Abstract
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) 1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección 2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3'-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 6-11.
Introduction
Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) gen informador 2. El método descrito explota el comportamiento de los virus neurotróficos, que producen progenie infecciosa que las sinapsis transversales para infectar otras neuronas dentro de un circuito funcional 3,4,13. PRV152, que es isogénica con PRV-Bartha, solamente cruza la sinapsis retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia del sitio de la infección 3,5 </ sup>. Al controlar con precisión el sitio periférico de la infección es posible limitar la entrada del virus en el cerebro a través de un subconjunto específico de las neuronas motoras. A medida que el virus infecta secuencialmente cadenas de neuronas conectadas, el patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro entonces resolver la red de neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente.
Una ventaja adicional del uso de virus para el rastreo neural es la amplificación de la proteína indicadora (eGFP en este caso) dentro de las células infectadas. Esta amplificación de la señal proporciona un nivel de sensibilidad que permite la detección de proyecciones incluso dispersos. Por ejemplo, una proyección de escasa corteza motora Vibrisas a las neuronas motoras faciales que controlan los bigotes se encontró en ratas utilizando la proteína fluorescente verde de forma viral expresado 14; estudios previos no lograron encontrar esta proyección utilizando trazadores clásicos sin amplificación del gen reportero 11,15. Desafortunadamente, Muchos vectores virales de rastreo, como el usado en el estudio citado, no se cruzan las sinapsis, lo que limita su uso para el rastreo de circuitos multi-sinápticas.
Al presentar distintas ventajas para la identificación de la red de las células que participan en un circuito del motor, la naturaleza distribuida de transináptico rastreo con PRV-152 hace que la interpretación de conexiones específicas dentro del circuito difícil. Por lo tanto, se presenta un método simple para la validación de las conexiones específicas dentro de los circuitos identificados con PRV-152 haciendo doble etiquetado utilizando aminas biotina dextrano (BDA) y la subunidad toxina del cólera b (CTB). El uso combinado de BDA y CTb es un enfoque bien establecido para el rastreo de conexiones entre conjuntos específicos de neuronas 6-8,11. Cuando se usan juntos, estos dos marcadores se pueden visualizar en la misma sección usando un DAB de dos colores (3, 3 '-Diaminobencidina) Procedimiento 16. De alto peso molecular BDA (BDA10kDa) fue seleccionado para este protocolo, ya que yields etiquetado detallado de los procesos neuronales 6,7,9. Las ventajas adicionales de BDA10kDa incluyen los siguientes: se transporta preferentemente en la dirección anterógrada 6-8; puede ser entregado por iontoforesis o la inyección de presión 6-8; se puede visualizar con un simple HRP avidina-biotina (ABC) procedimiento 17; y puede ser fotografiado por la luz o microscopía electrónica 6,7,18. Detección inmunoquímica de CTb con peroxidasa y DAB fue elegido para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras, ya que es eficaz en revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 10,19. Recientemente hemos utilizado este enfoque para identificar la vía motora vocal en ratones y revelar una conexión escasa de la corteza motora primaria de las neuronas motoras de la laringe, que fue asumido previamente a estar ausente 20.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos con animales han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional Animal Care & Use la Universidad de Duke.
1. Almacenamiento Pseudorrabia Virus
- Obtenemos virus vivo (PRV152) desde el laboratorio del Dr. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton en un título de 1 x 10 9 pfu / m. El protocolo para generar el virus ha sido publicada 2.
- Alícuota el virus en 20 l por tubo dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2 y se almacena a -80 ° C bajo condiciones de bioseguridad apropiadas.
- Descongelar una alícuota del PRV inmediatamente antes de la inyección.
2. Preparación quirúrgica para inyección en el músculo
- Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano.
- Proteja las córneas con una pomada oftálmica.
- Preparar tél sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y la desinfección de la zona quirúrgica con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). Asegúrese de utilizar paños estériles para cubrir las áreas quirúrgicas. Asegúrese de que se adhieran a las técnicas estériles durante todo el procedimiento.
- Hacer una incisión en la piel y revelar el músculo de su interés. Por ejemplo, para acceder al músculo de laringe cricotiroidea es necesario quitar primero la porción suprayacente del músculo esternohioideo.
- Selle cualquier músculos seccionados con Vetbond adhesivo tisular.
