Abstract
Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido mais amplamente utilizado no cérebro, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV) 1. O PRV não infectar grandes macacos, incluindo os seres humanos, por isso é mais comumente usado em estudos sobre pequenos mamíferos, especialmente roedores. O PRV152 pseudorabies estirpe expressa a proteína fluorescente (eGFP) gene repórter verde reforçada e só atravessa sinapses funcionais retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas de distância do local da infecção 2,3. Outras estirpes de PRV têm propriedades microbiológicas distintas e pode ser transportado em ambas as direcções (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo tratará exclusivamente com PRV152. Ao fornecer o vírus num sítio periférico, tais como o músculo, é possível limitar a entrada do vírus em tele cérebro através de um conjunto específico de neurônios. O padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida, resolve os neurónios que são ligados às células inicialmente infectadas. Como a natureza distribuída de rastreamento transsináptica com o vírus da pseudo-raiva faz interpretar conexões específicas dentro de uma rede identificada difícil, apresentamos um método sensível e confiável que emprega aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB) para confirmar as conexões entre as células identificadas usando PRV152. Detecção imunoquímica de BDA e CTB e com peroxidase de DAB (3, 3'-diaminobenzidina) foi escolhida, porque eles são eficazes em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 6-11.
Introduction
Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido o mais amplamente utilizado no cérebro de roedor, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV), especialmente a estirpe atenuada de PRV-Bartha descrita pela primeira vez em 1961 12. A seguir, apresentamos um protocolo para a identificação da representação cortical motora dos músculos específicos ou grupos musculares utilizando uma estirpe do vírus da pseudo-raiva recombinantes (PRV152) que expressa o reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) gene repórter 2. O método descrito explora o comportamento de vírus neurotrópico, que produzem progénie infeccioso que sinapses cruzadas para infectar outros neurónios dentro de um circuito funcional 3,4,13. PRV152, que é isogênico com PRV-Bartha, única atravessa sinapses retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas longe do local de infecção 3,5 </ sup>. Ao controlar com precisão o local periférico de infecção é possível limitar a entrada do vírus para o cérebro através de um subconjunto específico de neurónios motores. À medida que o vírus infecta sequencialmente cadeias de neurónios ligados, o padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida resolver a rede de neurónios que estão ligados às células inicialmente infectadas.
Uma vantagem adicional da utilização de vírus, para um rastreio neural é a amplificação da proteína repórter (eGFP, neste caso) no interior das células infectadas. Esta amplificação de sinal fornece um nível de sensibilidade que permite a detecção de projeções ainda esparsas. Por exemplo, uma projecção a partir de córtex motor esparso vibrissa para os neurónios motores faciais que controlam os bigodes foi encontrada em ratos utilizando viralmente expressa a proteína fluorescente verde 14; Estudos anteriores não conseguiram encontrar essa projeção usando marcadores clássicos sem amplificação do gene repórter 11,15. Infelizmente, Muitos vectores virais de rastreio, tal como o utilizado no estudo citado, não atravessam sinapses, limitando assim o seu uso para o rastreamento de circuitos multi-sinápticos.
