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Neuroscience

Transsynaptic हैजा विष और biotinylated Dextran एमाइंस डबल लेबलिंग के द्वारा पीछा किया pseudorabies वायरस के साथ परिधीय लक्ष्य से ट्रेसिंग

Published: September 14, 2015 doi: 10.3791/50672
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 2Howard Hughes Medical Institute

Abstract

Transsynaptic ट्रेसिंग बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से परिधीय लक्ष्यों को नियंत्रित करने वाले केंद्रीय efferents का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है। यह तरीका सबसे बड़े पैमाने पर स्वाइन रोगज़नक़ pseudorabies वायरस (इनका उपयोग) 1 का उपयोग करके मस्तिष्क में इस्तेमाल किया गया है। इनका उपयोग मानव सहित महान वानर, संक्रमित नहीं करता है, तो यह सबसे अधिक छोटे स्तनपायी, विशेष रूप से कृन्तकों पर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। pseudorabies तनाव PRV152 बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) रिपोर्टर जीन व्यक्त किया और केवल प्रतिगमनपूर्वक दूर संक्रमण साइट 2,3 से synaptic कनेक्शन की श्रेणीबद्ध दृश्य के माध्यम से कार्यात्मक synapses पार करती है। अन्य इनका उपभेदों अलग सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुण होते हैं और दोनों दिशाओं (इनका उपयोग-बेकर और इनका उपयोग-कापलान) 4,5 में ले जाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल PRV152 साथ विशेष रूप से सौदा होगा। ऐसे मांसपेशियों के रूप में, एक परिधीय स्थल पर वायरस देने से, यह टी में वायरस के प्रवेश को सीमित करने के लिए संभव हैन्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सेट के माध्यम से वह मस्तिष्क। मस्तिष्क भर EGFP संकेत के परिणामस्वरूप पैटर्न तो शुरू में संक्रमित कोशिकाओं से जुड़े हैं कि न्यूरॉन्स हल करता है। Pseudorabies वायरस से transsynaptic ट्रेसिंग के वितरित प्रकृति मुश्किल एक पहचान नेटवर्क के भीतर विशिष्ट कनेक्शन की व्याख्या करता है, हम प्रयोग कर पहचान की कोशिकाओं के बीच कनेक्शन की पुष्टि के लिए biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) और हैजा विष सबयूनिट बी (ब्यूरो) रोजगार एक संवेदनशील और विश्वसनीय तरीका मौजूद है PRV152। वे बाहर का डेन्ड्राइट 6-11 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं का खुलासा करने में प्रभावी रहे हैं, क्योंकि peroxidase और थपका (3, 3'-diaminobenzidine) के साथ बीडीए और CTB की immunochemical का पता लगाने के लिए चुना गया था।

Introduction

Transsynaptic ट्रेसिंग बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से परिधीय लक्ष्यों को नियंत्रित करने वाले केंद्रीय efferents का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है। यह तरीका सबसे बड़े पैमाने पर विशेष रूप से तनु तनाव इनका-Bartha पहले 1961 में वर्णित स्वाइन रोगज़नक़ pseudorabies वायरस (इनका उपयोग), के उपयोग से कृंतक मस्तिष्क में इस्तेमाल किया गया है 12। यहाँ, हम विशिष्ट मांसपेशियों की मोटर cortical प्रतिनिधित्व की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत या बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) पत्रकार जीन 2 व्यक्त एक पुनः संयोजक pseudorabies वायरस तनाव (PRV152) का उपयोग मांसपेशी समूहों। वर्णित विधि पार synapses के एक कार्यात्मक सर्किट 3,4,13 के भीतर अन्य न्यूरॉन्स को संक्रमित करने के लिए है कि संक्रामक संतान का उत्पादन जो neurotropic वायरस, के व्यवहार का लाभ उठाते। इनका उपयोग-Bartha साथ isogenic है जो PRV152, केवल दूर संक्रमण साइट 3,5 <से प्रतिगमनपूर्वक synaptic कनेक्शन की श्रेणीबद्ध दृश्य के माध्यम से synapses के पार/ Sup>। ठीक संक्रमण के परिधीय साइट को नियंत्रित करके यह मोटर न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट सबसेट के माध्यम से मस्तिष्क में वायरस के प्रवेश को सीमित करने के लिए संभव है। वायरस क्रमिक रूप से जुड़ा हुआ न्यूरॉन्स की जंजीरों को संक्रमित करता है के रूप में, मस्तिष्क भर EGFP संकेत के परिणामस्वरूप पैटर्न तो शुरू में संक्रमित कोशिकाओं से जुड़े हैं कि न्यूरॉन्स के नेटवर्क को हल करेंगे।

तंत्रिका पता लगाने के लिए वायरस का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह संक्रमित कोशिकाओं के भीतर संवाददाता प्रोटीन (इस मामले में EGFP) के प्रवर्धन है। यह संकेत प्रवर्धन भी विरल अनुमानों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि संवेदनशीलता का एक स्तर प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, मूंछ को नियंत्रित करने के चेहरे की मोटर न्यूरॉन्स के लिए vibrissa मोटर प्रांतस्था से एक विरल प्रक्षेपण virally व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन 14 का उपयोग चूहों में पाया गया था; पिछले अध्ययनों पत्रकार जीन प्रवर्धन 11,15 बिना शास्त्रीय ट्रेसर उपयोग करते हुए इस प्रक्षेपण खोजने में असफल रहा। दुर्भाग्य से, कई वायरल ट्रेसिंग वैक्टर, उद्धृत अध्ययन में इस्तेमाल एक तरह, जिससे बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट पता लगाने के लिए उनके उपयोग को सीमित करने, synapses के पार नहीं करते।

