Abstract
Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de hersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV) 1. PRV niet infecteert mensapen, waaronder de mens, dus wordt het meest gebruikt in studies op kleine zoogdieren, vooral knaagdieren. De pseudorabiës stam PRV152 drukt de verbeterde groen fluorescerend eiwit (eGFP) reportergen en slechts kruist functionele synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 2,3. Andere PRV stammen hebben verschillende microbiologische eigenschappen en kan in beide richtingen (PRV-Becker en PRV-Kaplan) 4,5 vervoerd worden. Dit protocol zal uitsluitend met PRV152. Door het leveren van het virus in een perifere locatie, zoals spieren, het mogelijk om de binnenkomst van het virus in t beperkenHij hersenen door middel van een specifieke set van neuronen. Het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen oplost dan de neuronen die zijn verbonden met de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen. Aangezien het gedistribueerde karakter van transsynaptische tracing met pseudorabiësvirus maakt interpreteren specifieke verbindingen binnen een geïdentificeerde netwerk moeilijk presenteren we een gevoelige en betrouwbare werkwijze gebruik gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB) voor het bevestigen van de verbindingen tussen cellen geïdentificeerd met behulp PRV152. Immunochemische detectie van BDA en CTB met peroxidase en DAB (3, 3'-diaminobenzidine) werd gekozen omdat ze effectief blootleggen cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 6-11.
Introduction
Transsynaptische tracing is uitgegroeid tot een krachtig instrument dat wordt gebruikt om de centrale afferenten dat perifere doelen door middel van multi-synaptische circuits regelen analyseren. Deze benadering is het meest uitgebreid gebruikt in de knaagdierhersenen door gebruikmaking van de varkens- pathogeen pseudorabies virus (PRV), vooral de verzwakte stam PRV-Bartha eerst beschreven in 1961 12. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van de motor corticale representatie van bepaalde spieren of spiergroepen met een recombinant pseudorabies virusstam (PRV152) die het versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) reportergen 2. De beschreven methode maakt gebruik van het gedrag van neurotrope virussen, die infectieus nageslacht dat kruis synapsen met andere neuronen besmetten binnen een functioneel circuit 3,4,13 produceren. PRV152, die isogeen met PRV-Bartha, maar kruist synapsen retrogradely door de hiërarchische volgorde van de synaptische verbindingen weg van de plaats van infectie 3,5 </ sup>. Door juist de perifere plaats van infectie beheersen is het mogelijk om de binnenkomst van het virus in de hersenen door middel van een specifieke subgroep van motorneuronen beperken. Omdat het virus infecteert achtereenvolgens ketens verbonden neuronen, zal het resulterende patroon van eGFP signaal over de hersenen dan het oplossen van de netwerk van neuronen die zijn aangesloten op de oorspronkelijk geïnfecteerde cellen.
Een bijkomend voordeel van het gebruik virus neurale tracing is de amplificatie van het reporter proteïne (eGFP in dit geval) in geïnfecteerde cellen. Deze signaalversterking biedt een niveau van gevoeligheid die de detectie van zelfs schaars projecties maakt. Bijvoorbeeld, een dun uitsteeksel van vibrissa motorische cortex het gezicht motorneuronen regelen van de whiskers werd gevonden in ratten middels viraal tot expressie green fluorescent protein 14; eerdere studies niet aan deze projectie te vinden met behulp van klassieke tracers zonder reporter genamplificatie 11,15. HelaasVeel tracing virale vectoren, zoals die gebruikt in de aangehaalde onderzoek niet synapsen kruisen, waardoor het gebruik ervan voor het opsporen multi-synaptische circuits beperken.