Ao apresentar vantagens distintas para identificar a rede de células que participam em um circuito de motor, a natureza distribuída da transsináptica rastreamento com PRV-152 torna a interpretação de conexões específicas dentro do circuito difícil. Por isso, apresentamos um método simples para a validação de conexões específicas dentro de circuitos identificados usando PRV-152 by-dupla rotulagem utilizando aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB). O uso combinado do BDA e CTb é uma abordagem bem estabelecido para rastreamento de conexões entre conjuntos específicos de neurônios 6-8,11. Quando utilizados em conjunto, estes dois marcadores podem ser visualizados na mesma secção utilizando um DAB duas cores (3, 3'-diaminobenzidina) Procedimento 16. Alto peso molecular BDA (BDA10kDa) foi selecionada para este protocolo porque yfields rotulagem detalhada dos processos neuronais 6,7,9. As vantagens adicionais da BDA10kDa incluem o seguinte: ele é preferencialmente transportados na direcção anterógrada 6-8; que podem ser entregues por iontoforese ou de injecção a pressão 6-8; que pode ser visualizada por uma simples HRP (ABC) Procedimento 17 biotinilada-avidina; e pode ser fotografada pela luz ou microscopia eletrônica 6,7,18. Detecção imunoquímica da CTB com peroxidase e DAB foi escolhido para a marcação retrógrada de neurónios motores, pois é eficaz em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 10,19. Nós recentemente utilizado esta abordagem para identificar a via motora vocal em camundongos e para revelar uma conexão escasso de córtex motor primário para os neurônios motores da laringe, que foi previamente assumidos estar ausente 20.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso da Universidade Duke.
1. Armazenando vírus da pseudo-
- Obtemos vírus vivo (PRV152) a partir do laboratório do Dr. Lynn Enquist na Universidade de Princeton com uma concentração de 1 x 10 9 pfu / m. O protocolo para gerar o vírus foi publicada 2.
- Alíquota do vírus em 20 ul por tubo dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2 e armazenar a -80 ° C em condições de biossegurança adequadas.
- Descongelar uma alíquota de PRV imediatamente antes da injecção.
2. Preparação cirúrgica para injecções no músculo
- Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano.
- Proteja as córneas com uma pomada oftálmica.
- Prepare tele sítio cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local cirúrgico com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). Certifique-se de usar campos estéreis para cobrir áreas cirúrgicas. Certifique-se a aderir às técnicas estéreis durante os procedimentos.
- Faça uma incisão na pele e revelar o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar a musculatura laríngea cricothyroid é necessário primeiro remover a parte sobreposta do músculo esterno.
- Selar qualquer músculos transeccionados com adesivo de tecido Vetbond.
3. Injecção de PRV em músculo
- Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução PRV recém-descongelado, coloque uma agulha de aço inoxidável 34 G, e montá-lo cuidadosamente no dispositivo estereotáxico.
- Lentamente limpar o espaço morto e verifique se solução saia a ponta micro. Descarte fluido como resíduos bioharzard.
- Usando um microp estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente a ponta da microsseringa no músculo de interesse e lentamente encher o músculo até um ligeiro inchaço é visível. A taxa de injecção variará dependendo do tamanho do músculo e o volume a ser injectado. Por exemplo, de cinco injecções de 200 nl (1 mL no total) a uma taxa de 4 nl / s deve ser feito para além de 1 min no mesmo local para preencher o músculo crico. Mova a seringa para o próximo músculo de interesse (cricoaritenóideo lateral, neste caso) e repita o procedimento de injeção. Apenas perfurar cada músculo uma vez.
- Retrair o micro depois de cinco minutos.
- Selar a ruptura na fáscia usando adesivo de tecido Vetbond.
- Depois de todas as injecções foram concluídos, fechar a ferida utilizando adesivo de tecido Vetbond. Dependendo de suas diretrizes locais institional uso de animais, suturas ou clipes ferida pode ser usado.
- Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por ynossas diretrizes de uso de animais institucionais.
- Após o tempo de sobrevivência determinados experimentalmente (neste caso, 90 h para rotular 2a ordem neurónios corticais), sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M.
- Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas.
- Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas.
4. detecção imunoquímica de eGFP
- Cortar secções de 40 um em um micrótomo deslizante e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. Cortes mais finos, por exemplo de 30 um, pode ser utilizado quando a coloração secções montadas.
- Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz.
- Bloquear antigénios não específicos nas secções durante 30 minutos em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro de cabra normal a partir do kit Vectastain Elite (VE kit).
- Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida incubar durante 1 h em anticorpo secundário de cabra anti-coelho a partir do kit de VE, à TA.
- Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC do kit de VE, à TA.
- Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidina) e 0,015% de H 2 O 2.
- Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada).
- Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem.
- Imagem as seções montadas em um microscópio. O produto da reacção DAB inside as células devem aparecer marrom. Imagens digitalizadas podem ser cor invertida para realçar processos finas.
5. Preparação cirúrgica para a injeção de Tracers em regiões do cérebro Descoberto por PRV Tracing
- Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano.
- Proteja as córneas com uma pomada oftálmica.
- Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico apropriado.
- Prepare o local cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos).
- Faça uma incisão no couro cabeludo e retrair a pele sobre a região do cérebro de interesse.
- Realize uma pequena craniotomia nas coordenadas estereotáxica adequadas. Por exemplo, as coordenadas para córtex motor laryngeally conectado identificado por PRV rastreamento em umn rato adulto são 1,2 milímetros lateral e 0,2 mm rostral para Bregma.
6. Injecção da biotinilados Dextran Aminas em Cérebro
- Prepare a 7,5% biotinilados aminas dextrano (BDA) por dissolução de 25 mg de BDA (MW 10.000) em 333 ul de solução salina estéril.
- Carregar o sistema micropipeta Nanoject II com solução BDA suficiente para as injeções planejadas.
- Lentamente limpar o espaço morto e verificar que a solução é sair da ponta da micropipeta.
- Usando um dispositivo estereotáxico microposicionamento cuidadosamente abaixe a ponta da micropipeta para a região do cérebro de juros e injetar lentamente BDA. Ajustar a velocidade de injecção, dependendo do tamanho da região a ser marcado. Por exemplo, 12 injeções de 4,6 nl deve ser fez em quatro locais diferentes 0,2 milímetros distante (sentido rostro-caudal) para cobrir o córtex motor laryngeally conectado em ratos adultos. O volume final de injecção deve ser ajustada de acordo com o tamanho da região do cérebro de interesse, Tendo em mente que a etiqueta pode difundir a partir do núcleo de injecção por difusão através do tecido cerebral e ao longo dos processos de neurónios marcados.
- Selar a craniotomia com cimento dental, e fechar o ferimento no couro cabeludo usando adesivo de tecido Vetbond.
- Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais.
7. Injecção da toxina da cólera Subunidade b no músculo
- Prepare 1% Toxina da Cólera subunidade b (CTB) por dissolução de 1 mg de CTB em 100 ul de solução salina estéril.
- Seis dias após a injecção BDA no cérebro, realizar a preparação cirúrgica, como acima descrito para injecções PRV no músculo.
- Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução CTb, anexar uma agulha de aço inoxidável 34 G, e cuidadosamente montá-lo no dispositivo estereotáxico.
- Execute as microinjeções no músculo (s) de interesse como anteriormente descrito para PRV.
- Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais.
- Três dias após a injecção de CTB, sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M.
- Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas.
- Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas.
8. Detecção de BDA e CTb nas mesmas seções
- Cortar secções de 40 um em um micrótomo e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS.
- Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz.
- Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC à TA. Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidina), 0,015% de H 2 O 2, e 0,05% de cloreto de níquel. O produto da reacção DAB no interior das células deve aparecer preto.
- Secções de blocos de 30 min em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro normal de coelho a partir do kit Vectastain Elite.
- Incubar secções bloqueados durante 2 horas em cabra anti-CTB (1: 10.000), à TA.
- Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, depois incubar durante 1 h em anticorpo secundário de coelho anti-cabra a partir do kit de VE, à TA.
- Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante.
- Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem durante 30 min em solução ABC à TA.
- Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e para desenvolver até 8 min em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3'-diaminobenzidine) e 0,015% de H 2 O 2. O produto da reacção de DAB no interior das células deve aparecer castanho.
- Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada).
- Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem.
- Imagem as seções montadas em um microscópio.
