Transsynaptisk Sporing fra Perifere Mål med pseudorabiesvirus Efterfulgt af kolera toksin og Biotinyleret Dextran Aminer Dobbelt Mærkning

Abstract

Transsynaptisk sporing er blevet et magtfuldt værktøj, der anvendes til at analysere centrale efferents der regulerer perifere mål gennem multi-synaptiske kredsløb. Denne fremgangsmåde har været mest udbredt anvendt i hjernen ved anvendelse af svinepatogen pseudorabiesvirus (PRV) ^1. PRV ikke inficerer store aber, herunder mennesker, så det er mest almindeligt anvendt i undersøgelser på små pattedyr, især gnavere. Pseudorabies-stamme PRV152 udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) reportergenet og kun krydser funktionelle synapser retrogradt gennem hierarkisk rækkefølge af synaptiske forbindelser væk fra infektionsstedet ^2,3. Andre PRV stammer har distinkte mikrobiologiske egenskaber, og kan transporteres i begge retninger (PRV-Becker og PRV-Kaplan) ^4,5. Denne protokol vil udelukkende beskæftige sig med PRV152. Ved at levere viruset ved en perifer sted, såsom muskel, er det muligt at begrænse indtrængen af ​​virus i tHan hjernen gennem et bestemt sæt af neuroner. Den resulterende mønster af eGFP signal i hele hjernen derefter løser de neuroner, der er forbundet med de oprindeligt inficerede celler. Da den distribuerede karakter af transsynaptisk sporing med pseudorabiesvirus gør fortolke specifikke forbindelser inden for en identificeret netværk svært, præsenterer vi en følsom og pålidelig metode beskæftiger biotinylerede dextran aminer (BDA) og kolera toksin subunit b (CTB) til at bekræfte forbindelserne mellem cellerne identificeret ved hjælp af PRV152. Immunokemisk påvisning af BDA og CTB med peroxidase og DAB (3, 3'-diaminobenzidin) blev valgt, fordi de er effektive til at afsløre cellulære processer, herunder distale dendritter ^6-11.

Introduction

Transsynaptisk sporing er blevet et magtfuldt værktøj, der anvendes til at analysere centrale efferents der regulerer perifere mål gennem multi-synaptiske kredsløb. Denne fremgangsmåde har været mest udbredt anvendt i gnaverhjerner ved at udnytte det svinepatogen pseudorabiesvirus (PRV), især den svækkede stamme PRV-Bartha først beskrevet i 1961 ^12. Her præsenteres en protokol til at identificere motoren cortical repræsentation af specifikke muskler eller muskelgrupper anvendelse af et rekombinant pseudorabiesvirus stamme (PRV152), der udtrykker den forbedrede grønt fluorescerende protein (eGFP) reportergenet ^2. Den beskrevne fremgangsmåde udnytter adfærd neurotrope vira, som producerer infektiøst afkom, der krydser synapser at inficere andre neuroner inden for en funktionel kredsløb ^3,4,13. PRV152, som er isogene med PRV-Bartha, sender kun synapser retrogradt gennem hierarkisk rækkefølge af synaptiske forbindelser væk fra infektionsstedet ^{3,5 <}/ sup>. Ved præcist at styre perifere infektionsstedet er det muligt at begrænse indtrængen af ​​virus ind i hjernen gennem en særlig undergruppe af motoriske neuroner. Eftersom virusset inficerer sekventielt kæder af forbundne neuroner, vil det resulterende mønster af eGFP signal i hele hjernen derefter løse netværk af neuroner, der er forbundet med de oprindeligt inficerede celler.

En yderligere fordel ved anvendelse af virus for neural sporing er amplifikation af reporter protein (eGFP i dette tilfælde) i inficerede celler. Dette signal forstærkning giver et niveau af følsomhed, der giver mulighed for påvisning af selv sparsomme fremskrivninger. For eksempel blev en sparsom fremspring fra vibrissa motor cortex til ansigtets motoriske neuroner styrer whiskers findes i rotter under anvendelse af viralt udtrykt grønt fluorescerende protein ^14; tidligere undersøgelser har undladt at finde denne fremskrivning hjælp klassiske sporstoffer uden reportergen forstærkning ^11,15. desværreMange virale vektorer tracing, som blev brugt i den nævnte undersøgelse, ikke krydser synapser og dermed begrænse deres anvendelse til sporing multi-synaptiske kredsløb.