Terwijl de presentatie duidelijke voordelen voor het identificeren van het netwerk van cellen die deelnemen in een motorcircuit, de gedistribueerde aard van transsynaptische tracing met PRV-152 maakt het interpreteren van specifieke verbindingen binnen het circuit moeilijk. Daarom presenteren we een eenvoudige methode voor het valideren van specifieke verbindingen binnen circuits geïdentificeerd met PRV-152 door double-labeling gebruikt gebiotinyleerd dextran amines (BDA) en choleratoxine subunit B (CTB). Het gecombineerde gebruik van BDA en CTB is een gevestigde aanpak voor het opsporen van verbanden tussen specifieke sets van neuronen 6-8,11. Wanneer samen gebruikt worden, kunnen deze twee tracers worden gevisualiseerd in dezelfde sectie in twee kleuren DAB (3, 3'-diaminobenzidine) 16 procedure. Hoog molecuulgewicht BDA (BDA10kDa) werd gekozen voor dit protocol omdat yields gedetailleerde etikettering van neuronale processen 6,7,9. Bijkomende voordelen van BDA10kDa zijn de volgende: het is bij voorkeur in de richting anterograde 6-8 vervoerd; Het kan worden geleverd door iontoforetische of druk injectie 6-8; kan worden gevisualiseerd door een eenvoudige avidine-gebiotinyleerde HRP (ABC) procedure 17; en kan worden afgebeeld door licht- of elektronenmicroscopie 6,7,18. Immunochemische detectie van CTB met peroxidase en DAB werd gekozen retrograde labeling van motoneuronen omdat het effectief is bij het openbaren cellulaire processen, waaronder distale dendrieten 10,19. We hebben onlangs gebruikt deze benadering van de vocale motor route bij muizen te identificeren en een dunne aansluiting van de primaire motorische cortex aan de larynx motorische neuronen, die eerder werd aangenomen afwezig 20 te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures zijn beoordeeld en door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1. opslaan pseudorabiësvirus
- We krijgen levend virus (PRV152) uit het laboratorium van Dr. Lynn Enquist aan Princeton University met een titer van 1 x 10 9 pfu / m. Het protocol om het virus te genereren is gepubliceerd 2.
- Aliquot het virus bij 20 pi per buis in een BSL-2 bioveiligheid kast en bewaar bij -80 ° C onder de juiste omstandigheden bioveiligheid.
- Dooi een hoeveelheid van PRV onmiddellijk alvorens te injecteren.
2. Chirurgische Voorbereiding voor injecties in de spier
- Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane.
- Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf.
- Bereid thij chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de chirurgische site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli). Zorg ervoor dat steriele doeken gebruiken om chirurgische gebieden te dekken. Zorg ervoor om zich te houden aan steriele technieken gedurende de procedures.
- Maak een huidincisie en onthullen de spieren van belang. Bijvoorbeeld, om de cricothyroideus larynx spier moet eerst het bovenliggende gedeelte van de sternohyoid spier te verwijderen.
- Verzegelen elke doorsneden spieren Vetbond weefsel lijm.
3. Injectie van PRV in Spier
- Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met vers ontdooide PRV oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat.
- Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing verlaat het micro-tip. Gooi vloeistof als bioharzard afval.
- Met een stereotaxische microfositioning apparaat zorgvuldig plaats de micro-tip in de spier van de rente en langzaam vult de spier tot lichte zwelling zichtbaar is. De injectiesnelheid zal variëren afhankelijk van de grootte van de spier en volume te injecteren. Zo moet vijf injecties met 200 nl (1 pl totaal) met een snelheid van 4 nl / sec 1 min uit elkaar worden gemaakt op dezelfde plaats op de cricothyroideus spier vullen. Verplaats de spuit naar de volgende spieren plaats (de laterale cricoarytenoid in dit geval) en herhaal de injectieprocedure. Slechts doorboren eenmaal elke spier.
- Trek de micro na vijf minuten.
- Verzegeling van de breuk in de fascia met Vetbond weefsel lijm.
- Nadat alle injecties zijn voltooid, sluit de wond met behulp Vetbond weefsel lijm. Afhankelijk van uw lokale instellingsgeneeskunde richtlijnen het gebruik van dieren, hechtingen of wond clips kunnen worden gebruikt.
- Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door yonze institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.
- Na de experimenteel bepaalde overlevingstijd (in dit geval 90 hr labelen 2e orde corticale neuronen), offer het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardially met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS.
- Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur.
- Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur.
4. Immunochemische Detectie van eGFP
- Snijd secties 40 urn op een glijdende microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS. Dunnere, bijvoorbeeld 30 urn, kan worden gebruikt bij het kleuren gemonteerde profielen.
- Quench secties 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS beschermd tegen licht.
- Blokkeer niet-specifieke antigenen in de secties 30 min in PBS met 0,3% Tween 20 bij normale geit serum van de Vectastain Elite kit (VE kit).
- Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij geiten anti-konijn secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur.
- Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
- Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing uit de kit VE bij KT.
- Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) en 0,015% H 2 O 2.
- Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk).
- Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia's met Permount montage medium.
- Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop. De DAB reactieproduct inside de cellen moeten bruine verschijnen. Gedigitaliseerde beelden kunnen kleuren omgekeerd om fijne processen markeren.