एक मोटर सर्किट में भाग लेने की कोशिकाओं के नेटवर्क की पहचान के लिए विशेष लाभ प्रस्तुत करते हुए transsynaptic की वितरित प्रकृति इनका उपयोग -152 मुश्किल सर्किट के भीतर विशिष्ट कनेक्शन की व्याख्या करता है के साथ अनुरेखण। इसलिए, हम biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) और हैजा विष सबयूनिट बी (ब्यूरो) का उपयोग डबल लेबलिंग द्वारा इनका उपयोग -152 का उपयोग पहचान सर्किट के भीतर विशिष्ट कनेक्शन मान्य करने के लिए एक सरल तरीका मौजूद है। बीडीए और CTB के संयुक्त उपयोग न्यूरॉन्स 6-8,11 के विशिष्ट सेट के बीच कनेक्शन पता लगाने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण है। जब एक साथ थे, इन दोनों ट्रेसर एक दो रंग थपका (3, 3'-diaminobenzidine) प्रक्रिया 16 का उपयोग एक ही अनुभाग में देखे जा सकते हैं। उच्च आणविक भार बीडीए (BDA10kDa) इस प्रोटोकॉल के लिए चयनित किया गया था यह y क्योंकिneuronal प्रक्रियाओं 6,7,9 की विस्तृत लेबलिंग ields। BDA10kDa का अतिरिक्त लाभ निम्नलिखित शामिल हैं: यह रियायत के अग्रगामी दिशा 6-8 में ले जाया जाता है; यह iontophoretic या दबाव इंजेक्शन 6-8 से दिया जा सकता है; यह एक साधारण avidin-biotinylated एचआरपी (एबीसी) प्रक्रिया 17 से देखे जा सकते हैं; और यह प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 6,7,18 से ली जा सकती है। यह बाहर का डेन्ड्राइट 10,19 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं का खुलासा करने में प्रभावी है क्योंकि peroxidase और थपका साथ CTB की immunochemical पता लगाने motoneurons की प्रतिगामी लेबलिंग के लिए चुना गया था। हमने हाल ही में चूहों में मुखर मोटर मार्ग की पहचान करने के लिए और पहले से 20 अनुपस्थित होना मान लिया गया था, जो स्वरयंत्रज मोटर न्यूरॉन्स को प्राथमिक मोटर प्रांतस्था से एक विरल कनेक्शन प्रकट करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की और ड्यूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. भंडारण pseudorabies वायरस

  1. हम 1 एक्स 10 9 pfu / मीटर की अनुमापांक में प्रिंसटन विश्वविद्यालय में डॉ लिन Enquist की प्रयोगशाला से जीवित वायरस (PRV152) प्राप्त करते हैं। वायरस उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल 2 प्रकाशित किया गया है।
  2. उचित जैव सुरक्षा शर्तों के तहत -80 डिग्री सेल्सियस पर एक बीएसएल -2 जैव सुरक्षा कैबिनेट और दुकान के अंदर ट्यूब प्रति 20 μl पर वायरस विभाज्य।
  3. तुरंत इंजेक्शन लगाने से पहले इनका उपयोग के एक विभाज्य पिघलना।

मांसपेशी में इंजेक्शन के लिए 2. शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. (100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine, 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine) ketamine-xylazine के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित और isofluorane का उपयोग कर एक उचित संवेदनाहारी विमान बनाए रखें।
  2. एक नेत्र मरहम के साथ कॉर्निया को सुरक्षित रखें।
  3. टी तैयारबाल trimming और बारी Betadine की स्क्रब और 70% शराब (3 चक्र के न्यूनतम) के साथ शल्य साइट disinfecting द्वारा सड़न रोकनेवाला तकनीक के अनुसार वह शल्य साइट। शल्य क्षेत्रों को कवर करने के लिए बाँझ पर्दे का उपयोग सुनिश्चित करें। प्रक्रियाओं भर बाँझ तकनीकों का पालन करना सुनिश्चित करें।
  4. एक त्वचा चीरा और ब्याज की पेशी प्रकट करते हैं। उदाहरण के लिए, यह पहली बार sternohyoid पेशी के overlying हिस्से को हटाने के लिए आवश्यक है cricothyroid स्वरयंत्रज मांसपेशियों का उपयोग करने के लिए।
  5. Vetbond ऊतक चिपकने के साथ किसी भी transected मांसपेशियों को सील।

