Abstract
Transsynaptic tracing har blitt et kraftig verktøy som brukes til å analysere sentrale efferents som regulerer perifere mål gjennom multi-synaptiske kretser. Denne tilnærmingen har vært mest brukt i stor utstrekning i hjernen ved anvendelse av svine patogen pseudorabies-virus (PRV) 1. PRV ikke infisere store apene, inkludert mennesker, så det er mest brukt i studier på små pattedyr, spesielt gnagere. Den pseudo belastningen PRV152 uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) reporter gen og bare krysser funksjonelle synapser retrograd gjennom den hierarkiske rekkefølgen av synaptiske forbindelser unna infeksjon området 2,3. Andre PRV-stammer har forskjellige mikrobiologiske egenskaper og kan transporteres i begge retninger (PRV-Becker og PRV-Kaplan) 4,5. Denne protokollen vil handle utelukkende med PRV152. Ved å levere viruset med en periferi området, for eksempel muskel, er det mulig å begrense adgang av viruset inn i than hjernen gjennom et bestemt sett av nevroner. Det resulterende mønster av EGFP signal i hele hjernen og deretter løser nevroner som er koblet til de opprinnelig infiserte celler. Som den distribuerte natur transsynaptic sporing med pseudo virus gjør vanskelig å tolke konkrete forbindelser innen en identifisert nettverk, presenterer vi en følsom og pålitelig metode ansette biotinylerte dekstran aminer (BDA) og koleratoksin subenhet b (CTB) for å bekrefte sammenhengen mellom cellene identifisert ved hjelp PRV152. Immunokjemisk påvisning av BDA og CTB med peroksydase og DAB (3, 3'-diaminobenzidin) ble valgt fordi de er effektive til å avsløre cellulære prosesser, inkludert distale dendritter 6-11.
Introduction
Transsynaptic tracing har blitt et kraftig verktøy som brukes til å analysere sentrale efferents som regulerer perifere mål gjennom multi-synaptiske kretser. Denne tilnærmingen har vært mest brukt i stor utstrekning i gnagerhjerne ved å anvende svine patogen pseudorabies-virus (PRV), særlig svekket stamme PRV-Bartha først beskrevet i 1961. 12 Her presenterer vi en protokoll for å identifisere motor cortical fremstilling av bestemte muskler eller muskelgrupper ved hjelp av en rekombinante pseudovirusstamme (PRV152) uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) reporter gen 2. Den beskrevne metode utnytter oppførselen til neurotropisk virus som produserer smittsomme avkom som krysser synapsen for å infisere andre neuroner i løpet av en funksjonell krets 3,4,13. PRV152, som er isogen med PRV-Bartha, krysser bare synapser retrograd gjennom den hierarkiske rekkefølge av synaptiske forbindelser bort fra infeksjon området 3,5 </ sup>. Ved nøyaktig å kontrollere periferinfeksjonsstedet er det mulig å begrense inntrengning av viruset inn i hjernen gjennom en bestemt undergruppe av motoriske nevroner. Som viruset infiserer sekvensielt kjeder av nerveceller som er koblet, vil det resulterende mønster av EGFP signal i hele hjernen og deretter løse nettverket av nerveceller som er koblet til de opprinnelig infiserte celler.
En ytterligere fordel ved å bruke viruset for neural oppsporing er forsterkningen av reporterprotein (EGFP i dette tilfellet) i infiserte celler. Denne signalforsterkning gir en grad av sensitivitet som gjør at påvisning av selv sparsom anslag. For eksempel ble en sparsom projeksjon fra vibrissa motor cortex til ansikts motoriske nevroner som kontrollerer kinnskjegg funnet i rotter ved hjelp av viralt uttrykt grønt fluorescerende protein 14; tidligere studier ikke klarte å finne dette anslaget ved hjelp av klassiske tracere uten reporter genamplifisering 11,15. Dessverre, Mange virale Tracing vektorer, slik som den som brukes i den anførte studien, ikke krysse synapser, som derved begrenser dets anvendelse for sporing multi-synaptiske kretser.