5. Chirurgische Voorbereiding voor Injectie van Tracers in hersengebieden Ontdekt door PRV Tracing
- Induceren algemene anesthesie door intramusculaire injectie van ketamine-xylazine (100 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) en een geschikt verdovingsmiddel vlak houden via isofluorane.
- Bescherm de hoornvliezen van een oftalmische zalf.
- Zet de kop in een passende stereotaxisch frame.
- Bereid de chirurgische plaats volgens de aseptische techniek door trimmen haren en ontsmetten van de site met afwisselende scrubs van Betadine en 70% alcohol (minimaal 3 cycli).
- Maak een hoofdhuid incisie en trekken de huid over de hersenen regio van belang.
- Voer een kleine craniotomie op het juiste stereotaxische coördinaten. Bijvoorbeeld, de coördinaten laryngeally verbonden motorische cortex die door PRV traceren in eenn volwassen muis zijn 1,2 mm lateraal en 0,2 mm rostraal Bregma.
6. Injectie van Gebiotinyleerde Dextraan Amines in Brain
- Bereid 7,5% gebiotinyleerd dextran amines (BDA) door het oplossen van 25 mg BDA (MW 10.000) in 333 pl steriele zoutoplossing.
- Laad de Nanoject II micropipet met voldoende BDA oplossing voor de geplande injecties.
- Langzaam duidelijk de dode ruimte en controleer of de oplossing is het verlaten van de micropipet tip.
- Met behulp van een stereotaxische micropositionering apparaat zorgvuldig verlagen van de micropipet tip in de hersenen regio van belang en langzaam te injecteren BDA. Pas de injectiesnelheid afhankelijk van de grootte van het gebied te worden aangebracht. Zo dient 12 injecties van 4,6 nl made zijn op vier verschillende plaatsen 0,2 mm van elkaar (rostro-caudaal) aan de laryngeally verbonden motorische cortex bij volwassen muizen dekken. Het uiteindelijke injectievolume worden aangepast aan de grootte van het hersengebied plaats, Rekening houdend met dat label uit de injectie kern door diffusie door hersenweefsel en langs de processen van gelabelde neuronen kunnen verspreiden.
- Dicht de craniotomie met tandheelkundige cement, en sluit de hoofdhuid wond met behulp Vetbond weefsel lijm.
- Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.
7. Injectie van Cholera toxinesubeenheid b in Spier
- Bereid 1% choleratoxine subunit B (CTB) door het oplossen van 1 mg van CTB in 100 ul steriele zoutoplossing.
- Zes dagen na BDA injectie in de hersenen, voeren de chirurgische preparaat zoals hierboven beschreven voor PRV injectie in een spier.
- Laad de 10 ul injectiespuit Nanofil systeem met CTB-oplossing, voeg een 34 G roestvrijstalen naald, en zorgvuldig monteren op de stereotaxische apparaat.
- Voer de micro-injecties in de spier (s) van belang, zoals eerder debeschreven voor PRV.
- Bewaak het dier tot borstligging en zorgen voor pijnstilling, voedsel, water, en de zorg die nodig zijn door de institutionele richtlijnen het gebruik van dieren.
- Drie dagen na de injectie CTB, offeren het dier door een overdosis pentobarbital en perfuseren transcardiaal met 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 4% formaldehyde in 0,1 M PBS.
- Verwijder na bevestig de hersenen in 4% formaldehyde gedurende 24 uur.
- Cryoprotect de hersenen in fosfaatbuffer bevattende 30% sucrose gedurende tenminste 48 uur.
8. Detectie van BDA en CTB in dezelfde secties
- Snijd secties 40 urn op een microtoom en sla drijvende secties in 0,1 M PBS.
- Quench secties 30 min in 0,3% H 2 O 2 in PBS beschermd tegen licht.
- Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
- Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze 1 uur in ABC oplossing bij kamertemperatuur. Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen van 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine), 0,015% H 2 O 2 en 0,05% nikkelchloride. De DAB reactie product in de cellen moeten zwart verschijnen.
- Blokdelen gedurende 30 minuten in PBS met 0,3% Tween 20 met normaal konijnenserum van de Vectastain Elite Kit.
- Incubate geblokkeerd secties voor 2 uur bij geiten anti-CTB (1: 10.000) bij kamertemperatuur.
- Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, daarna incubeer ze gedurende 1 uur bij konijnen anti-geit secundair antilichaam uit de VE set bij kamertemperatuur.
- Bereid de ABC-oplossing uit de VE kit volgens instructies van de fabrikant.