मांसपेशी में इनका उपयोग की 3. इंजेक्शन

  1. एक 34 जी स्टेनलेस स्टील सुई देते हैं, हौसले thawed इनका समाधान के साथ 10 μl NanoFil microsyringe सिस्टम लोड, और ध्यान से stereotaxic डिवाइस पर माउंट।
  2. धीरे धीरे मृत अंतरिक्ष स्पष्ट और कहा कि समाधान microsyringe टिप से बाहर निकालता है सत्यापित करें। Bioharzard अपशिष्ट के रूप में तरल पदार्थ त्यागें।
  3. एक stereotaxic microp का प्रयोगositioning डिवाइस ध्यान से ब्याज की मांसपेशी में microsyringe टिप जगह और मामूली सूजन दिखाई दे रहा है जब तक धीरे-धीरे पेशी भरें। मांसपेशियों और वॉल्यूम के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे इंजेक्शन दर इंजेक्ट किया। उदाहरण के लिए, 4 NL / सेकंड की दर से 200 NL (1 μl कुल) के पांच इंजेक्शन cricothyroid मांसपेशियों को भरने के लिए एक ही साइट पर 1 मिनट के अलग किया जाना चाहिए। ब्याज की अगली पेशी के लिए सिरिंज (इस मामले में पार्श्व cricoarytenoid) को स्थानांतरित और इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराने। केवल एक बार प्रत्येक मांसपेशी पंचर।
  4. पांच मिनट के बाद microsyringe वापस लेना।
  5. Vetbond ऊतक चिपकने का उपयोग प्रावरणी में ब्रेक सील।
  6. सभी इंजेक्शन पूरा हो चुका है, के बाद Vetbond ऊतक चिपकने का उपयोग घाव को बंद करें। अपने स्थानीय institional पशु उपयोग के दिशा निर्देशों, टांके या घाव क्लिप के आधार पर किया जा सकता है।
  7. स्टर्नल लेटना तक पशु मॉनिटर और analgesia, भोजन, पानी उपलब्ध कराने, और y द्वारा अपेक्षित के रूप में देखभालहमारे संस्थागत पशु उपयोग के दिशा निर्देशों।
  8. प्रयोगात्मक निर्धारित अस्तित्व के समय के बाद (इस मामले में, 90 घंटा 2 लेबल एन डी cortical न्यूरॉन्स ऑर्डर करने के लिए), pentobarbital अधिक मात्रा द्वारा पशु बलि और 0.1 एम पीबीएस में 4% formaldehyde के द्वारा पीछा 0.9% नमक के साथ transcardially छिड़कना।
  9. निकालें और 24 घंटे के लिए 4% formaldehyde में मस्तिष्क के बाद तय कर लो।
  10. कम से कम 48 घंटे के लिए 30% सूक्रोज युक्त फॉस्फेट बफर में मस्तिष्क Cryoprotect।

EGFP 4. immunochemical जांच

  1. एक रपट microtome पर 40 माइक्रोन से कम वर्गों में कटौती और 0.1M पीबीएस में अस्थायी वर्गों को बचा लो। घुड़सवार वर्गों धुंधला जब पतली वर्गों, उदाहरण के 30 माइक्रोन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
  2. प्रकाश से सुरक्षित पीबीएस में 0.3% एच 2 ओ 2 में 30 मिनट के लिए वर्गों बुझाने।
  3. पीबीएस Vectastain संभ्रांत किट से सामान्य बकरी सीरम के साथ 0.3% के बीच 20 से युक्त में 30 मिनट के लिए वर्गों में गैर विशिष्ट एंटीजन ब्लॉक (किट VE)।
  4. आरटी पर किट VE से तो बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी में 1 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं, 5 मिनट के लिए वर्गों पीबीएस में तीन बार धोएं।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट VE से एबीसी समाधान तैयार है।
  6. आरटी पर किट VE से तो एबीसी समाधान में 1 घंटे के लिए उन्हें प्रतिक्रिया, 5 मिनट के लिए वर्गों पीबीएस में तीन बार धोएं।
  7. 0.05% थपका (3, 3'-diaminobenzidine) और 0.015% एच 2 ओ 2 युक्त, 10 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर में वर्गों में तीन बार धोएं, और फॉस्फेट बफर में 8 मिनट, पीएच 7.4 के लिए विकसित करना।
  8. एक वर्गीकृत शराब श्रृंखला के माध्यम से माउंट SuperFrost प्लस स्लाइड पर वर्गों और उन्हें निर्जलीकरण (70%, 95%, 100% और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100%)।
  9. दो xylene washes (5 मिनट प्रत्येक) के माध्यम से वर्गों साफ़ और Permount बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड coverslip।
  10. छवि एक खुर्दबीन पर मुहिम शुरू वर्गों। थपका प्रतिक्रिया उत्पाद insidई कोशिकाओं भूरे रंग के दिखाई देनी चाहिए। डिजीटल छवियों ठीक प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए उलटा रंग का हो सकता है।

इनका उपयोग ट्रेसिंग द्वारा की खोज मस्तिष्क क्षेत्रों में Tracers के इंजेक्शन के लिए 5. शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. (100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine, 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine) ketamine-xylazine के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा सामान्य संज्ञाहरण प्रेरित और isofluorane का उपयोग कर एक उचित संवेदनाहारी विमान बनाए रखें।
  2. एक नेत्र मरहम के साथ कॉर्निया को सुरक्षित रखें।
  3. एक उचित stereotaxic फ्रेम में सिर को ठीक करें।
  4. बाल trimming और बारी Betadine की स्क्रब और 70% शराब (3 चक्र के न्यूनतम) के साथ साइट disinfecting द्वारा सड़न रोकनेवाला तकनीक के अनुसार शल्य साइट तैयार करें।
  5. एक खोपड़ी चीरा और ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र पर त्वचा वापस लेना।
  6. उचित stereotaxic निर्देशांक पर एक छोटा सा craniotomy प्रदर्शन। उदाहरण के लिए, इनका एक में अनुरेखण द्वारा की पहचान laryngeally जुड़ा मोटर कोर्टेक्स के लिए निर्देशांकएन वयस्क माउस 1.2 मिमी पार्श्व और शीर्षस्थान के लिए 0.2 मिमी व्याख्यान चबूतरे वाला हैं।