Mens presentere forskjellige fordeler for identifisering av nettverket av celler som deltar i en motorkretsen, den fordelte natur transsynaptic sporing med PRV-152 gjør tolkning av bestemte forbindelser innenfor kretsen vanskelig. Derfor presenterer vi en enkel metode for å validere spesifikke forbindelser innen kretser identifisert ved hjelp av PRV-152 ved å dobbeltmerking hjelp biotinylerte dekstran aminer (BDA) og koleratoksin subenhet b (CTB). Kombinert bruk av BDA og CTB er en veletablert metode for å spore sammenhenger mellom spesifikke sett av nevroner 6-8,11. Når den brukes sammen, kan disse to tracere bli visualisert i samme avsnitt ved hjelp av en to-farge DAB (3, 3 'diaminobenzidin) prosedyre 16. Høy molekylvekt BDA (BDA10kDa) ble valgt for denne protokollen fordi det yields detaljert merking av nevrale prosesser 6,7,9. Ytterligere fordeler av BDA10kDa inkluderer følgende: det er fortrinnsvis transporteres i antero retning 6-8; det kan bli levert av iontoforetiske eller press injeksjon 6-8; det kan bli visualisert ved en enkel avidin-biotinylert HRP (ABC) prosedyre 17; og det kan avbildes ved lys eller elektronmikroskopi 6,7,18. Immunokjemisk påvisning av CTB med peroksidase og DAB ble valgt for retrograd merking av motoneurons fordi det er effektiv på å avsløre cellulære prosesser, inkludert distal dendritter 10,19. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen til å identifisere vokal motor vei i mus, og for å avsløre en sparsom forbindelse fra primære motor cortex til strupehodet motoriske nevroner, som tidligere ble antatt å være fraværende 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer har blitt gjennomgått og godkjent av Duke University Institutional Animal Care & Bruk Committee.
1. Lagring Pseudo Virus
- Vi får levende virus (PRV152) fra laboratoriet til Dr. Lynn Enquist ved Princeton University i en titer på 1 x 10 9 PFU / m. Protokollen for å generere viruset har blitt publisert 2.
- Delmengde viruset på 20 mL per rør inne i en BSL-2 biosikkerhet skap og oppbevares ved -80 ° C under egnede biosikkerhet forhold.
- Tine en delmengde av PRV umiddelbart før injeksjon.
2. Kirurgisk Forberedelse til Injeksjoner i Muscle
- Fremkall generell anestesi ved intramuskulær injeksjon av ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) og opprettholde en passende bedøvelse flyet ved hjelp isofluorane.
- Beskytte hornhinner med en opthalmic salve.
- Forbered than kirurgiske området i henhold til aseptisk teknikk ved å klippe hår og desinfisering av kirurgiske området med vekslende skrubb av Betadine og 70% alkohol (minimum 3 sykluser). Sørg for å bruke sterile forheng for å dekke kirurgiske områder. Sørg for å overholde sterile teknikker gjennom prosedyrene.
- Gjør et snitt i huden og avsløre muskel av interesse. For eksempel for å få tilgang til cricothyroid laryngeal muskelen er det nødvendig å først fjerne den overliggende delen av sternohyoid muskel.
- Forsegle eventuelle transektert muskler med VetBond vevlimet.
3. Injeksjon av PRV i Muscle
- Legg den 10 pl NanoFil mikrosprøyte system med fersk tint PRV løsning, feste en 34 G nål av rustfritt stål, og nøye montere den på stereotaksisk enheten.
- Sakte fjerne døde plass og kontrollere at løsningen kommer ut av mikrosprøyte spissen. Kast væsken som bioharzard avfall.
- Ved hjelp av en stereotaksisk micropositioning enhet nøye plassere mikrosprøyte spissen inn i muskelen av interesse og sakte fylle muskelen til liten hevelse er synlig. Den injeksjonshastighet vil variere avhengig av størrelsen av muskelen og volumet som skal injiseres. For eksempel bør fem injeksjoner av 200 NL (1 ul totalt) med en hastighet på 4 nl / sek gjøres 1 min fra hverandre på samme sted for å fylle cricothyroid muskel. Bevege sprøyten til neste muskel av interesse (det laterale cricoarytenoid i dette tilfellet) og gjenta injeksjonsprosedyren. Bare punktere hver muskel en gang.