- Was secties driemaal in PBS gedurende 5 min, dan reageren ze gedurende 30 min in ABC oplossing bij kamertemperatuur.
- Was secties driemaal in fosfaatbuffer gedurende 10 min, en ontwikkelen tot 8 min in fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) en 0,015% H 2 O 2. De DAB reactie product in de cellen moeten bruine verschijnen.
- Mount secties in SuperFrost Plus objectglaasjes en dehydrateren ze via een gegradeerde reeks alcohol (70%, 95%, 100% en 100% gedurende 5 min elk).
- Duidelijk de secties via twee xyleen wast (5 min elk) en dekglaasje de dia's met Permount montage medium.
- Afbeelding de gemonteerde secties op een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kleuring voor eGFP moet beginnen tonen zwak signaal in primaire motorische neuronen ongeveer 72 uur na het injecteren PRV152 in de spier. De replicatie en transsynaptische transport van het virus zijn titer- en tijdsafhankelijke 4. Ongeveer 90 uur na de injectie zal eGFP vlekken sterk signaal in 2 e orde geïnfecteerde cellen te onthullen. Langere overleving tijden zullen 3 e en hogere orde cellen onthullen maar overleving tijden worden beperkt door de dodelijkheid van PRV op ongeveer 5 dagen na de inenting.
Figuur 1a toont neuronen geïnfecteerd met PRV152 EGFP in nucleus ambiguus, waarbij de larynx motorneuronen, 94 uur na injectie van PRV152 in twee van de zeven larynx spieren herbergt. Omdat het virus het brein door middel van zenuwcellen die de geïnfecteerde spieren, andere phonatory motorneuron pools, zoals hypoglossi kern innerveren, niet tot expressie eGFP (Figuur 1b).
Figuur 3 toont geïnfecteerde premotor neuronen in de motorische cortex EGFP contralateraal van de perifere injectie. Omdat PRV152 verspreidt zich door middel van multi-synaptische circuits afbreuk te doen aan laryngale motorische neuronen in de nucleus ambiguus, kan het be aangenomen dat alleen de bevolking van cellen die de motor corticale representatie van de larynx spieren samen waren besmet. Het gebrek aan eGFP signaal in de rest van de sectie getoond (en de meeste voorhersenen niet getoond) toont de specificiteit van de labeling.
Figuur 4 toont BDA-gemerkte axons van de hersenstam ter hoogte van de nucleus ambiguus. De axonen contact maken met de CTB-positieve motorische neuronen retrogradely gelabeld door injecties in larynx spieren. Axonen worden getoond vormen varicosities en vermeende terminal boutons de buurt van de dendrieten en soma van laryngeale motorische neuronen. Verdere experimenten met elektronenmicroscopie of elektrofysiologie moeten bepalen of deze varicosities vertegenwoordigen synaptische boutons.
Figuur 5a toont een bilaterale injectie van BDA geplaatst in de laryngeally verbonden motorische cortex zoals geïdentificeerd door retrograde transynaptic traceren met PRV152. Bec ause BDA is niet directioneel specifieke, zowel afferente en efferente verbindingen kunnen worden geëtiketteerd. Bijvoorbeeld zowel een projectie veld (anterograde) en mobiele lichamen (retrograde) label worden gezien in de thalamus (figuur 5b).
Figuur 1: Neuronen geïnfecteerd met PRV152 Uiting eGFP (groen) en cholineacetyltransferase immunopositieve motoneuronen (rood) in de (a) Ambiguus (Amb) en (b) Hypoglossal (XII) kernen van de muis hersenstam 94 uur na injectie van PRV152 in de cricothyroid en Laterale Cricoarytenoid Laryngeal Spieren. RF = reticulaire formatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
g2.jpg "/>
Figuur 2:. Psuedorabies virus (PRV152) Infectie in de hersenstam van een muis 86 uur na injecteren PRV152 in de cricothyroideus en laterale Cricoarytenoid laryngaalspieren (a) Neuronen expressie versterkt groen fluorescent proteïne (wit; kleuren omgekeerd van originele helderveld beelden van gekleurde coupes ) in nucleus ambiguus (Amb) ipsilateraal aan de geïnjecteerde spier, de omringende reticulaire formatie (RF) en de solitaire kern (Sol), maar niet hypoglossi nucleus (XII). (B) Amb en reticular interneuronen bij hogere vergroting (rode pijlen, cellichamen in RF). Schaalbalken: 1 mm voor; 100 micrometer voor b. (Gewijzigd van Arriaga et al., 2012). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Corticale Piramidale Neuronen Uiting eGFP (wit; kleuren omgekeerde van originele helderveld beelden van gekleurd secties) in corticale laag V van M1 na Injectie van Psuedorabies Virus (PRV152) in de cricothyroideus en laterale Cricoarytenoid Laryngeal Spieren Schaal bars: 1 mm voor hoofdpaneel; 200 urn voor inzet. (Gewijzigd van Arriaga et al., 2012).