3. La inyección de PRV en el músculo
- Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución PRV recién descongelado, adjunte una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico.
- Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución sale de la punta microjeringa. Deseche el fluido como residuos bioharzard.
- El uso de un microP estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente la punta microjeringa en el músculo de interés y llenar lentamente el músculo hasta hinchazón leve es visible. La velocidad de inyección variará dependiendo del tamaño del músculo y el volumen a inyectar. Por ejemplo, cinco inyecciones de 200 nl (1 l total) a una velocidad de 4 nl / seg deben hacerse 1 min aparte en el mismo sitio para llenar el músculo cricotiroideo. Mover la jeringa a la siguiente músculo de interés (la cricoaritenoideo lateral en este caso) y repetir el procedimiento de inyección. Sólo perforar cada músculo una vez.
- Retraer la microjeringa después de cinco minutos.
- Selle la rotura en la fascia usando Vetbond adhesivo tisular.
- Después de todas las inyecciones se han completado, cierre la herida utilizando Vetbond adhesivo tisular. Dependiendo de sus directrices locales institional uso de animales, suturas o grapas de la herida puede ser utilizado.
- Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por ynuestras pautas de uso de los animales institucionales.
- Después de que el tiempo de supervivencia determinada experimentalmente (en este caso, 90 hr para etiquetar 2 nd orden neuronas corticales), sacrifica el animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS.
- Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas.
- Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h.
4. Detección inmunoquímica de eGFP
- Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo de deslizamiento y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. Secciones más delgadas, por ejemplo 30 m, se pueden usar cuando la tinción de secciones montadas.
- Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz.
- Bloquear antígenos no específicos en las secciones durante 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de cabra normal desde el Kit VECTASTAIN Elite (VE kit).
- Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en cabra anti-conejo anticuerpo secundario del kit VE a TA.
- Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC de la VE kit a TA.
- Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'-diaminobencidina) y 0,015% de H 2 O 2.
- Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno).
- Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount.
- Imagen de las secciones montadas en un microscopio. El producto de reacción DAB inside las células deben aparecer marrón. Las imágenes digitalizadas pueden ser de color invertido para poner de relieve los procesos finos.
5. Preparación quirúrgica para inyección de trazadores en regiones del cerebro descubiertas por PRV Tracing
- Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano.
- Proteja las córneas con una pomada oftálmica.
- Fijar la cabeza en un marco estereotáxico apropiado.
- Preparar el sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y desinfectar el sitio con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos).
- Haga una incisión del cuero cabelludo y retraer la piel sobre la región del cerebro de interés.
- Realizar una pequeña craneotomía en las coordenadas estereotáxicas apropiados. Por ejemplo, las coordenadas de la corteza motor conectado laryngeally identificado por el rastreo en un PRVn ratón adulto son 1,2 mm lateral y de 0,2 mm rostral a Bregma.
6. La inyección de dextrano biotinilados aminas en el cerebro
- Preparar 7,5% Aminas dextrano biotina (BDA) por disolución de 25 mg de BDA (10.000 MW) en 333 l de solución salina estéril.
- Cargue el sistema de micropipeta Nanoject II con suficiente solución BDA para las inyecciones previstas.
- Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución está saliendo de la punta de la micropipeta.
- El uso de un dispositivo de microposicionamiento estereotáxica bajar con cuidado la punta de la micropipeta en la región del cerebro de interés y lentamente inyecte BDA. Ajustar la velocidad de inyección en función del tamaño de la región a ser etiquetado. Por ejemplo, 12 inyecciones de 4,6 nl deben ser hechas en cuatro lugares diferentes de 0,2 mm de distancia (dirección rostro-caudal) para cubrir el córtex motor conectado laryngeally en ratones adultos. El volumen de inyección final debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la región del cerebro de interés, Teniendo en cuenta que la etiqueta puede extenderse desde el núcleo de inyección por difusión a través tejido cerebral y a lo largo de los procesos de neuronas marcadas.
- Selle la craneotomía con cemento dental, y cerrar la herida del cuero cabelludo utilizando Vetbond adhesivo tisular.
- Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal.
7. La inyección de la toxina del cólera subunidad b en el músculo
- Preparar 1% cólera subunidad B de la toxina (CTB) disolviendo 1 mg de CTb en 100 l de solución salina estéril.
