从外围目标跨突触跟踪与伪狂犬病病毒其次是霍乱毒素和生物素葡聚糖胺双标

Abstract

跨突触跟踪已成为用于分析调节通过多突触电路周边靶中央传出神经的有力工具。这种方法已通过利用猪病原体伪狂犬病毒^（PRV）1最广泛使用的大脑中的。 PRV不会感染大猿，包括人类，所以它是最常用的研究，小型哺乳动物，尤其是啮齿动物。的伪狂犬病应变PRV152表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因和只有逆行通过突触连接远离感染部位^2,3的分层顺序跨过功能性突触。其他PRV毒株具有不同的微生物学性质，并且可以在两个方向（PRV-Becker和PRV-卡普兰^）-4,5-运输。该协议将专门处理PRV152。通过提供该病毒在外围部位，如肌肉，也能够限制病毒的进入吨通过一组特定的神经元的他大脑。的eGFP信号的整个大脑所得图案然后解决了连接到最初感染的细胞的神经元。作为跨突触跟踪与伪狂犬病毒的分布特性使得解释中所标识的网络专用连接困难，我们目前采用生物素葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTB）进行确认，使用鉴定细胞间的连接灵敏，可靠的方法PRV152。免疫化学检测BDA和CTB的具有过氧化物和DAB（3，3'-二氨基联苯胺）的选择是因为它们是在揭示细胞过程，包括远侧树突^6-11有效。

Introduction

跨突触跟踪已成为用于分析调节通过多突触电路周边靶中央传出神经的有力工具。这种方法已通过利用猪病原体伪狂犬病毒（PRV），尤其是减毒株PRV-巴萨在1961年首先描述最广泛使用的啮齿动物的大脑^12。在这里，我们提出了一个协议，确定具体肌肉的运动皮层表现或使用重组伪狂犬病病毒株（PRV152）表达绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因²的肌肉群。所描述的方法利用的嗜神经病毒，产生感染性子代跨突触感染功能电路^3,4,13中的其他神经细胞的行为。 PRV152，这是同基因与PRV-巴萨，只有穿越突触逆行通过突触连接的分层顺序远离感染部位^{3,5- <}/ SUP>。通过精确控制感染的周边部位也能够限制病毒的进入大脑通过运动神经元的特定子集。作为依次病毒感染连接神经元的链，eGFP的信号的整个大脑所得图案然后将解决在连接到最初感染的细胞的神经元网络。

使用病毒神经跟踪的一个附加的优点是报告蛋白（eGFP的在这种情况下）感染的细胞内的扩增。这个信号放大提供灵敏度的电平，它允许检测甚至稀疏突起。例如，一个稀疏突起从鼻毛运动皮层的面部运动神经元控制所述晶须被发现在使用病毒表达的绿色荧光蛋白^14只大鼠 ;先前的研究没有使用经典的示踪剂没有报告基因扩增^11,15找到这个投影。不幸的是，许多病毒追踪载体，如在引用的研究中使用的，不交叉的突触，从而限制了其用于跟踪多突触电路。

而呈现明显的优点，用于识别参与的电动机电路单元的网络，跨突触的分布式特性跟踪与PRV-152使得该电路难以解释内特定的连接。因此，我们提出了验证识别电路中的特定连接使用PRV-152双标使用生物素葡聚糖胺（BDA）和霍乱毒素B亚基（CTB）的简单方法。北京经济技术开发区和CTB的结合使用是一种行之有效的追踪神经元^6-8,11的特定集合之间的连接方式。一起使用时，这两种示踪剂可以在相同的部分用双色DAB（3，3'-二氨基联苯胺）过程¹⁶可视化。高分子量BDA（BDA10kDa）被选定为这个协议，因为它ÿields神经元突起^6,7,9进行详细标注。 BDA10kDa的其它优点包括以下：它是在顺行方向^6-8优先运输;它可以通过离子电渗或压力注射^6-8交付;它可以通过简单的抗生物素蛋白-生物素化辣根过氧化物酶（ABC）的程序¹⁷被可视化;它可以通过光或电子显微镜^6,7,18进行成像。免疫化学检测CTB的具有过氧化物和DAB被选择为运动神经元逆行标记，因为它是在揭示细胞过程，包括远侧树突^10,19有效。我们最近使用这种方法来识别发声运动通路在小鼠和以显示从主运动皮层稀疏连接到喉运动神经元，这是以前假定为缺席^20。