Mens præsentere tydelige fordele til identificering netværket af celler, der deltager i en motor kredsløb, den distribuerede karakter transsynaptisk sporing med PRV-152 gør fortolkningen specifikke forbindelser i kredsløbet vanskelig. Præsenterer vi derfor en simpel metode til validering specifikke forbindelser inden kredsløb identificeret ved hjælp af PRV-152 ved at dobbeltklikke mærkning ved hjælp biotinylerede dextran aminer (BDA) og kolera toksin subunit b (CTB). Den kombinerede anvendelse af BDA og CTB er en veletableret metode til at spore forbindelser mellem specifikke sæt af neuroner ^6-8,11. Når de anvendes sammen, kan disse to sporstoffer visualiseres i samme sektion under anvendelse af en to-farvet DAB (3, 3'-diaminobenzidin) procedure ^16. Høj molekylvægt BDA (BDA10kDa) blev udvalgt til denne protokol, fordi det yields detaljeret mærkning af neuronale processer ^6,7,9. Yderligere fordele ved BDA10kDa omfatter følgende: Det er fortrinsvis transporteres i anterograd retning ^6-8; den kan leveres ved iontoforetisk eller indsprøjtningstryk ^6-8; Det kan visualiseres ved et simpelt avidin-biotinyleret HRP (ABC) procedure ^17; og det kan afbildes ved hjælp af lys eller elektronmikroskopi ^6,7,18. Immunokemisk påvisning af CTB med peroxidase og DAB blev valgt til retrograd mærkning af motorneuroner, fordi det er effektivt til at afsløre cellulære processer, herunder distale dendritter ^10,19. Vi har for nylig brugt denne metode til at identificere den vokale motor vej i mus og at afsløre en sparsom forbindelse fra primær motor cortex til larynx motoriske neuroner, som tidligere blev antaget at være fraværende ^20.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg er blevet gennemgået og godkendt af Duke University Institutional Animal Care & Brug udvalget.

1. Lagring pseudorabiesvirus

1. Vi får levende virus (PRV152) fra laboratoriet Dr. Lynn Enquist på Princeton University i en titer på 1 x ¹⁰ 9 pfu / m. Protokollen til at generere virus er blevet offentliggjort ^2.
2. Alikvot virus på 20 pi pr rør inde i en BSL-2 biosikkerhed kabinet og opbevares ved -80 ° C under passende biosikkerhed betingelser.
3. Tø en portion af PRV umiddelbart før injektion.

2. Kirurgisk Forberedelse til injektioner i muskel

1. Inducere generel anæstesi ved intramuskulær injektion af ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin), og opretholder en passende bedøvelse plan ved hjælp af isofluoran.
2. Beskytte hornhinder med en ophthalmisk salve.
3. Forbered than operationsstedet ifølge aseptisk teknik ved at trimme hår og desinfektion af kirurgiske sted med skiftende scrubs af Betadine og 70% alkohol (minimum 3 cykler). Sørg for at bruge sterile forhæng dækker kirurgiske områder. Sørg for at holde sig til sterile teknikker igennem procedurerne.
4. Lav en hud snit og afslører musklen af ​​interesse. For eksempel for at få adgang til cricothyroid larynx muskler, er det nødvendigt først at fjerne den overliggende del af sternohyoid muskel.
5. Forsegle alle overskårne muskler med VetBond væv lim.