- Kjør inn mikrosprøyte etter fem minutter.
- Tett pause i fascia hjelp VetBond vevlimet.
- Etter alle injeksjoner har blitt fullført, lukker såret med VetBond vevlimet. Avhengig av de lokale institional dyr retningslinjer for bruk, sting eller sår klipp kan brukes.
- Overvåke dyret før sternal recumbency og gi smertelindring, mat, vann, og omsorg som kreves av yvåre institusjonelle retningslinjer dyr bruk.
- Etter at den eksperimentelt bestemte overlevelsestid (i dette tilfellet 90 timer for å merke 2. rekkefølge kortikale nevroner), ofrer dyret ved overdose pentobarbital og perfuse tran med 0,9% saltvann, etterfulgt av 4% formaldehyd i 0.1 M PBS.
- Ta ut og post-fikse hjernen i 4% formaldehyd i 24 timer.
- Cryoprotect hjernen i fosfatbuffer inneholdende 30% sukrose i minst 48 timer.
4. Immunokjemisk Påvisning av EGFP
- Kutt seksjoner på 40 mikrometer på en glidende mikrotom og lagre flytende seksjoner i 0,1 M PBS. Tynnere partier, for eksempel 30 um, kan anvendes ved farging monterte seksjoner.
- Slukke seksjoner i 30 minutter i 0,3% H 2 O 2 i PBS beskyttet mot lys.
- Blokkere ikke-spesifikke antigener i seksjonene i 30 minutter i PBS inneholdende 0,3% Tween 20 med normalt geiteserum fra Vectastain Elite Kit (VE kit).
- Vask seksjoner tre ganger i PBS i 5 min, og deretter inkuberes de i 1 time i geite-anti-kanin-sekundært antistoff fra VE settet ved RT.
- Klargjør ABC løsning fra VE kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vask seksjoner tre ganger i PBS i 5 min, og deretter reagere dem i 1 time i ABC-løsning fra VE settet ved RT.
- Vask seksjoner tre ganger i fosfatbuffer i 10 min, og utvikler i 8 minutter i fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidin), og 0,015% H 2 O 2.
- Mount seksjoner på Superfrost Plus lysbilder og tørke dem gjennom et gradert alkohol serie (70%, 95%, 100% og 100% i 5 min hver).
- Fjerne de delene gjennom to xylen vasker (5 min hver) og dekkglassene med Permount monteringsmedium.
- Bilde de monterte delene på et mikroskop. DAB reaksjonsprodukt inside cellene skal vises brun. Digitaliserte bilder kan være farge invertert å markere gode prosesser.
5. Kirurgisk Forberedelse til injeksjon av tracere i områder av hjernen oppdaget av PRV Tracing
- Fremkall generell anestesi ved intramuskulær injeksjon av ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin) og opprettholde en passende bedøvelse flyet ved hjelp isofluorane.
- Beskytte hornhinner med en opthalmic salve.
- Fest hodet på en hensiktsmessig stereotaksisk ramme.
- Forbered kirurgiske området i henhold til aseptisk teknikk ved å klippe hår og desinfisering av området med vekslende skrubb av Betadine og 70% alkohol (minimum 3 sykluser).
- Lag en skalp snitt og trekke huden over hjernen regionen av interesse.
- Utføre en liten kraniotomi på de hensiktsmessige stereotaksiske koordinater. For eksempel, koordinatene for laryngeally tilkoblet motor cortex identifisert av PRV sporing i enn voksen mus er 1,2 mm lateral og 0,2 mm rostralt å Bregma.
6. Injeksjon av Biotinylated Dextran Aminer inn Brain
- Forbered 7,5% biotinylerte dekstran aminer (BDA) ved oppløsning av 25 mg av BDA (10000 MW) i 333 mL sterilt saltvann.
- Laste Nanoject II mikropipette system med tilstrekkelig BDA løsning for de planlagte injeksjoner.