मस्तिष्क में Biotinylated Dextran एमाइंस 6. इंजेक्शन

  1. बाँझ खारा के 333 μl में बीडीए के 25 मिलीग्राम (10,000 मेगावाट) भंग करके 7.5% biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) तैयार करें।
  2. योजना बनाई इंजेक्शन के लिए पर्याप्त बीडीए समाधान के साथ Nanoject द्वितीय micropipette सिस्टम लोड।
  3. धीरे धीरे मृत अंतरिक्ष स्पष्ट और कहा कि समाधान micropipette टिप बाहर निकल रहा है की जाँच करें।
  4. एक stereotaxic micropositioning डिवाइस का प्रयोग सावधानी से ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में micropipette टिप कम और धीरे धीरे बीडीए इंजेक्षन। क्षेत्र के आकार पर निर्भर करता इंजेक्शन दर लेबल किया जा समायोजित करें। उदाहरण के लिए, 4.6 NL के 12 इंजेक्शन के अलावा 0.2 मिमी (rostro दुम दिशा) वयस्क चूहों में laryngeally जुड़ा मोटर कोर्टेक्स को कवर करने के लिए चार अलग-अलग स्थानों पर किया जा बनाया जाना चाहिए। अंतिम इंजेक्शन की मात्रा ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए, लेबल मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से और लेबल न्यूरॉन्स की प्रक्रियाओं के साथ प्रसार द्वारा इंजेक्शन कोर से फैल सकता है कि ध्यान में रखते हुए।
  5. दंत सीमेंट का उपयोग कर craniotomy सील, और Vetbond ऊतक चिपकने का उपयोग खोपड़ी घाव को बंद करें।
  6. स्टर्नल लेटना तक पशु मॉनिटर और analgesia, भोजन, पानी उपलब्ध कराने, और अपने संस्थागत पशु उपयोग के दिशा निर्देशों द्वारा अपेक्षित के रूप में परवाह है।

मांसपेशी में हैजा विष सबयूनिट ख 7. इंजेक्शन

  1. बाँझ खारा के 100 μl में CTB के 1 मिलीग्राम भंग द्वारा 1% हैजा विष सबयूनिट बी (ब्यूरो) तैयार करें।
  2. छ: दिन मस्तिष्क में बीडीए इंजेक्शन के बाद, मांसपेशियों में इनका उपयोग इंजेक्शन के लिए ऊपर वर्णित के रूप में शल्य चिकित्सा की तैयारी करते हैं।
  3. एक 34 जी स्टेनलेस स्टील सुई देते हैं, CTB समाधान के साथ 10 μl NanoFil microsyringe सिस्टम लोड, और ध्यान से stereotaxic डिवाइस पर माउंट।
  4. पहले से डे के रूप में ब्याज की मांसपेशी (ओं) में microinjections प्रदर्शन करनाइनका उपयोग के लिए मानते।
  5. स्टर्नल लेटना तक पशु मॉनिटर और analgesia, भोजन, पानी उपलब्ध कराने, और अपने संस्थागत पशु उपयोग के दिशा निर्देशों द्वारा अपेक्षित के रूप में परवाह है।
  6. तीन दिन CTB इंजेक्शन के बाद, pentobarbital अधिक मात्रा द्वारा पशु बलि और 0.1 एम पीबीएस में 4% formaldehyde के द्वारा पीछा 0.9% नमक के साथ transcardially छिड़कना।
  7. निकालें और 24 घंटे के लिए 4% formaldehyde में मस्तिष्क के बाद तय कर लो।
  8. कम से कम 48 घंटे के लिए 30% सूक्रोज युक्त फॉस्फेट बफर में मस्तिष्क Cryoprotect।