3. Injektion af PRV i en muskel

1. Læg 10 pi NanoFil mikrosprøjte systemet med frisk optøet PRV løsning, vedhæfte en 34 G kanyle af rustfrit stål, og omhyggeligt montere den på stereotaktisk apparat.
2. Langsomt rydde døde rum og kontroller, at løsningen kommer ud mikrosproejten spids. Kassér fluid som bioharzard affald.
3. Ved hjælp af en stereotaktisk microPositioning enhed forsigtigt placere mikrosprøjten spidsen ind i musklen af ​​interesse og langsomt fylde musklen indtil let hævelse er synlig. Injektionen vil variere afhængigt af størrelsen af ​​musklen og volumen, der skal injiceres. For eksempel bør fem injektioner af 200 nl (1 pi i alt) ved en hastighed på 4 nl / sek gøres 1 min fra hinanden på samme sted for at fylde cricothyroid muskel. Flyt sprøjten til næste musklen af ​​interesse (den laterale cricoarytenoid i dette tilfælde) og gentag injektionsproceduren. Kun punktere hver muskel en gang.
4. Træk mikrosprøjten efter fem minutter.
5. Forsegle pause i fascia hjælp VetBond væv lim.
6. Efter alle injektioner er afsluttet, lukke såret ved hjælp VetBond væv lim. Afhængigt af dine lokale institional retningslinier brug dyr, suturer eller sårklemmer kan anvendes.
7. Overvåg dyret indtil brystleje og give analgesi, mad, vand, og omsorg, der kræves af yvores institutionelle retningslinier anvendelsen af ​​dyr.
8. Efter den eksperimentelt bestemte overlevelsestid (i dette tilfælde 90 timer til at mærke ^2. bestille corticalneuroner), ofre dyret ved pentobarbital overdosis og perfundere transkardialt med 0,9% saltvand efterfulgt af 4% formaldehyd i 0,1 M PBS.
9. Fjern og post-fix hjernen i 4% formaldehyd i 24 timer.
10. Cryoprotect hjernen i phosphatbuffer indeholdende 30% saccharose i mindst 48 timer.

4. Immunochemical Påvisning af eGFP

1. Skær snit på 40 um på en glidende mikrotom og gemme flydende sektioner i 0,1 M PBS. Tyndere sektioner, for eksempel 30 um, kan anvendes, når farvning monterede sektioner.
2. Quench sektioner i 30 minutter i 0,3% H _{2 O 2} i PBS beskyttet mod lys.
3. Blokere ikke-specifikke antigener i sektionerne i 30 minutter i PBS indeholdende 0,3% Tween 20 med normalt gedeserum fra Vectastain Elite Kit (VE kit).
4. Vask afsnit tre gange i PBS i 5 minutter, derefter inkuberes dem i 1 time i gede-anti-kanin sekundært antistof fra VE kit ved stuetemperatur.
5. Forbered ABC opløsningen fra VE kit ifølge producentens anvisninger.
6. Vask afsnit tre gange i PBS i 5 minutter, derefter reagere dem i 1 time i ABC-opløsning fra VE kit ved stuetemperatur.
7. Vask afsnit tre gange i phosphatbuffer i 10 minutter, og udvikle sig i 8 min i phosphatbuffer, pH 7,4, indeholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidin) og 0,015% H _{2 O 2.}
8. Mount afsnittene om SuperFrost Plus dias og dehydrere dem gennem en gradueret alkoholrække (70%, 95%, 100% og 100% i 5 minutter hver).
9. Ryd afsnittene gennem to xylen vaske (5 min hver) og dækglasset dias med Permount montering medium.
10. Billede de monterede sektioner på et mikroskop. DAB reaktionsprodukt inside cellerne skal vises brun. Digitaliserede billeder kan være farve omvendt at fremhæve fine processer.

5. Kirurgisk Forberedelse til injektion røbestoffer i hjerneregioner Opdaget af PRV Tracing

1. Inducere generel anæstesi ved intramuskulær injektion af ketamin-xylazin (100 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazin), og opretholder en passende bedøvelse plan ved hjælp af isofluoran.
2. Beskytte hornhinder med en ophthalmisk salve.
3. Fastgør hovedet i en passende stereotaktisk ramme.
4. Forbered operationsstedet efter aseptisk teknik ved at trimme hår og desinficere stedet med vekslende scrubs af Betadine og 70% alkohol (minimum 3 cykler).
5. Foretag en hovedbund snit og trække huden over hjernen regionen af ​​interesse.
6. Udfør en lille kraniotomi på passende stereotaksiske koordinater. For eksempel koordinaterne for laryngeally tilsluttede motor cortex identificeret ved PRV sporing i enn voksne mus er 1,2 mm lateralt og 0,2 mm rostralt Bregma.