- Sakte fjerne døde plass og kontrollere at løsningen er spennende mikropipette spissen.
- Ved hjelp av en stereotaksisk mikroposisjonering enhet senk mikropipette spissen inn i hjernen regionen av interesse og sakte injisere BDA. Justere injeksjonshastighet, avhengig av størrelsen på området som skal merkes. For eksempel bør 12 injeksjoner av 4,6 nl gjorde å være på fire forskjellige steder 0,2 mm fra hverandre (rostro-caudal retning) for å dekke laryngeally tilkoblet motor cortex hos voksne mus. Den endelige Injeksjonsvolumet bør justeres i henhold til størrelsen av hjernen regionen av interesse, Husk at etiketten kan spre seg fra injeksjons kjernen ved diffusjon gjennom hjernevev og langs prosesser av merket nevroner.
- Tett kraniotomi bruker dental sement, og lukk hodebunnen såret hjelp VetBond vevlimet.
- Overvåke dyret før sternal recumbency og gi smertelindring, mat, vann, og omsorg som kreves av dine institusjonelle retningslinjer dyr bruk.
7. Injeksjon av koleratoksin subenhet B i Muscle
- Tilbered en% koleratoksin, subenhet B (CTB) ved oppløsning av 1 mg av CTB i 100 ul sterilt saltvann.
- Seks dager etter BDA injeksjon i hjernen, utfører den kirurgiske forberedelse som beskrevet ovenfor for PRV-injeksjoner i en muskel.
- Legg den 10 pl NanoFil mikrosprøyte system med CTB løsning, feste en 34 G nål av rustfritt stål, og nøye montere den på stereotaksisk enheten.
- Utfør microinjections inn i muskelen (e) av interesse som tidligere debeskrevet for PRV.
- Overvåke dyret før sternal recumbency og gi smertelindring, mat, vann, og omsorg som kreves av dine institusjonelle retningslinjer dyr bruk.
- Tre dager etter injeksjonen CTB, ofrer dyret ved overdose pentobarbital og perfuse tran med 0,9% saltvann, etterfulgt av 4% formaldehyd i 0.1 M PBS.
- Ta ut og post-fikse hjernen i 4% formaldehyd i 24 timer.
- Cryoprotect hjernen i fosfatbuffer inneholdende 30% sukrose i minst 48 timer.
8. Påvisning av BDA og CTB i samme avsnitt
- Kutt seksjoner på 40 mikrometer på en mikrotom og lagre flytende seksjoner i 0,1 M PBS.
- Slukke seksjoner i 30 minutter i 0,3% H 2 O 2 i PBS beskyttet mot lys.
- Klargjør ABC løsning fra VE kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vask seksjoner tre ganger i PBS i 5 min, og deretter reagere dem i 1 time i ABC-løsning ved romtemperatur. Vask seksjoner tre ganger i fosfatbuffer i 10 min, og utvikler i 8 minutter i fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidin), 0,015% H 2 O 2, og 0,05% nikkelklorid. DAB reaksjonsprodukt inne i cellene skal bli svart.
- Blokkseksjoner i 30 minutter i PBS inneholdende 0,3% Tween 20 med normalt kaninserum fra Vectastain Elite Kit.
- Inkuber blokkert seksjoner i 2 timer i geit anti-CTB (1: 10000) ved romtemperatur.
- Vask seksjoner tre ganger i PBS i 5 min, og deretter inkuberes de i 1 time i kanin-anti-geit-sekundært antistoff fra VE settet ved RT.
- Klargjør ABC løsning fra VE kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Vask seksjoner tre ganger i PBS i 5 min, og deretter reagere dem i 30 minutter i ABC-løsning ved romtemperatur.
- Vask seksjoner tre ganger i fosfatbuffer i 10 min, og utvikler i opptil 8 minutter i fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) og 0,015% H 2 O 2. DAB reaksjonsprodukt inne i cellene skal vises brun.
- Mount seksjoner på Superfrost Plus lysbilder og tørke dem gjennom et gradert alkohol serie (70%, 95%, 100% og 100% i 5 min hver).