एक ही धारा में बीडीए और CTB 8. जांच

  1. एक microtome पर 40 माइक्रोन से कम वर्गों में कटौती और 0.1M पीबीएस में अस्थायी वर्गों को बचा लो।
  2. प्रकाश से सुरक्षित पीबीएस में 0.3% एच 2 ओ 2 में 30 मिनट के लिए वर्गों बुझाने।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट VE से एबीसी समाधान तैयार है।
  4. तब आरटी पर एबीसी समाधान में 1 घंटे के लिए उन्हें प्रतिक्रिया, 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों तीन बार धोएं। 10 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर में वर्गों में तीन बार धोएं, और 0.05% थपका (3, 3'-diaminobenzidine), 0.015% एच 2 ओ 2, और 0.05% निकल क्लोराइड युक्त, फॉस्फेट बफर में 8 मिनट, पीएच 7.4 के लिए विकसित करना। कोशिकाओं के अंदर थपका प्रतिक्रिया उत्पाद काला दिखाई देनी चाहिए।
  5. Vectastain संभ्रांत किट से सामान्य खरगोश सीरम के साथ बीच 20 0.3% से युक्त पीबीएस में 30 मिनट के लिए ब्लॉक वर्गों।
  6. आरटी पर: सेते बकरी में 2 घंटे के लिए विरोधी CTB (10,000 1) वर्गों अवरुद्ध कर दिया।
  7. आरटी पर किट VE से तो खरगोश विरोधी बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी में 1 घंटे के लिए उन्हें सेते, 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों तीन बार धोएं।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट VE से एबीसी समाधान तैयार है।
  9. तब आरटी पर एबीसी के घोल में 30 मिनट के लिए उन्हें प्रतिक्रिया, 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों तीन बार धोएं।
  10. 0.05% थपका (3, 3 से युक्त, 10 मिनट के लिए वर्गों फॉस्फेट बफर में तीन बार धोएं, और फॉस्फेट बफर में अप करने के लिए 8 मिनट, पीएच 7.4 के लिए विकसित'-diaminobenzidine) और 0.015% एच 2 ओ 2। कोशिकाओं के अंदर थपका प्रतिक्रिया उत्पाद भूरे रंग के दिखाई देनी चाहिए।
  11. एक वर्गीकृत शराब श्रृंखला के माध्यम से माउंट SuperFrost प्लस स्लाइड पर वर्गों और उन्हें निर्जलीकरण (70%, 95%, 100% और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 100%)।
  12. दो xylene washes (5 मिनट प्रत्येक) के माध्यम से वर्गों साफ़ और Permount बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड coverslip।
  13. छवि एक खुर्दबीन पर मुहिम शुरू वर्गों।

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Representative Results

EGFP लिए धुंधला हो जाना मांसपेशी में PRV152 इंजेक्शन लगाने के बाद प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स में लगभग 72 घंटा कमजोर संकेत दिखा शुरू करना चाहिए। प्रतिकृति और वायरस के transsynaptic परिवहन titer- और समय पर निर्भर कर रहे हैं 4। लगभग 90 घंटे के बाद इंजेक्शन, EGFP धुंधला 2 एन डी आदेश संक्रमित कोशिकाओं में मजबूत संकेत खोलेगा। लंबे समय तक जीवित रहने के समय 3 और उच्च आदेश कोशिकाओं को उजागर करेंगे लेकिन अस्तित्व के समय पर लगभग 5 दिनों टीका के बाद इनका उपयोग की मारक द्वारा सीमित हैं।

चित्रा 1 ए PRV152 स्वरयंत्रज मोटर न्यूरॉन्स, सात स्वर यंत्र की मांसपेशियों में से दो में PRV152 के इंजेक्शन के बाद 94 घंटा जो घरों में नाभिक ambiguus में व्यक्त EGFP से संक्रमित न्यूरॉन्स से पता चलता है। वायरस संक्रमित मांसपेशियों, ऐसे hypoglossal नाभिक के रूप में अन्य phonatory मोटर न्यूरॉन पूल, अंदर आना कि न्यूरॉन्स के माध्यम से मस्तिष्क में प्रवेश किया है, क्योंकि EGFP व्यक्त नहीं करते (चित्रा 1 बी)।

चित्रा 2 नाभिक ambiguus में प्राथमिक संक्रमण के बाद के 2 एन डी आदेश brainstem न्यूरॉन्स के लिए वायरस का प्रतिगामी परिवहन से पता चलता है। इंजेक्शन एकतरफा था, और मस्तिष्क में लेबल के परिणामस्वरूप पैटर्न ipsilateral नाभिक ambiguus और एकान्त नाभिक (2A चित्रा) के संक्रमण से पता चलता है। जालीदार इन्तेर्नयूरोंस भी संक्रमित और EGFP (चित्रा 2 बी) के लिए दृढ़ता से दाग रहे थे। ये इन्तेर्नयूरोंस phonatory मोटर न्यूरॉन पूल और contralateral नाभिक ambiguus सहित विभिन्न संरचनाओं, कनेक्ट; वायरस ही प्रतिगामी दिशा में फैलता है क्योंकि हालांकि, उनके अपवाही लक्ष्यों लेबल हटाया रहते हैं।

चित्रा 3 परिधीय इंजेक्शन साइट के लिए EGFP contralateral व्यक्त मोटर कॉर्टेक्स में संक्रमित premotor न्यूरॉन्स से पता चलता है। PRV152 नाभिक ambiguus में स्वरयंत्रज मोटर न्यूरॉन्स पर impinging बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से फैलता है, क्योंकि यह कर सकते हैं खई स्वरयंत्रज मांसलता की मोटर cortical प्रतिनिधित्व रचना कि कोशिकाओं के केवल आबादी संक्रमित थे कि ग्रहण किया। (और अग्रमस्तिष्क के सबसे दिखाया गया है) दिखाया खंड के बाकी हिस्सों में EGFP संकेत के अभाव लेबलिंग की विशिष्टता को दर्शाता है।

चित्रा 4 नाभिक ambiguus के स्तर पर मस्तिष्क में एक्सोन बीडीए लेबल से पता चलता है। एक्सोन प्रतिगमनपूर्वक स्वरयंत्रज मांसपेशियों में इंजेक्शन द्वारा लेबल CTB पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स के साथ संपर्क बनाने। एक्सोन स्वरयंत्रज मोटर न्यूरॉन्स की varicosities और dendrites के पास ख्यात टर्मिनल बोटंस और सोमा के गठन दिखाए जाते हैं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करते हुए आगे के प्रयोगों इन varicosities अन्तर्ग्रथनी बोटंस प्रतिनिधित्व निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं।