6. Injektion af biotinylerede Dextran Aminer i Brain

1. Forbered 7,5% biotinylerede dextran aminer (BDA) ved at opløse 25 mg BDA (10,000 MW) i 333 pi sterilt saltvand.
2. Indlæse Nanoject II mikropipette-system med tilstrækkelig BDA løsning for de planlagte injektioner.
3. Langsomt rydde døde rum og kontroller, at løsningen er spændende mikropipettespidsen.
4. Ved hjælp af en stereotaktisk micropositioning enhed sænk forsigtigt mikropipettespidsen ind i hjernen område af interesse og langsomt injicere BDA. Juster injektionshastigheden afhængigt af størrelsen af ​​området, der skal mærkes. For eksempel bør 12 injektioner af 4,6 nl ske en på fire forskellige steder 0,2 mm fra hinanden (Rostro-haleretningen) til dækning af laryngeally tilsluttede motor cortex hos voksne mus. Den injektionsvolumen endelige bør justeres efter størrelsen af ​​hjernen regionen af ​​interesseHolde sig for øje, at etiketten kan spredes fra formkernen ved diffusion gennem hjernevæv og langs de processer af mærkede neuroner.
5. Forsegl kraniotomi hjælp dental cement, og luk hovedbunden såret ved hjælp VetBond væv lim.
6. Overvåg dyret indtil brystleje og give analgesi, mad, vand, og omsorg, der kræves af din institutionelle retningslinier anvendelsen af ​​dyr.

7. Injektion af underenhed B af choleratoksin i muskel

1. Forbered 1% underenhed B af choleratoksin (CTB) ved at opløse 1 mg CTB i 100 pi sterilt saltvand.
2. Seks dage efter BDA injektion i hjernen, udføre den kirurgiske præparatet som beskrevet ovenfor for PRV injektioner i musklen.
3. Læg 10 pi NanoFil mikrosprøjte-system med CTB løsning, vedhæfte en 34 G kanyle af rustfrit stål, og omhyggeligt montere den på stereotaktisk apparat.
4. Udfør mikroinjektioner i musklen (r) af interesse som tidligere debeskrevet for PRV.
5. Overvåg dyret indtil brystleje og give analgesi, mad, vand, og omsorg, der kræves af din institutionelle retningslinier anvendelsen af ​​dyr.
6. Tre dage efter CTB injektion ofre dyret ved pentobarbital overdosis og perfundere transkardialt med 0,9% saltvand efterfulgt af 4% formaldehyd i 0,1 M PBS.
7. Fjern og post-fix hjernen i 4% formaldehyd i 24 timer.
8. Cryoprotect hjernen i phosphatbuffer indeholdende 30% saccharose i mindst 48 timer.

8. Påvisning af BDA og CTB i samme sektioner

1. Skær snit på 40 um på en mikrotom og gemme flydende sektioner i 0,1 M PBS.
2. Quench sektioner i 30 minutter i 0,3% H _{2 O 2} i PBS beskyttet mod lys.
3. Forbered ABC opløsningen fra VE kit ifølge producentens anvisninger.
4. Vask afsnit tre gange i PBS i 5 minutter, derefter reagere dem i 1 time i ABC-opløsning ved stuetemperatur. Vask afsnit tre gange i phosphatbuffer i 10 minutter, og udvikle sig i 8 min i phosphatbuffer, pH 7,4, indeholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidin), 0,015% H _{2 O 2} og 0,05% nikkelchlorid. DAB reaktionsprodukt inde i cellerne skal vises sort.
5. Bloksektioner i 30 minutter i PBS indeholdende 0,3% Tween 20 med normalt kaninserum fra Vectastain Elite Kit.
6. Inkuber blokeret sektioner i 2 timer i gede-anti-CTB (1: 10.000) ved stuetemperatur.
7. Vask afsnit tre gange i PBS i 5 minutter, derefter inkuberes dem i 1 time i kanin-anti-gede-sekundært antistof fra VE kit ved stuetemperatur.
8. Forbered ABC opløsningen fra VE kit ifølge producentens anvisninger.
9. Vask afsnit tre gange i PBS i 5 minutter, derefter reagere dem i 30 minutter i ABC-opløsning ved stuetemperatur.
10. Vask afsnit tre gange i phosphatbuffer i 10 minutter, og udvikle i op til 8 min i phosphatpuffer, pH 7,4, indeholdende 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) og 0,015% H _{2 O 2.} DAB reaktionsprodukt inde i cellerne skal vises brun.
11. Mount afsnittene om SuperFrost Plus dias og dehydrere dem gennem en gradueret alkoholrække (70%, 95%, 100% og 100% i 5 minutter hver).
12. Ryd afsnittene gennem to xylen vaske (5 min hver) og dækglasset dias med Permount montering medium.
13. Billede de monterede sektioner på et mikroskop.