- Seis días después de la inyección de BDA en el cerebro, realizar la preparación quirúrgica como se describió anteriormente para las inyecciones de PRV en el músculo.
- Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución CTB, adjuntar una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico.
- Realizar las microinyecciones en el músculo (s) de interés como anteriormente desdescrito por PRV.
- Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal.
- Tres días después de la inyección CTB, sacrificar al animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS.
- Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas.
- Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h.
8. Detección de BDA y CTb en las mismas secciones
- Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS.
- Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz.
- Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC a TA. Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'-diaminobencidina), 0,015% de H 2 O 2, y 0,05% de cloruro de níquel. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer negro.
- Secciones de bloque de 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de conejo normal desde el Kit VECTASTAIN Elite.
- Incubar bloqueado secciones durante 2 horas en cabra anti-CTB (1: 10.000) a TA.
- Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en conejo anti-cabra de anticuerpo secundario de la VE kit a TA.
- Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 30 min en una solución de ABC a TA.
- Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar para un máximo de 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3'diaminobenzidine) y 0,015% de H 2 O 2. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer marrón.
- Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno).
- Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount.
- Imagen de las secciones montadas en un microscopio.
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Representative Results
La tinción para eGFP debería comenzar a mostrar señales débiles en las neuronas motoras primarias, aproximadamente 72 horas después de la inyección de PRV152 en el músculo. La replicación y transporte transináptico del virus son titer- y dependiente del tiempo 4. Aproximadamente 90 horas después de la inyección, la tinción eGFP revelará potente señal en las células infectadas de orden 2 nd. Tiempos de supervivencia más largos revelarán 3º y células de orden superior, pero los tiempos de supervivencia están limitados por la letalidad de PRV en aproximadamente 5 días después de la inoculación.
La Figura 1a muestra las neuronas infectadas con PRV152 expresan EGFP en núcleo ambiguo, que alberga las neuronas motoras de la laringe, 94 hr después de la inyección de PRV152 en dos de los siete músculos de la laringe. Debido a que el virus entró en el cerebro a través de las neuronas que inervan los músculos infectados, otros conjuntos de neuronas motoras fonatorias, tales como el núcleo hipogloso, no expresan eGFP (Figura 1b).
La Figura 3 muestra las neuronas infectadas premotora en la corteza motora contralateral que expresan eGFP al sitio de inyección periférica. Debido PRV152 propaga a través de los circuitos multi-sinápticas que inciden en las neuronas motoras de la laringe en núcleo ambiguo, que puede be supone que sólo la población de células que componen la representación cortical motora de la musculatura laríngea estaban infectados. La falta de señal de eGFP en el resto de la sección mostrada (y la mayoría del cerebro anterior no se muestra) demuestra la especificidad de la etiqueta.
La Figura 4 muestra los axones BDA marcado con en el tronco cerebral a nivel de núcleo ambiguo. Los axones hacen contacto con las neuronas motoras CTb-positivos retrogradely etiquetados por medio de inyecciones en los músculos laríngeos. Los axones se muestran la formación de varices y boutons terminales putativos cerca de las dendritas y el soma de las neuronas motoras de la laringe. Se requieren más experimentos usando microscopía electrónica o electrofisiología para determinar si estas varices representan botones sinápticos.
La figura 5a muestra una inyección bilateral de BDA colocado en la corteza motor conectado laryngeally como identificado por el rastreo con transináptica retrógrada PRV152. Bec ause BDA no es direccionalmente específica, ambas conexiones aferentes y eferentes pueden ser etiquetados. Por ejemplo, tanto un campo de proyección (anterógrada) y cuerpos celulares (retrógrada) etiqueta se ven en el tálamo (Figura 5b).