- Fjerne de delene gjennom to xylen vasker (5 min hver) og dekkglassene med Permount monteringsmedium.
- Bilde de monterte delene på et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farging for EGFP bør begynne å vise svakt signal i primære motoriske nevroner cirka 72 timer etter injeksjon PRV152 i en muskel. Replikering og transsynaptic transport av virus er titer- og tidsavhengige fire. Omtrent 90 timer etter injeksjon, vil EGFP farging avsløre robust signal i 2 nd ordreinfiserte celler. Lengre overlevelsestider vil avsløre 3. og høyere ordens celler, men overlevelsestider er begrenset av dødelighet fra PRV ved ca. 5 dager etter inokulering.
Figur 1a viser nevroner infisert med PRV152 uttrykker EGFP i nucleus ambiguus, som huser strupe motoriske nevroner, 94 timer etter injeksjon av PRV152 inn to av de sju laryngeal muskler. Fordi viruset kom inn i hjernen via nerveceller som innerverer de infiserte muskler, andre phonatory motor neuron bassenger, som hypoglossal kjernen, ikke uttrykker EGFP (Figur 1b).
Figur 3 viser infiserte premotor nevroner i motor cortex uttrykker EGFP kontralateralt til den perifere injeksjonsstedet. Fordi PRV152 spres gjennom multi-synaptiske kretser som treffer på strupehodet motoriske nerveceller i nucleus ambiguus, kan det be antas at bare den populasjon av celler som utgjør motoren kortikale representasjon av laryngeal muskulatur ble infisert. Mangelen på EGFP signal i resten av snittet vist (og de fleste av forhjernen ikke vist) som demonstrerer spesifisiteten av merking.
Figur 4 viser BDA-merket aksoner i hjernestammen på nivå med kjernen ambiguus. Axoner ta kontakt med CTB-positive motoriske nevroner retrograd merket med injeksjoner i strupehodet muskler. Aksoner vises forming varicosities og antatte terminal boutons nærheten dendritter og soma av strupehodet motoriske nerveceller. Ytterligere eksperimenter ved hjelp av elektronmikroskopi eller elektrofysiologi er nødvendig for å avgjøre hvorvidt disse varicosities representerer synaptiske boutons.
Figur 5a viser en bilateral injeksjon av BDA plasseres i laryngeally koblet motor cortex som er identifisert av retrograd transynaptic sporing med PRV152. Bec ause BDA er ikke retnings bestemt, både afferente og efferente forbindelser kan merkes. For eksempel både en projeksjon felt (antero) og cellelegemer (retrograd) etiketten er sett i thalamus (figur 5b).
Figur 1: Nerveceller infisert med PRV152 uttrykke EGFP (grønn) og kolin acetyltransferase Immunopositive Motoneurons (rød) i (a) Ambiguus (Amb) og (b) hypoglossal (XII) Kjerner av musen hjernestammen 94 timer etter injeksjon av PRV152 inn Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Laryngeal muskler. RF = retikulære formasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
g2.jpg "/>
Figur 2:. Psuedorabies Virus (PRV152) infeksjon i hjernestammen av en mus 86 timer etter Injisering PRV152 inn i Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Laryngeal Muskler (a) Nerveceller uttrykker økede grønne fluorescerende protein (hvit, farger inverterte fra originale lysfelt bilder av fargete snitt ) i nucleus ambiguus (Amb) ipsilateral til den injiserte muskler, den omgivende formasjon retikulære (RF) og enslig kjernen (Sol), men ikke hypoglossus kjernen (XII). (B) Amb og retikulære interneuroner på høyere forstørrelse (røde piler, cellelegemer i RF). Skala barer: 1 mm for en; 100 mikrometer for b. (Modifisert fra Arriaga et al. 2012). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Figur 3:. Kortikal Pyramideformet Nerveceller uttrykker EGFP (hvit, farger inverterte fra originale lysfelt bilder av fargete snitt) i Kortikal Layer V av M1 følgende Injeksjon av Psuedorabies Virus (PRV152) inn i Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Laryngeal Muskler Scale barer: 1 mm for hovedpanelet; 200 mikrometer for nedfelling. (Modifisert fra Arriaga et al. 2012).