Representative Results

Farvning for eGFP bør begynde at vise svagt signal i primære motoriske neuroner ca. 72 timer efter injektion PRV152 i en muskel. Replikation og transsynaptisk transport af virus er titer- og tidsafhængig ^4. Ca. 90 timer efter injektion, vil eGFP farvning afsløre robust signal i 2 ^nd orden inficerede celler. Længere overlevelsestid vil afsløre ^3. og højere ordens celler, men overlevelsestid er begrænset af letalitet PRV på ca. 5 dage efter inokulering.

Figur 1A viser neuroner inficeret med PRV152 udtrykker eGFP i nucleus ambiguus, som huser larynx motoriske neuroner, 94 timer efter injektion af PRV152 i to af de syv larynx muskler. Da virus ind i hjernen gennem neuroner, der innerverer de inficerede muskler, andre phonatory motor neuron puljer, såsom hypoglossus kerne, ikke udtrykker eGFP (figur 1b).

Figur 2 viser retrograd transport af virusset til 2 ^nd for hjernestamme neuroner efterfølgende primær infektion i nucleus ambiguus. Injektionen var ensidige, og den resulterende mønster af etiketten i hjernestammen viser infektion af den ipsilaterale nucleus ambiguus og ensomt kerne (figur 2a). Retikulære interneuroner blev også smittet og farves stærkt for eGFP (figur 2b). Disse interneuroner forbinde forskellige strukturer, herunder phonatory motor neuron puljer og den kontralaterale kerne ambiguus; Men deres efferente mål forbliver umærket da virus kun spreder i retrograd retning.

Figur 3 viser inficerede premotor neuroner i den motoriske hjernebark udtrykker eGFP kontralaterale til webstedet perifer injektion. Fordi PRV152 spredes gennem multi-synaptiske kredsløb der rammer larynx motoriske neuroner i nucleus ambiguus, kan det be antages, at kun populationen af ​​celler, der udgør motoren cortical repræsentation af larynx muskulatur blev inficeret. Manglen på eGFP signal i resten af ​​sektionen vist (og de fleste af forhjernen ikke vist) viser specificiteten af ​​mærkningen.

Figur 4 viser BDA-mærkede axoner i hjernestammen på niveau med nucleus ambiguus. Axoner komme i kontakt med CTB-positive motoriske neuroner retrogradt mærket af injektioner i larynx muskler. Axoner er vist danner varicosities og formodede terminale boutons nær dendritter og soma af larynx-motoriske neuroner. Yderligere forsøg med elektronmikroskopi eller elektrofysiologi er nødvendige for at fastslå, om disse varicosities repræsenterer synaptiske boutons.

Figur 5a viser en bilateral injektion af BDA placeret i laryngeally tilsluttet motoriske hjernebark som identificeret ved retrograd transsynaptisk sporing med PRV152. Bec ABrug BDA er ikke retningsbestemt specifik, både afferente og efferente forbindelser kan mærkes. For eksempel har både et fremspring felt (anterograd) og cellelegemer (retrograd) etiketten ses i thalamus (figur 5b).

Figur 1: Neuroner inficeret med PRV152 udtrykker eGFP (grøn) og cholinacetyltransferase immunpositive motorneuroner (rød) i (a) Ambiguus (Amb) og (b) hypoglossus (XII) Kerner af musen Brainstem 94 timer efter injektion af PRV152 i Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Larynx muskler. RF = reticular formation. Klik her for at se en større version af dette tal.