Figura 1: Las neuronas infectadas con PRV152 expresan EGFP (verde) y de colina acetiltransferasa Immunopositive motoneuronas (rojo) en el (a) Ambiguus (Amb) y (b) hipogloso (XII) Núcleos del ratón del tronco cerebral 94 horas después de la inyección de PRV152 en el cricotiroidea y lateral cricoaritenoide laríngeos músculos. RF = formación reticular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2:. Psuedorabies Virus (PRV152) Infección en el tronco cerebral de una hora ratón 86 después de inyectar PRV152 en los músculos cricotiroidea y lateral cricoaritenoide laringe (a) las neuronas que expresan mejorado verdes proteína fluorescente (blanco, colores invertidos a partir de imágenes de campo claro originales de secciones teñidas ) en el núcleo ambiguus (Amb) ipsilateral al músculo inyectado, la formación que rodea reticular (RF) y el núcleo solitario (Sol), pero no el núcleo del hipogloso (XII). (B) Amb y interneuronas reticulares a mayor aumento (flechas rojas, cuerpos celulares en RF). Barras de escala: 1 mm para una; 100 micras para b. (Modificado de Arriaga et al. 2012). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3:. Cortical piramidal neuronas que expresan eGFP (blanco, los colores invertidos a partir de imágenes de campo claro originales de secciones teñidas) en cortical capa V de M1 tras la inyección de Psuedorabies Virus (PRV152) en los músculos cricotiroidea y lateral cricoaritenoide laríngeos barras de escala: 1 mm para panel principal; 200 micras de inserción. (Modificado de Arriaga et al. 2012).
Figura 4:. M1 axones en el tronco cerebral (a) bajo el poder de una sección del tronco cerebral coronal que contiene las neuronas motoras marcadas-CTB en Amb (marrón) de una inyección en los músculos laríngeos y axones M1 (negro) de una inyección de BDA en M1. BDA axones marcados se pueden ver en la pista cortico-piramidal (Pyr). Abreviaturas: Amb, núcleo ambiguo; Pyr, las pirámides; MRF, rformación eticular medial directamente a Amb; dRF, reticular dorsal formación al Emb. (B) de alta magnificación de BDA etiquetado axón (negro, puntas de flecha) de M1 que hace contacto (flecha) en un Amb neuronas motoras (CTB marrones). (C) M1 axones (negro) a lo largo (flechas) y cerca (flecha cabezas) una gran Amb dendritas de las neuronas motoras que se irradia hacia fuera del Emb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: el lugar de inyección y las conexiones bidireccionales adicionales revelados por inyecciones BDA no vistos con trazado transináptica PRV. (a) amina dextrano (BDA) inyecciones bilaterales biotinilados (negro) en la corteza motora primaria (M1) revelaron un campo denso terminal de proyección (negro) en el cuerpo estriado subyacente. (b) CortiCal axones de M1 terminan en el núcleo lateral ventral del tálamo (VL); Un grupo de células del tálamo (marrón oscuro y marcado por la blanca cabeza de flecha) que el proyecto de nuevo a la región de canto M1 también se observa en VL. La cápsula interna (IC) ha etiquetado axones procedentes de la corteza. Barras de escala: 1 mm para una; 200 micras para b. (Modificado de Arriaga et al. 2012). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado para los experimentos que requieren tiempos de supervivencia de más de una semana. Además, los animales infectados suelen mostrar signos de enfermedad durante el período de supervivencia, lo que limita la utilidad de PRV152 para experimentos que requieren la observación del comportamiento normal.
Además, PRV152 desencadena una respuesta inmune citotóxica 22. Debido a que la replicación y la transmisión de virus se titer- y dependiente del tiempo 4, el patrón de neuronas revelada por detección inmunoquímica de viraproteínas L o el gen reportero eGFP van a cambiar en el transcurso del período de supervivencia como células progresan a través de etapas de la infección. Cinco días después de la inoculación en el músculo, 3er o 4 º orden neuronas pueden ser detectables, pero las neuronas tempranas infectados pueden llegar a ser apoptóticas. Así, el tiempo de supervivencia óptima debe determinarse experimentalmente para cada estudio. Se recomienda realizar un análisis de series de tiempo para determinar la progresión de la infección a través de un circuito y el mejor punto de tiempo para el etiquetado de las neuronas específicas de interés sin correr el riesgo de muerte celular o animal.
Uno de los factores más importantes que afectan el éxito de etiquetado con PRV es el título viral. Reducciones marcadas en el número de células infectadas se han reportado al disminuir el título de PRV-Bartha de 1,4 × 10 5 a 7 x 10 4 pfu / ml 23. Por lo tanto, se recomienda utilizar los títulos por encima de 1 x 10 7 pfu / ml y mantenimiento de alícuotas virus a -80 ° C hasta que se utiliza para mantener su infectividad. Incluso cuando se utiliza un título elevado, se debe tener en cuenta que no todos los tipos de células pueden ser permisiva para la infección. Por lo tanto, las células identificadas por el trazado PRV no pueden ser completamente representativo de las entradas a un objetivo infectada.