Figur 4:. M1 Axoner i hjernestammen (a) Lav effekt av en koronale hjernestammen delen inneholder CTB-merket motor nevroner i Amb (brun) fra en injeksjon i strupehodet muskler og M1 axoner (svart) fra en injeksjon av BDA i M1. BDA er merket axoner kan sees i Cortiço-pyramidal (Pyr) spor. Forkortelser: Amb, nucleus ambiguus; Pyr, pyramider; MRF, reticular formasjonen direkte medial til Amb; DRF, retikulære formasjonen rygg til Amb. (B) Høy forstørrelse av BDA merket axon (svart, piler) fra M1 som gjør kontakt (pil) på en Amb motor nevroner (CTB brune). (C) M1 axoner (svart) som kjører langs (piler) og i nærheten (piler) en stor Amb motor neuron dendrite som stråler ut fra Amb. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: injeksjonsstedet og ytterligere toveis forbindelser avslørt av BDA injeksjoner ikke sett med PRV transynaptic sporing. (a) Bilaterale biotinylerte dekstran amin (BDA) injeksjoner (svart) i primær motor cortex (M1) viste en tett terminal projeksjon feltet (svart) i det underliggende striatum. (b) Cortical axoner fra M1 avslutte i ventral lateral kjernen i thalamus (VL); En klynge av talamiske celler (mørk brun og merket med hvit pil hode) at prosjektet tilbake til M1 sang regionen er også observert i VL. Den interne kapsel (IC) har merket axoner fra hjernebarken. Skala barer: 1 mm for en; 200 mikrometer for b. (Modifisert fra Arriaga et al. 2012). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes en rekke forhold som må tas i betraktning når du planlegger et eksperiment ved hjelp PRV152 4,21. Viktigst er pseudo virus dødelig. Som nevnt tidligere, menneskeaper, inkludert mennesker er ikke mottakelig for smitte, men riktig behandling må utøves for å beskytte andre dyr. Voksne mus vanligvis overleve fem til sju dager etter vaksinasjon med svekket PRV152 belastning. Derfor er PRV152 ikke egnet for eksperimenter som krever overlevelses ganger lengre enn en uke. Videre infiserte dyr vanligvis vise tegn til sykdom under overlevelse perioden, og dermed begrense nytten av PRV152 for eksperimenter som krever observasjon av normal atferd.
I tillegg utløser PRV152 en cytotoksisk immunrespons 22. Fordi replikasjon og overføring av virus blir titer- og tidsavhengig 4, mønsteret av neuroner åpenbart ved immunokjemisk påvisning av viral proteiner eller EGFP reportergenet vil endre seg i løpet av overlevelsesperioden cellene går gjennom stadier av infeksjonen. Fem dager etter vaksinasjonen i muskel, kan 3. eller 4. ordens nevroner være synlig, men de tidligste infiserte nevroner kan bli apoptotisk. Dermed optimale overlevelsestiden må bestemmes eksperimentelt for hver undersøkelse. Det anbefales å utføre en tidsserieanalyse for å bestemme utviklingen av smitte gjennom en krets og det beste tidspunkt for merking av spesifikke nervecellene av interesse uten å risikere celle eller dyr død.
En av de viktigste faktorene som påvirker suksess for merking med PRV er den virale titer. Markert reduksjon i antallet infiserte celler er blitt rapportert når redusere titer av PRV-Bartha fra 1,4 x 10 5 for å 7 x 10 4 pfu / ml 23. Derfor anbefaler vi at du bruker titers ovenfor 1 x 10 7 PFU / ml og holde alikvoteres virus ved -80 ° C inntil den brukes til å opprettholde sin smittsomhet. Selv når du bruker en høy titer, bør man huske på at ikke alle celletyper kan være ettergivende for infeksjon. Derfor kan cellene identifisert med PRV-sporing ikke helt representativ for inngangene til en infisert mål.
