabilir, çünkü böyle görsel ve 24 otonom olarak diğer nöral devreler, bu teknik için uygundur. Ancak, PRV ön incelemede 3 yoğun tartışıldığı gibi bazı konular dikkatle göz önüne alındığında merkezi sinir sistemine doğrudan enjeksiyon için etkin bir şekilde kullanılmaktadır. Bu yazarlar PRV-Bartha ve ilgili suşları yoğun identifyi için PRV152 de uygun hale enfekte nöronların dendritik milleri doldurmak sözng uzak dentritlere afferentler koldan. Virüsün bu özelliği genellikle konvansiyonel işaretleyicilerle incelenmiştir hücre gövdesi bölgenin dışında bulunan uzak dendritlerin girdi bir ön liste deducing için açıklanan teknik özellikle kullanışlı hale getirir.
Periferik hedeflerden izleme yaparken, sempatik innervasyon olası şaşırtmak düşünülmelidir. Bu nedenle, biz başlangıçta sempatik girdi PRV etiketleme sonuçlarının yorumlanmasını etkileyecek belirlemek için normal ve sympathectomized hayvanlarda etiketleme desenleri karşılaştırarak öneririz.
Immünohistokimya gerek kalmadan floresan mikroskobu kullanarak, doğrudan görüntülü olabilir PRV152 tarafından ifade eGFP virüslü hücrelerin sinyali; Bununla birlikte, bu sinyal foto-ağartma tabidir ve zamanla düşer. DAB yolu izleme için boyama ile kombine immünohistokimya ana avantajı reaksiyon ürünlerinin kalıcı doğasıdır. Bunun i ikenayrıca enfekte hücrelerin tespit etmek için viral proteinlere karşı antikorlar kullanmak mümkündür, farklı viral öğeler mutlaka birbirleri ile 25 ya da eGFP sinyali ile birlikte lokalize olmaz. Bu nedenle, biz floresan tarafından gözlemlenen etiketleme desen korumak için eGFP karşı antikorlar kullanmanızı öneririz.
Virüslü bir hücreye tüm afferentler uzak dendrit temas da dahil olmak üzere virüs transsinaptik geçişi için kanallar olma ihtimali olduğu için, biz önemli güvenilir tespit devredeki röle sonraki onay için böyle dendrit lekeleri geleneksel izleyici seçmek için düşündü. Bu amaçla CTB seçilmiş ve dendritler iyi boyama ve çevresindeki nöropilde ve motor korteksten inen aksonlarla hem güçlü kontrast sağlar bulundu. O lekeli akson ve hücre gövdeleri renklerini (BDA = kahverengi; CTB = siyah) tersine mümkün olsa da, biz siyah iyi co sağladığını bulmakntrast ince kalibre aksonlar görselleştirmek için.
BDA etiketleme desenleri yorumlanırken akılda tutulması gereken önemli bir nokta BDA10kDa ağırlıklı anterograd izleyici olarak kullanılır, aynı zamanda retrograd (Şekil 6) 6 hücreleri etiketlemek olabilir. Ayrıca, daha sonra başka bir terminal BDA sitesine bir akson teminat boyunca dağıtılmış bir hücreye retrograd nakledilebilir. Bu akson teminatlar enjekte bölgenin projeksiyon hedefle aynı bölgede varsa, o zaman anterograde etiketleme onları ayırt etmek zordur.
Son bir teknik not 34 G Nanofil metal şırınga, ince kalibre daha iyi performans kas içine enjekte izleyiciler için cam pipet çekti, ama küçük hayvanlarda intraserebral enjeksiyonlar için kullanıldığında çok mekanik hasara neden olmasıdır. Bu nedenle çevresel enjeksiyonlar için metal şırınga ve merkez enjeksiyonlar için cam pipet kullanmanızı öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz laringeal cerrahi tekniği öğretmek için, Kobe Üniversitesi, Japonya Dr. Toshio Terashima teşekkür ve PRV-Bartha temini için Princeton Üniversitesi'nden Dr. Lynn Enquist. Araştırma Erich Jarvis D. NIH öncü ödülü DP1 OD000448 ve Gustavo Arriaga bir NSF Lisansüstü Araştırma Bursu ödülü ile desteklenmiştir. Uygun kredili önceki çalışmalarından Rakamlar derginin editoryal politikalarına uygun PLoS ONE açık erişim Creative Commons lisansı (CC-BY) altında kullanılmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