Protocol

注：所有动物的程序进行了审查和批准杜克大学实验动物管理及使用委员会。

1.存储伪狂犬病毒

1. 我们获得林恩·恩奎斯特博士在普林斯顿大学的实验室活病毒（PRV152）以1×10 ⁹ PFU / m的效价。该协议产生的病毒已经出版^2。
2. 分装病毒以每管20微升BSL-2生物安全柜和商店内于-80℃下适当的生物安全的条件。
3. 立即注射前解冻PRV的等分。

2.手术准备注射到肌肉

1. 诱导通过注射氯胺酮 - 甲苯噻嗪的肌内全身麻醉（100mg / kg的氯胺酮; 10毫克/公斤赛拉嗪），并使用异氟烷维持适当的麻醉剂平面。
2. 保护角膜与眼用软膏。
3. 准备吨按照无菌技术通过修剪头发，用聚维酮碘交替磨砂和70％的酒精（至少3次）消毒手术部位，他的手术部位。请务必使用无菌单覆盖手术区域。请务必遵守无菌技术整个过程。
4. 做一个皮肤切口，揭示感兴趣的肌肉。例如，进入环甲喉肌，必须先删除胸骨舌骨肌上覆部分。
5. 任何密封切断肌肉VetBond组织粘合剂。

3.注射伪狂犬病毒进入肌肉

1. 装载10微升NanoFil微量系统刚解冻的PRV的解决方案，附加一个34克的不锈钢针，并小心地将其安装在立体设备上。
2. 慢慢地清除死角和验证解决方案退出微量尖。丢弃液体作为bioharzard浪费。
3. 使用立体micropositioning设备的微量尖小心放置到感兴趣肌肉和慢慢填充肌肉直到轻微肿胀是可见的。喷射率将取决于肌肉和体积的大小而变化，以喷射。例如，200 NL（1微升数量），在4升/秒的速率五次喷射应1分钟间隔在同一地点，以填补环甲肌。移动注射器到感兴趣的肌肉下（在这种情况下，环杓侧），并重复注入过程。只有穿刺每一块肌肉一次。
4. 五分钟后缩回微量。
5. 密封在使用VetBond组织粘合剂筋膜断裂。
6. 毕竟注入已经完成，关闭使用VetBond组织粘合剂伤口。根据本地institional动物使用指南，缝合或伤口剪辑可以使用。
7. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理要求由y我们的机构动物使用指南。
8. 后的实验确定生存时间（在这种情况下，90小时至标记²次皮层神经元），戊巴比妥过量牺牲动物和用0.9％盐水 ​​随后的4％甲醛的0.1M的PBS灌注transcardially。
9. 除去和后固定大脑中的4％甲醛24小时。
10. Cryoprotect大脑中含30％蔗糖的至少48小时的磷酸缓冲液。

4.免疫化学检测绿色荧光蛋白的

1. 切段在40微米的滑动切片，并保存浮动部分为0.1M PBS。较薄部分，例如30微米，可以染色安装部分时使用。
2. 淬火部分在_0.3％的H 2 _O 2的30分钟的PBS避光。
3. 方框中的部分的非特异性抗原在含有0.3％吐温20与来自VECTASTAIN精英套件正常山羊血清的PBS 30分钟（VE盒）。
4. 5分钟洗切片在PBS中三次，然后孵育它们1小时中的山羊抗兔二抗从VE试剂盒在RT。
5. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
6. 5分钟洗切片在PBS中三次，然后使它们反应1小时在ABC溶液从VE试剂盒在RT。
7. 在磷酸盐缓冲液进行10分钟清洗切片三次，并发展为在磷酸盐缓冲液8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3，3'-二氨基联苯胺）和0.015％的H _{2 O 2。}
8. 上Superfrost Plus或滑动安装部分和脱水它们通过一个分级醇系列（70％，95％，100％和100％，每次5分钟）。
9. 通过两个二甲苯洗涤（每次5分钟），清除部分和盖玻片Permount安装介质中的幻灯片。
10. 图像在显微镜安装的部分。民建联反应产物insidE中的细胞应该会出现褐色。数字化图像可以彩色倒要突出精细的工序。

5.手术准备注射示踪成脑区通过PRV追踪发现

1. 诱导通过注射氯胺酮 - 甲苯噻嗪的肌内全身麻醉（100mg / kg的氯胺酮; 10毫克/公斤赛拉嗪），并使用异氟烷维持适当的麻醉剂平面。
2. 保护角膜与眼用软膏。
3. 修正头在适当的立体框架。
4. 根据无菌技术通过修整毛发和优碘交替磨砂和70％的醇（至少3个周期）消毒站点准备手术部位。
5. 使头皮切口并缩回皮在感兴趣的大脑区域。
6. 在适当的立体坐标进行一个小的开颅手术。例如，对于确定的PRV跟踪在一个laryngeally连接运动皮层的坐标ñ成年小鼠的1.2毫米横向0.2毫米喙前囟门。