चित्रा 5 ए PRV152 साथ अनुरेखण प्रतिगामी transynaptic द्वारा की पहचान के रूप में laryngeally जुड़ा मोटर कोर्टेक्स में रखा बीडीए के एक द्विपक्षीय इंजेक्शन से पता चलता है। बीईसी ause बीडीए दोनों अभिवाही और अपवाही कनेक्शन लेबल किया जा सकता है, दिशात्मक विशिष्ट नहीं है। उदाहरण के लिए, एक प्रक्षेपण क्षेत्र (अग्रगामी) और सेल शरीर दोनों (वक्री) लेबल चेतक में देखा जाता है (चित्रा 5 ब)।

चित्र 1
चित्रा 1: PRV152 (क) Ambiguus (अंब) में EGFP (हरा) और Choline एसटीट्रांसफेरासी immunopositive motoneurons (लाल) व्यक्त के साथ संक्रमित न्यूरॉन्स और (ख) में PRV152 के इंजेक्शन के बाद माउस Brainstem 94 घंटे की Hypoglossal (बारहवीं) नाभिक Cricothyroid और पार्श्व Cricoarytenoid Laryngeal स्नायु। आरएफ = जालीदार गठन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2:। Cricothyroid और पार्श्व Cricoarytenoid Laryngeal मांसपेशियों में PRV152 इंजेक्शन लगाने के बाद एक माउस 86 घंटे की brainstem में Psuedorabies वायरस (PRV152) संक्रमण (एक) न्यूरॉन्स बढ़ाया व्यक्त हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सफेद; दाग वर्गों के मूल brightfield छवियों से उल्टे रंग ) इंजेक्शन मांसपेशियों को नाभिक ambiguus (अंब) ipsilateral में, आसपास के जालीदार गठन (आरएफ) और एकान्त नाभिक (सोल), लेकिन नहीं hypoglossal नाभिक (बारहवीं)। (ख) अम्ब और उच्च बढ़ाई जालीदार इन्तेर्नयूरोंस (लाल तीर, आरएफ शरीर में सेल)। स्केल सलाखों: एक के लिए 1 मिमी; ख के लिए 100 माइक्रोन। (Arriaga एट अल। 2012 से संशोधित)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। चमड़ा पिरामिड न्यूरॉन्स EGFP (सफेद; दाग वर्गों के मूल brightfield छवियों से उल्टे रंग) जताते Cricothyroid और पार्श्व Cricoarytenoid Laryngeal मांसपेशियों में Psuedorabies वायरस (PRV152) के इंजेक्शन के बाद एम 1 के cortical परत वी में स्केल सलाखों: 1 मिमी के लिए मुख्य पैनल; इनसेट के लिए 200 माइक्रोन। (Arriaga एट अल से संशोधित। 2012)।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Brainstem में एम 1 axons (क) एम 1 में बीडीए का एक इंजेक्शन से स्वरयंत्रज मांसपेशियों और एम 1 एक्सोन (काला) में एक इंजेक्शन से अम्ब (ब्राउन) में CTB लेबल मोटर न्यूरॉन्स युक्त एक राज्याभिषेक मस्तिष्क खंड के कम बिजली। बीडीए लेबल एक्सोन कॉर्टिको-पिरामिड (Pyr) ट्रैक में देखा जा सकता है। लघुरूप: अम्ब, नाभिक ambiguus; Pyr, पिरामिड; एमआरएफ, आरeticular गठन सीधे अम्ब को औसत दर्जे का; डीआरएफ, अम्ब के लिए जालीदार गठन पृष्ठीय। (ख) बीडीए के उच्च बढ़ाई एक राजदूत मोटर न्यूरॉन्स (CTB ब्राउन) पर संपर्क (तीर) में आता है कि एम 1 से अक्षतंतु (काला, तीर सिर) लेबल। (ग) एम 1 एक्सोन (काला) (तीर) के साथ चल रहा है और निकट (तीर सिर) अम्ब से घूम रही है कि एक बड़े राजदूत मोटर न्यूरॉन डेन्ड्राइट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: इंजेक्शन साइट और इनका उपयोग transynaptic ट्रेसिंग के साथ नहीं देखा बीडीए इंजेक्शन से पता चला अतिरिक्त द्विदिश कनेक्शन। (क) प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (एम 1) में द्विपक्षीय biotinylated dextran अमाइन (बीडीए) इंजेक्शन (काला) अंतर्निहित स्ट्रिएटम में एक घने टर्मिनल प्रक्षेपण क्षेत्र (काला) का पता चला। (ख) कोर्टीएम 1 से काल एक्सोन चेतक (वीएल) के उदर पार्श्व नाभिक में समाप्त; Thalamic कोशिकाओं का एक समूह (गहरे भूरे और सफेद तीर सिर द्वारा चिह्नित) वापस एम 1 गायन क्षेत्र के लिए है कि परियोजना भी वीएल में मनाया जाता है। आंतरिक कैप्सूल (आईसी) कोर्टेक्स से आ रही एक्सोन की संज्ञा दी। स्केल सलाखों: एक के लिए 1 मिमी; ख के लिए 200 माइक्रोन। (Arriaga एट अल। 2012 से संशोधित)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