g2.jpg "/>
Figur 2:. Psuedorabies virus (PRV152) Infektion i hjernestammen på en mus 86 timer efter Injektion PRV152 ind i Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Larynx Muskler (a) Neuroner udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (hvid, farver omvendte fra originale lysfelt billeder af farvede sektioner ) i nucleus ambiguus (Amb) ipsilaterale til den injicerede muskel, den omgivende retikulære formation (RF) og ensomme kernen (Sol), men ikke hypoglossus kerne (XII). (B) Amb og retikulære interneuroner ved højere forstørrelse (røde pile, celle organer i RF). Scale barer: 1 mm for en; 100 um til b. (Modificeret fra Arriaga et al. 2012). Klik her for at se en større version af dette tal.

tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg "/>
Figur 3:. Kortikal pyramideneuroner udtrykker eGFP (hvid, farver omvendte fra originale lysfelt billeder af farvede snit) i Kortikal Layer V i M1 efter Injektion af Psuedorabies virus (PRV152) ind i Cricothyroid og Lateral Cricoarytenoid Larynx Muskler Scale barer: 1 mm for hovedpanel; 200 um til nedfældning. (Modificeret fra Arriaga et al. 2012).

Figur 4:. M1 Axoner i hjernestammen (a) Lav effekt af en koronale hjernestammen sektion indeholdende CTB-mærkede motoriske neuroner i Amb (brun) fra en injektion i larynx muskler og M1 axoner (sort) fra en injektion af BDA i M1. BDA mærkede axoner kan ses i cortico-pyramideformede (Pyr) spor. Forkortelser: Amb, nucleus ambiguus; Pyr, pyramider; MRF, reticular formation direkte medialt for Amb; DRF, retikulære formation dorsale til Amb. (B) Høj forstørrelse af BDA-mærket Axon (sort, pilespidser) fra M1, der gør kontakt (pil) på et Amb motoriske neuroner (CTB brune). (C) M1 axoner (sort) løber langs (pile) og i nærheden (pilespidser) en stor Amb motor neuron dendritceller, der udstråler ud fra Amb. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: injektionsstedet og yderligere tovejs forbindelser afsløret af BDA injektioner ikke set med PRV transsynaptisk sporing. (a) Bilaterale biotinylerede dextran amin (BDA) injektioner (sort) i primær motor cortex (M1) afslørede en tæt terminal projektion felt (sort) i den underliggende striatum. (b) Cortical axoner fra M1 slutte i den ventrale laterale kerne af thalamus (VL); En klynge af thalamiske celler (mørk brun og markeret med hvid pil hoved), at projektet tilbage til M1 sang regionen er også observeret i VL. Den interne kapsel (IC) er mærket axoner fra cortex. Scale barer: 1 mm for en; 200 um til b. (Modificeret fra Arriaga et al. 2012). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er en række spørgsmål, der skal tages i betragtning, når man planlægger et eksperiment ved hjælp PRV152 ^4,21. Vigtigst er det, pseudorabiesvirus er dødelig. Som tidligere nævnt, store aber, herunder mennesker er ikke modtagelige for smitte, men skal udvises passende omhu for at beskytte andre dyr. Voksne mus typisk overlever fem til syv dage efter podning med den svækkede PRV152 stamme. Derfor PRV152 er ikke egnet til eksperimenter, der kræver overlevelse gange længere end en uge. Desuden inficerede dyr typisk vise tegn på sygdom i løbet overlevelse periode, hvilket begrænser anvendeligheden af ​​PRV152 til eksperimenter, der kræver observation af normal adfærd.

Derudover PRV152 udløser en immunrespons cytotoksisk ^22. Fordi replikation og overførsel af virus er titer- og tidsafhængig ^4, mønstret af neuroner afsløret ved immunkemisk påvisning af virusL-proteinerne eller EGFP reportergen vil ændre sig i løbet af overlevelse periode som celler fremskridt gennem stadier af infektionen. Fem dage efter podning i muskler, kan ^3. eller 4 ^th orden neuroner kunne detekteres, men de tidligste inficerede neuroner kan blive apoptotiske. Således optimale overlevelsestid skal bestemmes eksperimentelt for hver undersøgelse. Det anbefales at udføre en tidsserie analyse for at bestemme progression af en infektion gennem et kredsløb, og det bedste tidspunkt til mærkning af specifikke neuroner af interesse uden at risikere celle eller et dyr død.