6.注射生物素葡聚糖胺进入脑

1. 通过将25毫克的北京经济技术开发区（1000万千瓦）的333微升无菌生理盐水的准备7.5％生物素葡聚糖胺（BDA）。
2. 加载Nanoject II微管系统为计划注入足够的BDA解决方案。
3. 慢慢地清除死角和验证的解决方案正在退出枪头。
4. 使用立体微定位装置小心地将枪头到感兴趣的脑区，并缓缓注入BDA。调整取决于区域的大小的喷射率来进行标记。例如，12注射4.6 NL应制成处于四个不同地点0.2毫米的间隔（rostro - 尾方向），以覆盖laryngeally连接运动皮层在成年小鼠。最后一次注射体积应根据所关注的大脑区域的大小来调整，牢记标签可以通过脑组织和沿标记的神经元的处理扩散从注射芯通过扩散。
5. 用牙科水泥密封了开颅手术，并关闭使用VetBond组织粘合剂头皮伤口。
6. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理按要求通过体制动物使用指南。

7.注射霍乱毒素B亚单位变成肌肉

1. 通过溶解在100μl的无菌盐水的1毫克CTB的制备1％霍乱毒素B亚基（CTB）。
2. BDA注射入脑六天后，执行上述用于PRV注射到肌肉的手术准备。
3. 装载10微升NanoFil微量系统CTB的解决方案，附加一个34克的不锈钢针，并小心地将其安装在立体设备上。
4. 执行显微注射​​到感兴趣肌肉（多个）如前面解划为PRV。
5. 监测动物，直到胸骨斜卧并提供镇痛，食物，水和护理按要求通过体制动物使用指南。
6. CTB注射后三天，通过戊巴比妥过量牺牲动物和灌注transcardially用0.9％盐水随后的4％甲醛的0.1M PBS中。
7. 除去和后固定大脑中的4％甲醛24小时。
8. Cryoprotect大脑中含30％蔗糖的至少48小时的磷酸缓冲液。

8.检测BDA和CTB在同一节

1. 切段在40微米的切片，并保存浮动部分为0.1M PBS。
2. 淬火部分在_0.3％的H 2 _O 2的30分钟的PBS避光。
3. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
4. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后使它们反应1小时在室温ABC溶液。 在磷酸盐缓冲液进行10分钟清洗切片三次，并发展为在磷酸盐缓冲液8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3，3'-二氨基联苯胺_{），0.015％}的H 2 _O 2，和0.05％的氯化镍。在细胞内的DAB反应产物应显示为黑色。
5. 块部分为在PBS中30分钟含有0.3％吐温20与来自VECTASTAIN精英套件正常兔血清。
6. 孵育在山羊网眼堵塞部分2小时抗CTB（1：10,000）于RT。
7. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后孵育它们1小时在兔抗山羊二抗从VE试剂盒在RT。
8. 制备的ABC溶液从根据制造商的指示VE套件。
9. 在PBS中5分钟洗部分三次，然后使它们反应在在室温下的ABC溶液30分钟。
10. 洗部分在磷酸盐缓冲液三次10分钟，并发展为在磷酸盐缓冲液达8分钟，pH为7.4，含0.05％DAB（3,3'二氨基联苯胺）和0.015％H _{2 O 2。}在细胞内的DAB反应产物应该出现褐色。
11. 上Superfrost Plus或滑动安装部分和脱水它们通过一个分级醇系列（70％，95％，100％和100％，每次5分钟）。
12. 通过两个二甲苯洗涤（每次5分钟），清除部分和盖玻片Permount安装介质中的幻灯片。
13. 图像在显微镜安装的部分。

Representative Results

染色的绿色荧光蛋白应该开始呈现出微弱的信号在主运动神经元注入PRV152进入肌肉后大约72小时。的复制和病毒的跨突触传输是titer-和时间依赖性^4。大约90小时注射后，绿色荧光蛋白染色将显示强劲的信号²次感染的细胞。较长的生存时间，就会发现3 ^次和更高阶的细胞，但生存时间由伪狂犬病病毒，在接种后5天左右的杀伤力有限。

图1a显示感染PRV152表达EGFP在疑核，里面喉运动神经元，注射PRV152成两个七喉肌后94小时神经元。因为病毒通过神经元支配感染肌肉，其他发声运动神经元池，如舌下神经核进入大脑，不表达eGFP的（图1b）。