PRV152 4,21 का उपयोग कर एक प्रयोग की योजना बनाते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि मुद्दों के एक नंबर रहे हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात, pseudorabies वायरस घातक है। जैसा कि पहले उल्लेख, मानव सहित महान वानर, संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील नहीं हैं, लेकिन उचित देखभाल अन्य जानवरों की रक्षा के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए। वयस्क चूहों में आम तौर पर पांच से सात दिन तनु PRV152 तनाव के साथ टीका के बाद जीवित रहते हैं। इसलिए, PRV152 एक सप्ताह से अधिक समय तक जीवित रहने के समय की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, संक्रमित जानवरों को आम तौर पर इस तरह सामान्य व्यवहार के अवलोकन की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए PRV152 की उपयोगिता सीमित है, अस्तित्व की अवधि के दौरान बीमारी के लक्षण प्रदर्शित करते हैं।

इसके अतिरिक्त, PRV152 एक साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22 से चलाता है। प्रतिकृति और वायरस का संचरण समय पर निर्भर 4 titer- और कर रहे हैं, न्यूरॉन्स की तर्ज वीरा की इम्यूनो पता लगाने के द्वारा पता चलाकोशिकाओं के संक्रमण के चरणों के माध्यम से प्रगति के रूप में एल प्रोटीन या EGFP रिपोर्टर जीन अस्तित्व की अवधि के पाठ्यक्रम पर बदल जाएगा। पांच दिन की मांसपेशी में टीका के बाद, 3 या 4 वें आदेश न्यूरॉन्स पता लगाने योग्य हो सकता है, लेकिन जल्द से जल्द संक्रमित न्यूरॉन्स apoptotic बन सकता है। इस प्रकार इष्टतम अस्तित्व के समय प्रत्येक के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए। यह एक सर्किट के माध्यम से संक्रमण की प्रगति और सेल या जानवर मौत के जोखिम के बिना ब्याज के विशिष्ट न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु निर्धारित करने के लिए एक समय श्रृंखला विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है।

इनका साथ लेबलिंग की सफलता को प्रभावित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक वायरल अनुमापांक है। 1.4 एक्स 5-7 अक्तूबर 10 x 4 pfu / एमएल 23 से इनका उपयोग-Bartha की अनुमापांक कम हो रही है, जब संक्रमित कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय कटौती की सूचना दी गई है। इसलिए, हम एक 10 x 7 pfu / मिलीलीटर और कीपिंग aliquoted छठी से ऊपर का उपयोग titers की सिफारिशरस में -80 डिग्री सेल्सियस यह अपने संक्रामकता बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक। एक उच्च अनुमापांक का उपयोग करते समय, यहां तक ​​कि एक नहीं सभी प्रकार की कोशिकाओं के संक्रमण के लिए अनुमोदक हो सकता है कि दिमाग में रखना चाहिए। इसलिए, इनका उपयोग ट्रेसिंग द्वारा की पहचान की कोशिकाओं को एक संक्रमित लक्षित करने के लिए आदानों की पूरी तरह से प्रतिनिधि नहीं हो सकता।

वर्णित विधि बहु अन्तर्ग्रथनी सर्किट के माध्यम से परिधीय लक्ष्य, विशेष रूप से मांसपेशियों, विनियमन केंद्रीय efferents विश्लेषण करने के लिए इनका उपयोग की उपयोगिता पर केंद्रित है। उन्होंने यह भी परिधीय टीका से संक्रमित हो सकते हैं, क्योंकि इस तरह के दृश्य और 24 स्वायत्त रूप में अन्य तंत्रिका सर्किट, इस तकनीक के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हालांकि, इनका एक पूर्व समीक्षा 3 में बड़े पैमाने पर चर्चा के रूप में कुछ मुद्दों को ध्यान से माना जाता है, जब केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है। उन लेखकों इनका-Bartha और संबंधित उपभेदों बड़े पैमाने पर identifyi के लिए PRV152 अच्छी तरह से अनुकूल है, जिससे संक्रमित न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान arbors भरने का उल्लेख है किएनजी बाहर का डेन्ड्राइट को afferents। वायरस की इस संपत्ति आम तौर पर पारंपरिक ट्रेसर के साथ अध्ययन किया है कि सेल शरीर क्षेत्र के बाहर स्थित डिस्टल डेन्ड्राइट के लिए आदानों की एक प्रारंभिक सूची deducing के लिए वर्णित तकनीक विशेष रूप से उपयोगी बनाता है।

परिधीय लक्ष्य से ट्रेसिंग, जब सहानुभूति तंत्रिका वितरण एक संभव उलझाना विचार किया जाना चाहिए। इसलिए, हम शुरू में सहानुभूति आदानों की इनका उपयोग लेबलिंग परिणामों की व्याख्या को प्रभावित करेगा या नहीं यह निर्धारित करने के लिए सामान्य और sympathectomized पशुओं में लेबलिंग पैटर्न की तुलना सलाह देते हैं।