Figuur 4:. M1 axonen in de hersenstam (a) Lage macht van een coronale hersenstam sectie met CTB-gelabelde motorische neuronen in Amb (bruin) van een injectie in de larynx spieren en M1 axonen (zwart) van een injectie van BDA in de M1. BDA gelabelde axonen te zien in de cortico-piramidale (Pyr) nummer. Afkortingen: Amb, kern ambiguus; Pyr, piramides; MRF, reticular formatie direct mediaal van Amb; DRF, reticulaire formatie dorsale te Amb. (B) Hoge vergroting van BDA label axon (zwart, pijlpunten) van M1 dat contact maakt (pijl) op een Amb motorische neuronen (CTB bruin). (C) M1 axonen (zwart) langs (pijlen) en in de buurt (pijlpunten) een groot Amb motor neuron dendriet dat straalt uit Amb. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: op de injectieplaats en aanvullende bidirectionele verbindingen geopenbaard door BDA injecties niet gezien met PRV transynaptic tracing. (a) Bilaterale gebiotinyleerd dextran amine (BDA) injecties (zwart) in de primaire motorische cortex (M1) bleek een dichte terminal projectie veld (zwart) in de onderliggende striatum. (b) Cortical axonen van M1 eindigen in de ventrale laterale kern van de thalamus (VL); Een cluster van thalamische cellen (donker bruin en gemarkeerd met witte pijl hoofd) dat project terug naar de M1 zingen regio is ook waargenomen in VL. De interne capsule (IC) heeft het label axonen afkomstig van de cortex. Schaalbalken: 1 mm voor; 200 pm voor b. (Gewijzigd van Arriaga et al., 2012). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal zaken die in overweging moeten worden genomen bij de planning van een experiment met PRV152 4,21. Belangrijker, pseudorabiësvirus is dodelijk. Zoals eerder vermeld, mensapen, waaronder mensen zijn niet gevoelig voor infectie, maar juiste zorg moet worden uitgeoefend om andere dieren te beschermen. Volwassen muizen overleven doorgaans 5-7 dagen na inoculatie met de verzwakte stam PRV152. Daarom PRV152 niet geschikt voor experimenten die overleving langer dan één week nodig. Bovendien besmette dieren meestal weer tekenen van ziekte tijdens de overleving periode, waardoor het beperken van het nut van PRV152 voor experimenten waarbij observatie van normaal gedrag.
Bovendien PRV152 triggert een cytotoxische immuunrespons 22. Omdat de replicatie en transmissie van virus titer- en tijdsafhankelijke 4, het patroon van neuronen onthuld door immunochemische detectie van viral eiwitten of eGFP rapporteergen verandert in de loop van de overleving periode cellen vooruitgang door stadia van de infectie. Vijf dagen na inoculatie in de spieren, kunnen 3e of 4e orde neuronen waarneembaar zijn, maar de eerste geïnfecteerde neuronen apoptotisch geworden. Dus de optimale overlevingstijd moet proefondervindelijk worden bepaald voor elke studie. Het wordt aanbevolen om een tijdreeksanalyse om de progressie van de infectie via een circuit en de beste tijd voor het labelen van de specifieke neuronen plaats zonder risico of -dier dood vast te voeren.
Een van de belangrijkste factoren die het succes van labeling met PRV is de virale titer. Gemarkeerd vermindering van het aantal geïnfecteerde cellen werden gerapporteerd als het verminderen van de titer van PRV-Bartha van 1,4 x 10 5 om 7 x 4 10 pfu / ml 23. Daarom raden wij u aan titers boven 1 x 10 7 pfu / ml en het houden gealiquoteerde virus bij -80 ° C totdat het wordt gebruikt om de infectiviteit behouden. Zelfs bij gebruik van een hoge titer, moet men in gedachten houden dat niet alle soorten cellen tolerant voor een infectie kunnen zijn. Derhalve kunnen de cellen die door PRV tracing niet volledig representatief voor het kanaal van een geïnfecteerd doelwit.