图2显示了病毒的逆行运输到²次脑干神经元在疑核原发感染之后进行。注射是单方面的，并标记在脑干中得到的图案显示了同侧疑核和孤束核（图2a）的感染。网状interneurons也被感染，强烈的绿色荧光蛋白（ 图2b）染色。这些interneurons连接各种结构，包括发声运动神经元池和对侧疑核;然而，他们的传出目标仍然未标记的，因为这种病毒只敷于逆行方向。

图3示出受感染前运动神经元中的运动皮层表达EGFP对侧到外围注射部位。由于PRV152传播通过多突触回路撞击在喉运动神经元疑核，它可以bË假设细胞组成的喉头肌肉的运动皮层代表性的唯一的人口受到感染。的eGFP信号中所示（和大部分的前脑的未示出）的部分的其余部分的缺乏表明了标记的特异性。

图4表示在脑干处疑核的水平BDA标记轴突。轴突使得用CTB阳性的运动神经元逆行标记通过注射进入喉肌接触。轴突显示形成静脉曲张喉运动神经元和附近的树突假定终端终扣和SOMA。用电子显微镜或电进一步的实验是必需的，以确定这些膨体是否代表突触终扣。

图5a示出一个双侧注射BDA的所确定的逆行transynaptic与PRV152跟踪放入laryngeally连接运动皮层。 BEC澳洲英语BDA是不定向地具体，既传入和传出连接可以被标记。例如，这两个突起场（顺）和细胞体（逆行）标签是出现在丘脑（图5b）。

图1：神经感染PRV152表达EGFP（绿色）和胆碱乙酰转移酶免疫阳性运动神经元（红色）中的（一）疑（AMB）和（b）注射PRV152入后的小鼠脑干94小时的舌下（Ⅻ）核环甲和环杓侧喉肌。 RF =网状结构。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：Psuedorabies病毒（PRV152）感染的老鼠86小时的脑干注射PRV152进入环甲和环杓侧喉肌后 （ 一 ）神经元表达增强型绿色荧光蛋白（白，颜色的染色切片原明图像倒置）在疑核（AMB）同侧注射的肌肉，周围网状结构（RF）和所述孤束核（溶胶），但不舌下神经核（Ⅻ）。 （二）大使，并在更高的放大倍率网状interneurons（红色箭头，在RF胞体）。标度棒：1毫米的; 100微米对B。 （从阿里亚加等，2012修改）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：皮层锥体神经元表达EGFP（白;从染色切片原始明图像反转颜色）在M1的以下注射Psuedorabies病毒（PRV152）的皮质层V接环甲和环杓侧喉肌比例尺：1毫米为主面板; 200微米的插图。 （改自阿里亚加等，2012）。

图4：M1轴突在脑干 （a）从注射BDA到M1从注射在喉肌和M1轴突（黑色）含有在大使（棕色）CTB标记的运动神经元的冠脑干部分的低功耗。 BDA标记的轴突中可以看到的皮质 - 锥体（比利牛斯）轨道。简称：大使，疑核;比利牛斯，金字塔; MRF河eticular形成直接内侧大使; DRF，网状结构背侧大使。 （二）高倍率BDA标记的轴突（黑色箭头头），从M1，使接触（箭头）到大使运动神经元（CTB棕色）。 （三）货币供应量M1轴突（黑色），以及（箭头）运行和附近（箭头的头）大大使运动神经元树突，从大使散发出来。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：注射部位和注射BDA没有看到与PRV transynaptic跟踪透露更多的双向连接。 （一）双边生物素葡聚糖胺（BDA）注射（黑色）在主运动皮层（M1）揭示了在底层纹状体致密末端突起字段（黑色）。 （二）尔蒂从M1校准轴突终止在丘脑（VL）的前外侧核;丘脑细胞簇（深棕色并标注由白色箭头），该项目回M1唱区也观察到VL。内囊（IC）已标记的轴突从皮质的到来。标度棒：1毫米的; 200微米对B。 （从阿里亚加等，2012修改）。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

有一些必须规划使用PRV152 ^4,21的实验时，应考虑到的问题。最重要的是，伪狂犬病毒是致命的。正如前面提到的，大猿，包括人类不容易受到感染，但相应的必须小心保护其他动物。成年小鼠通常接种减毒PRV152应变后五至七天生存。因此，PRV152是不适合用于需要存活时间超过一周长的实验。此外，受感染的动物在生存期通常显示疾病的迹象，从而限制PRV152为需要观察的正常行为的实验工具。