El método descrito se centra en la utilidad de PRV para analizar eferentes centrales que regulan objetivos periféricos, específicamente los músculos, a través de circuitos multi-sinápticas. Otros circuitos neuronales, tales como visual y autonómica 24, son muy adecuados para esta técnica, ya que también pueden ser infectados por inoculación periférica. Sin embargo, PRV se puede utilizar con eficacia para la inyección directa en el sistema nervioso central cuando algunas cuestiones se consideran cuidadosamente, como se discutió ampliamente en una revisión previa 3. Estos autores mencionan que PRV-Bartha y cepas relacionadas llenan ampliamente las glorietas dendríticas de neuronas infectadas, por lo que PRV152 muy adecuado para identifying aferentes a las dendritas distales. Esta propiedad del virus hace que la técnica descrita particularmente útil para deducir una lista preliminar de las entradas a las dendritas distales ubicados fuera de la zona del cuerpo celular que se estudian normalmente con trazadores convencionales.
Cuando el rastreo de objetivos periféricos, inervación simpática debe considerarse un posible factor de confusión. Por lo tanto, se recomienda comparar inicialmente patrones de etiquetado en los animales normales y sympathectomized para determinar si PRV etiquetado de entradas simpáticas afectará la interpretación de los resultados.
La señal en las células infectadas de eGFP expresadas por PRV152 puede ser fotografiado directamente mediante microscopía de fluorescencia sin la necesidad de inmunohistoquímica; sin embargo, esta señal está sujeta a la foto-blanqueo y degrada con el tiempo. La principal ventaja de inmunohistoquímica combinado con DAB tinción de trazado las vías es la naturaleza permanente de los productos de reacción. Si bien iTambién es posible usar anticuerpos contra las proteínas virales para detectar células infectadas, diferentes elementos virales no necesariamente co-localizar uno con el otro 25 o con la señal de eGFP. Por lo tanto, se recomienda el uso de anticuerpos contra eGFP para preservar el patrón de marcación observada por fluorescencia.
Debido a que todos los aferentes a una célula infectada son propensos a convertirse en conductos para el paso transináptico de virus, incluyendo aquellos que en contacto con las dendritas distales, consideramos que es importante seleccionar un trazador convencional que tiñe de forma fiable estas dendritas para su posterior confirmación de relés en el circuito identificado. Seleccionamos CTb para este propósito, y encontramos que proporciona buena tinción de las dendritas y fuerte contraste tanto con el neuropil circundante y los axones descendentes desde la corteza motora. A pesar de que es posible revertir la coloración de los axones y cuerpos celulares teñidos (BDA = marrón; CTb = negro), encontramos que el negro proporciona la mejor contrast para la visualización de los axones de calibre fino.
Un punto importante a tener en cuenta en la interpretación de los patrones de etiquetado BDA es que BDA10kDa se utiliza principalmente como un trazador anterógrada, pero también puede marcar células retrógrada (Figura 6) 6. Por otra parte, BDA puede ser transportada retrógradamente en una célula luego se distribuye a lo largo de un axón colateral a otro sitio de terminal. Si esos axones colaterales están presentes en la misma región que el objetivo de proyección de la región inyectada, entonces es difícil para distinguirlos de etiquetado anterógrada.
Una nota técnica final es que la jeringa de metal 34 G Nanofil funciona mejor que un buen calibre, sacó pipeta de vidrio para la inyección de trazadores en los músculos, pero hace demasiado daño mecánico cuando se utilizan para inyecciones intracerebrales en pequeños animales. Por lo tanto, recomendamos el uso de la jeringa de metal para inyecciones periféricas y la pipeta de vidrio para las inyecciones de centrales.
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Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Toshio Terashima de la Universidad de Kobe, Japón, para la enseñanza de la técnica de la cirugía laríngea, y el Dr. Lynn Enquist de la Universidad de Princeton para el suministro de PRV-Bartha. La investigación fue apoyada por Pioneer Award NIH DP1 OD000448 a Erich D. Jarvis y un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Las cifras del anterior trabajo debidamente acreditado se utilizan bajo la PLoS ONE acceso abierto licencias Creative Commons (CC-BY), de conformidad con las políticas editoriales de la revista.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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