De beschreven werkwijze is gericht op het nut van PRV voor het analyseren centrale efferente reguleren perifere targets specifiek spieren, door middel van multi-synaptische circuits. Andere neurale circuits, zoals visuele en autonome 24, zijn geschikt voor deze techniek, omdat ze ook geïnfecteerd met perifere inoculatie. Echter, PRV effectief worden gebruikt voor directe injectie in het centrale zenuwstelsel als enkele problemen zorgvuldig overwogen, zoals uitgebreid besproken in een voorafgaand 3. Die auteurs vermelden dat PRV-Bartha en verwante stammen uitvoerig vul de dendritische priëlen van geïnfecteerde neuronen, waardoor PRV152 geschikt voor identifying afferenten distale dendrieten. Deze eigenschap van het virus maakt de beschreven techniek bijzonder bruikbaar voor het afleiden van een eerste lijst met ingangen distale dendrieten buiten de cel lichaamsgebied bevindt die kenmerkend wordt bestudeerd met gebruikelijke tracers.
Bij het opsporen van perifere doelen, moet sympathieke innervatie worden beschouwd als een mogelijke verwarren. Daarom raden we in eerste instantie een vergelijking etikettering patronen in normale en sympathectomized dieren om te bepalen of PRV etikettering van sympathische input van invloed interpretatie van de resultaten.
Signaal in geïnfecteerde cellen van eGFP door PRV152 expressie kan direct worden afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie zonder dat immunohistochemie; Maar dit signaal is onderworpen aan foto-bleken en na verloop van tijd. Het belangrijkste voordeel van immunohistochemie gecombineerd met DAB kleuring tract tracing is de permanente aard van de reactieproducten. Hoewel het iis ook mogelijk om antilichamen tegen virale eiwitten gebruikt om geïnfecteerde cellen te detecteren, verschillende virale elementen niet noodzakelijkerwijs samen lokaliseren met elkaar 25 of met eGFP signaal. Daarom raden wij met behulp van antilichamen tegen eGFP de etikettering patroon waargenomen door fluorescentie behouden.
Omdat alle afferenten om een geïnfecteerde cel waarschijnlijk leidingen voor transsynaptische passage van het virus, met inbegrip van die distale dendrieten contact te worden, vonden wij het belangrijk om een conventionele tracer die betrouwbaar vlekken zoals dendrieten voor latere bevestiging van de relais in de geïdentificeerde circuit te selecteren. We kozen CTB hiervoor, en vond dat het biedt goede kleuring van de dendrieten en sterk contrast met zowel het omliggende neuropil en de afdalende axonen van de motorische cortex. Hoewel het mogelijk is de kleur van de gekleurde axonen en cellichamen (BDA = brown; CTB = zwart) achteruit, vinden we dat zwarte levert de beste contrast voor het visualiseren van fijn kaliber axonen.
Een belangrijk punt in gedachten te houden bij de interpretatie van BDA etikettering patronen is dat BDA10kDa vooral wordt gebruikt als een anterograde tracer, maar kan ook een label cellen retrogradely (figuur 6) 6. Bovendien kan BDA retrogradely worden vervoerd in een cel dan verdeeld langs een axon onderpand naar een andere terminal plaats. Als die axon zekerheden aanwezig in dezelfde regio als de projectie doelwit van de geïnjecteerde gebied zijn, dan is het moeilijk om ze te onderscheiden van anterograde etikettering.
Een laatste technische opmerking is dat de 34 G Nanofil metalen spuit beter presteert dan een boete kaliber, getrokken glazen pipet voor het injecteren van tracers in de spieren, maar veroorzaakt te veel mechanische schade wanneer gebruikt voor intracerebrale injecties in kleine dieren. Daarom adviseren wij het gebruik van de metalen spuit voor perifere injecties en de glazen pipet voor de centrale injecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Toshio Terashima van Kobe University, Japan, voor het onderwijzen van de larynx operatietechniek, en Dr. Lynn Enquist van Princeton University voor het leveren van PRV-Bartha. Onderzoek werd gesteund door NIH pionier award DP1 OD000448 aan Erich D. Jarvis en een NSF Graduate Research Fellowship award naar Gustavo Arriaga. Uit cijfers van de juiste gecrediteerd eerdere werk worden gebruikt onder de PLoS ONE open toegang Creative Commons licentie (CC-BY) in overeenstemming met de redactionele beleid van het tijdschrift.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