Immunohistochemistry के लिए आवश्यकता के बिना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीधे imaged किया जा सकता PRV152 द्वारा व्यक्त EGFP से संक्रमित कोशिकाओं में संकेत; बहरहाल, यह संकेत तस्वीर विरंजन के अधीन है और समय के साथ degrades। थपका पथ पता लगाने के लिए धुंधला के साथ संयुक्त इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री का मुख्य लाभ यह प्रतिक्रिया उत्पादों की स्थायी प्रकृति है। यह मैं जबकियह भी संक्रमित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए वायरल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संभव है, अलग अलग वायरल तत्व जरूरी एक दूसरे के साथ 25 या EGFP संकेत के साथ सह स्थानीय बनाना नहीं होगा। इसलिए, हम प्रतिदीप्ति द्वारा मनाया लेबलिंग पैटर्न की रक्षा करने के EGFP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करना चाहिये।

एक संक्रमित कोशिका के लिए सभी afferents बाहर का डेन्ड्राइट संपर्क करें कि उन सहित वायरस के transsynaptic पारित होने के लिए नाली बनने की संभावना है, क्योंकि हम यह महत्वपूर्ण मज़बूती से पहचान सर्किट में रिले के बाद पुष्टि करने के लिए इस तरह के डेन्ड्राइट दाग है कि एक पारंपरिक दरियाफ्त चयन करने के लिए माना जाता है। हम इस उद्देश्य के लिए CTB चयनित है, और यह डेन्ड्राइट के अच्छे धुंधला और आसपास के neuropil और मोटर प्रांतस्था से उतरते एक्सोन दोनों के साथ मजबूत विपरीत प्रदान करता है कि पाया। यह दाग एक्सोन और सेल शरीर के रंगाई (बीडीए = भूरे रंग के, CTB = काला) रिवर्स करने के लिए संभव है, हम काले सर्वश्रेष्ठ सह प्रदान करता है कि मिलntrast ठीक कैलिबर एक्सोन दृश्यमान करने के लिए।

बीडीए लेबलिंग पैटर्न की व्याख्या जब मन में रखने के लिए एक महत्वपूर्ण बात BDA10kDa मुख्य रूप से एक अग्रगामी अनुरेखक के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी प्रतिगमनपूर्वक (चित्रा 6) 6 कोशिकाओं लेबल कर सकते हैं। इसके अलावा, बीडीए फिर एक और टर्मिनल साइट के लिए एक अक्षतंतु जमानत के साथ वितरित की एक सेल में प्रतिगमनपूर्वक जाया जा सकता है। उन अक्षतंतु कोलेटरल इंजेक्ट क्षेत्र के प्रक्षेपण लक्ष्य के रूप में एक ही क्षेत्र में मौजूद हैं, तो यह अग्रगामी लेबलिंग से अलग करने के लिए मुश्किल है।

एक अंतिम तकनीकी नोट 34 ग्राम NanoFil धातु सिरिंज, एक ठीक क्षमता से बेहतर प्रदर्शन की मांसपेशियों में ट्रेसर इंजेक्शन लगाने के लिए गिलास पिपेट खींच लिया, लेकिन छोटे जानवरों में इन्ट्रासेरेब्रल इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जब बहुत ज्यादा यांत्रिक क्षति का कारण बनता है। इसलिए हम परिधीय इंजेक्शन के लिए धातु सिरिंज और केंद्रीय इंजेक्शन के लिए गिलास पिपेट का उपयोग करना चाहिये।

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Acknowledgments

हम स्वरयंत्रज सर्जरी तकनीक सिखाने के लिए, कोबे विश्वविद्यालय, जापान के डॉ तोशियो Terashima धन्यवाद, और इनका उपयोग-Bartha की आपूर्ति के लिए प्रिंसटन विश्वविद्यालय के डॉ लिन Enquist। अनुसंधान एरिक डी जार्विस एनआईएच अग्रणी पुरस्कार DP1 OD000448 और गुस्तावो Arriaga के लिए एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया। उचित रूप से श्रेय पिछले काम से आंकड़े जर्नल के संपादकीय नीतियों के अनुसार एक PLoS ओपन एक्सेस क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस (सीसी से) के तहत किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NanoFil Microinjection System World Precision Instruments IO-Kit 34 G option
Stereotaxic frame David Kopf Instruments Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-204
Sliding microtome Leica SM2010 R
Name Company Catalog Number Comments
VetBond 3M 1469SB
Isofluorane (Forane) Baxter  1001936060
Betadine Swab Stick Cardinal Health 2130-01 200 count
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500
SuperFrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
Biotinylated dextran amines Invitrogen D-1956 10,000 MW
Pseudorabies virus Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) PRV152 Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) List Biological Laboratories 703
Cholera Toxin B Subunit List Biological Laboratories 103B
Anti-eGFP Open Biosystems ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine Sigma-Aldrich D5905 10 mg tablets
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H3410 30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl Sigma-Aldrich K4138 80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride Sigma-Aldrich 339350
Phosphate buffer Sigma-Aldrich P3619 1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital Sigma-Aldrich P3761 50 mg/ml dose
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylenes Sigma-Aldrich 534056 Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment Vet Depot 1017992

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 103 pseudorabies वायरस हैजा विष biotinylated dextran amines सर्किट ट्रेसिंग neuroanatomy।
Transsynaptic हैजा विष और biotinylated Dextran एमाइंस डबल लेबलिंग के द्वारा पीछा किया pseudorabies वायरस के साथ परिधीय लक्ष्य से ट्रेसिंग
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Arriaga, G., Macopson, J. J.,… More

Arriaga, G., Macopson, J. J., Jarvis, E. D. Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling. J. Vis. Exp. (103), e50672, doi:10.3791/50672 (2015).

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