Den beskrevne metoden fokuserer på nytten av PRV for å analysere sentrale efferents regulerer perifere mål, spesielt muskler, gjennom multi-synaptiske kretser. Andre nevrale kretser, slik som visuell og autonom 24, er godt egnet for denne teknikk fordi de kan også være infisert av perifere inokulering. Imidlertid kan PRV brukes effektivt for direkte injeksjon inn i sentralnervesystemet når noen problemer blir nøye vurdert, som diskutert omfattende i en forutgående gjennomgang 3. Disse forfattere nevner at PRV-Bartha og beslektede stammer omfattende fylle dendrittiske lysthus av infiserte nerveceller, noe som gjør PRV152 godt egnet for identifying afferenter til distale dendritter. Denne egenskapen av viruset gjør den beskrevne teknikken spesielt nyttig for å utlede en foreløpig liste over inngangssignaler til fjerntliggende dendritter ligger utenfor cellen kroppsregion som vanligvis studeres med vanlige sporstoffer.
Når sporing fra perifere mål, bør sympatisk innervasjon betraktes som en mulig forvirre. Derfor anbefaler vi først sammenligne merking mønstre i normale og sympathectomized dyr for å finne ut om PRV merking av sympatiske innganger vil påvirke tolkningen av resultatene.
Signal i infiserte celler fra EGFP uttrykt av PRV152 kan avbildes direkte ved hjelp av fluorescens mikroskopi uten behov for immunhistokjemi; imidlertid er dette signal i henhold til foto-bleking og brytes ned over tid. Den største fordelen med immunhistokjemi kombinert med DAB farging for oppsporing kanalen er permanent karakter av reaksjonsproduktene. Mens det ier også mulig å bruke antistoffer mot virale proteiner for å påvise infiserte celler, forskjellige virale elementene vil ikke nødvendigvis samtidig lokalisere med hverandre 25 eller med EGFP signal. Derfor anbefaler vi at du bruker antistoffer mot EGFP å bevare merkingen mønsteret observert av fluorescens.
Fordi alle afferenter til en infisert celle vil trolig bli kanaler for transsynaptic passering av virus, inkludert de som kontakter distal dendritter, vurderte vi det er viktig å velge en konvensjonell tracer som pålitelig flekker dendritter for etterfølgende bekreftelse av reléer i den identifiserte krets. Vi valgte CTB for dette formål, og funnet at det gir god farging av dendritter og sterk kontrast med både det omgivende neuropil og synkende axoner fra motor cortex. Selv om det er mulig å reversere fargen på farget axoner og cellelegemer (BDA = brun; CTB = svart), finner vi at svart gir den beste contrast for å visualisere fin kaliber aksoner.
Et viktig poeng å huske på når man skal tolke BDA merking mønstre er at BDA10kDa brukes hovedsakelig som en antero tracer men kan også merke celler retrograd (figur 6) 6. Videre kan BDA transporteres retrograd i en celle deretter fordelt langs et akson sikkerhet til en annen terminal nettstedet. Hvis disse axon sikkerheter er til stede i samme region som projeksjonen målet for den injiserte området, så er det vanskelig å skille dem fra antero merking.
En endelig teknisk notatet er at 34 G NanoFil metall sprøyte utfører bedre enn en fin kaliber, trakk glass pipette for å injisere sporstoffer i musklene, men fører til for mye mekanisk skade når det brukes for intracerebrale injeksjoner i små dyr. Vi anbefaler derfor å bruke metallet sprøyte for perifere injeksjoner og glass pipette for sentrale injeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Toshio Terashima av Kobe University, Japan, for å undervise i strupehodet kirurgi teknikk, og Dr. Lynn Enquist av Princeton University for å levere PRV-Bartha. Forskningen ble støttet av NIH pioner award DP1 OD000448 til Erich D. Jarvis og en NSF Graduate Research Fellowship award til Gustavo Arriaga. Tall fra riktig kreditert tidligere arbeid blir brukt under PLoS ONE åpen tilgang Creative Commons-lisens (CC-BY) i henhold til tidsskriftets redaksjonelle retningslinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