此外，PRV152触发细胞毒免疫反应^22。由于复制和病毒传播是titer-和时间依赖性^4，神经元的图案揭示的免疫化学检测的维拉随着细胞通过感染的阶段进行升蛋白或绿色荧光蛋白报告基因将在生存期的过程中发生变化。接种在肌肉五天后^，3次或4 ^阶的神经元可以是可检测的，但最早感染神经元可能变得凋亡。因此，最佳的生存时间应通过实验为每个研究来确定。它建议执行时序分析，以确定感染通过电路的级数和用于标记感兴趣的特定的神经元，而不会危及细胞或动物死亡的最佳时间点。

一的影响标记与PRV成功的最重要因素之一是病毒滴度。明显减少在感染的细胞的数目时，从^1.4×10 5至^7×10 4 PFU / ml的²³减少PRV-巴萨的滴度已有报道。因此，我们建议以上1×10 ⁷ PFU / ml和保管等分六用滴度防毒在-80℃下直到它被用来保持其感染性。即使使用高滴度的时候，我们应该记住，并非所有类型的细胞可能是在容许的感染。因此，确定的PRV跟踪细胞可能不完全代表输入到被感染的靶。

所描述的方法主要针对伪狂犬病病毒分析中心传出调节周围的目标，特别是肌肉，通过多突触回路的效用。其他的神经电路，如视觉和植物神经^24，非常适合于这种技术，因为它们也可以感染周接种。然而，PRV可以有效地用于直接注射到中枢神经系统时，一些问题仔细考虑，因为在之前的评论中³广泛讨论。这些作者提到，PRV-巴萨和相关菌株广泛填补感染神经元的树突乔木，使PRV152非常适合identifyiNG传入远端树突。该病毒的这一特性使得所描述的技术推导输入到位于细胞体区域之外远侧树突通常研究了常规示踪剂的初步清单特别有用。

当从外围目标跟踪，交感神经支配应被视为一个可能的变乱。因此，我们建议首先在比较正常和sympathectomized动物标签模式来确定交感神经投入PRV标签是否会影响结果的解释。

信号在受感染的细胞从eGFP的由PRV152表示直接使用荧光显微镜，而不需要进行免疫组化进行成像;然而，该信号是受到光致漂白和降低随着时间的推移。免疫组化结合DAB染色道跟踪的主要优点是反应产物的长期性。虽然我和S可以使用抗病毒蛋白，以检测受感染的细胞，不同的病毒元件不一定会共定位彼此²⁵或与eGFP的信号。因此，我们建议使用抗绿色荧光蛋白，以维持荧光观察到的标记图案。

因为所有传入到受感染的细胞有可能成为管道的病毒跨突触通道，包括那些与远端树突，我们认为重要的是选择一个传统的示踪剂可靠污渍，树突在确定电路继电器的事后确认。我们选择了CTB用于此目的，并发现它提供了枝晶的良好染色和与两个周围神经纤维和从运动皮层的下行轴突强烈的对比。虽然可以扭转染色的轴突和胞体的着色（BDA =棕色; CTB =黑色），我们发现，黑提供了最好的合作ntrast可视化精细口径轴突。

解读北京经济技术开发区的标签图案时，要记住的重要一点是，BDA10kDa主要用作顺行示踪剂，还可以标记细胞逆行（ 图^6）6。此外，BDA可逆向转移到细胞中，然后沿着一个轴突抵押品分发到另一个终端站点。如果这些轴突络是存在于同一区域作为注入区域的投影目标的话，就很难从顺行标签区分开来。

最后一个技术说明的是，34克NanoFil金属注射器性能比罚款更好的口径，拉玻璃吸管注入示踪剂成肌肉，但会导致用于小动物脑内注射过多时机械损伤。因此，我们建议使用金属注射器注射外设和玻璃吸管的中心注射。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
NanoFil Microinjection System	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G option
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific Company	3-000-204
Sliding microtome	Leica	SM2010 R

Name	Company	Catalog Number	Comments
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter	1001936060
Betadine Swab Stick	Cardinal Health	2130-01	200 count
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
Biotinylated dextran amines	Invitrogen	D-1956	10,000 MW
Pseudorabies virus	Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)	PRV152	Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)	List Biological Laboratories	703
Cholera Toxin B Subunit	List Biological Laboratories	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine	Sigma-Aldrich	D5905	10 mg tablets
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride	Sigma-Aldrich	339350
Phosphate buffer	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xylenes	Sigma-Aldrich	534056	Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment	Vet Depot	1017992