En af de vigtigste faktorer, der påvirker succes mærkning med PRV er den virale titer. Markante reduktioner i antallet af inficerede celler er blevet rapporteret, når faldende titeren af PRV-Bartha fra 1,4 x 10 ⁵ til at 7 x 10 ⁴ pfu / ^ml 23. Derfor anbefaler vi at bruge titre over 1 x 10 ⁷ pfu / ml og holde alikvoteret virus ved -80 ° C, indtil det anvendes til at bevare sin infektivitet. Selv ved anvendelse af en høj titer, skal man huske på, at ikke alle celletyper kan være tolerante for infektion. Derfor kan cellerne identificeret ved PRV sporing ikke være fuldstændig repræsentativ for input til en inficeret målet.

Den beskrevne metode fokuserer på nytten af ​​PRV til analyse centrale efferents regulerer perifere mål, specielt muskler gennem multi-synaptiske kredsløb. Andre neurale kredsløb, såsom visuel og autonom ^24, er velegnede til denne teknik, fordi de også kan blive inficeret af perifer inokulering. Dog kan PRV bruges effektivt til direkte injektion i centralnervesystemet, når nogle spørgsmål er nøje overvejet, som diskuteret udførligt i en forudgående ^3. Disse forfattere nævner, at PRV-Bartha og beslægtede stammer i vid udstrækning fylde dendritiske dorne af inficerede neuroner, hvilket gør PRV152 velegnet til identifying afferenter til den distale dendritter. Denne egenskab af virus gør den beskrevne teknik særlig anvendelig til at udlede en foreløbig liste over input til distale dendritter placeret uden for cellen kroppen regionen, som typisk undersøgt med konventionelle sporstoffer.

Når sporing fra perifere mål, bør sympatisk innervation betragtes som en mulig forvirre. Derfor anbefaler vi oprindeligt sammenligne mærkning mønstre i normale og sympathectomized dyr for at afgøre, om PRV mærkningen af ​​sympatiske input vil påvirke fortolkningen af ​​resultaterne.

Signal i inficerede celler fra eGFP udtrykt af PRV152 kan afbildes direkte ved hjælp af fluorescensmikroskopi uden behov for immunhistokemi; Men dette signal er underlagt foto-blegning og nedbrydes over tid. Den største fordel ved immunohistokemi kombineret med DAB farvning for tarmkanalen sporing er permanent karakter af reaktionsprodukterne. Selv om det ir også muligt at anvende antistoffer mod virale proteiner til påvisning af inficerede celler, forskellige virale elementer vil ikke nødvendigvis co-lokalisere med hinanden ^{25 eller} med EGFP signal. Derfor anbefaler vi at bruge antistoffer mod eGFP at bevare mærkningen mønster observeret af fluorescens.

Fordi alle afferenter til en inficeret celle sandsynligvis bliver kanaler til transsynaptisk passage af virus, herunder dem, der kontakter distale dendritter, vi fandt det vigtigt at vælge en konventionel sporstof, som pålideligt pletter sådanne dendritter til efterfølgende bekræftelse af relæer i de identificerede kredsløb. Vi valgte CTB til dette formål, og fandt, at det giver god farvning af dendritter og stærk kontrast med både det omgivende neuropil og faldende axoner fra motoren cortex. Selv om det er muligt at vende farvningen af ​​de farvede axoner og celle organer (BDA = brun, CTB = sort), finder vi, at sort giver den bedste contrast til visualisering fine kaliber axoner.

Et vigtigt punkt at huske på, når BDA mærkning mønstre tolkning er, at BDA10kDa primært anvendes som anterograd sporstof, men kan også mærke celler retrogradt (figur 6) ^6. Desuden kan BDA transporteres retrogradt ind i en celle og derefter fordelt langs en axon sikkerhedsstillelse til en anden terminal websted. Hvis disse axon soeskende er til stede i samme region som fremspringet mål for den injicerede område, så er det vanskeligt at skelne dem fra anterograd mærkning.

En sidste teknisk bemærkning er, at 34 G NanoFil metal sprøjte den præsterer bedre end en fin kaliber, trak glaspipette til indsprøjtning sporstoffer i musklerne, men forårsager for meget mekaniske skader når de anvendes til intracerebrale injektioner i små dyr. Vi anbefaler derfor, at bruge sprøjten metal til perifere injektioner og glaspipette for centrale injektioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R

Name	Company	Catalog Number	Comments
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992