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Representative Results
A coloração para eGFP deve começar mostrando sinal fraco em neurônios motores primários de aproximadamente 72 horas após a injecção de PRV152 em músculo. A replicação e transporte transsináptica de vírus são titer- e 4 dependente do tempo. Aproximadamente 90 horas após a injecção, coloração eGFP irá revelar sinal robusto em células infectadas 2ª ordem. Tempos mais longos de sobrevivência irá revelar 3 e células de ordem superior, mas o tempo de sobrevivência são limitadas por a letalidade de PRV em aproximadamente 5 dias após a inoculação.
A Figura 1a mostra neurônios infectados com PRV152 expressando eGFP no núcleo ambíguo, que abriga os neurônios motores da laringe, 94 horas após a injeção de PRV152 em dois dos sete músculos da laringe. Uma vez que o vírus foi introduzido o cérebro através de neurónios que enervam os músculos infectados, outros conjuntos de neurónios motores da fonação, tal como o núcleo do hipoglosso, não expressam eGFP (Figura 1b).
A Figura 3 mostra os neurónios pré-motores infectados no córtex motor que expressam eGFP contralateral ao local da injecção periférica. Porque PRV152 se espalha através de circuitos multi-sinápticos que incidem sobre os neurônios motores da laringe em núcleo ambíguo, que pode bE assumido que apenas a população de células que compõem a representação cortical do motor da musculatura da laringe foram infectadas. A falta de sinal eGFP no resto da secção mostrada (e a maior parte do cérebro anterior não mostrado) demonstra a especificidade da marcação.
A Figura 4 mostra os axônios marcadas com BDA no tronco cerebral ao nível de núcleo ambíguo. Os axônios fazer contato com os neurônios motores CTb-positivos retrogradamente marcados por injeções nos músculos da laringe. Os axônios são mostrados formando varicosities e boutons terminais putativos perto dos dendritos e soma de neurônios motores da laringe. Outros experimentos usando microscopia eletrônica ou eletrofisiologia são necessários para determinar se essas varizes representam boutons sináptica.
Figura 5a mostra uma injeção bilateral de BDA colocado no córtex motor laryngeally conectados como identificado por retrógrada transynaptic rastreamento com PRV152. Bec ause BDA não é direcional específica, ambas as conexões aferentes e eferentes podem ser rotulados. Por exemplo, tanto um campo de projecção (anterógrada) e corpos celulares (retrógrada) etiqueta são vistos no tálamo (Figura 5b).
Figura 1: Os neurónios infectadas com PRV152 Expressando eGFP (verde) e colina acetiltransferase imunopositivas Os motoneurónios (vermelho) na (a) ambíguo (Amb) e (b) hipoglosso (XII) Os núcleos do rato tronco cerebral 94 horas após a injecção de PRV152 no cricotireóidea e lateral cricoaritenóideos laringe músculos. RF = formação reticular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2:. Psuedorabies Virus (PRV152) Infecção no tronco encefálico de um hr Rato 86 depois de injetar PRV152 nos músculos cricotireóidea e lateral cricoaritenóideos laringe (a) Os neurônios que expressam reforçada verdes proteína fluorescente (branco; cores invertidas a partir de imagens de campo claro originais de secções coradas ) no núcleo ambíguo (Amb) ipsilateral ao músculo injectado, a formação circundante reticular (RF) e o núcleo solitário (sol), mas não o núcleo do nervo hipoglosso (XII). (B) Amb e interneurons reticulares na maior ampliação (setas vermelhas, corpos celulares em RF). Barras de escala: 1 mm para um; 100 uM para b. (Modificado de Arriaga et al. 2012). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3:. Cortical Piramidal neurônios expressando eGFP (branco; cores invertidas a partir de imagens de campo claro originais de secções coradas) na Cortical camada V do M1 após a injecção de Psuedorabies Virus (PRV152) para os músculos cricotireóidea e lateral cricoaritenóideos laringe barras de escala: 1 mm para painel principal; 200 uM para inserção. (Modificado de Arriaga et al. 2012).
Figura 4:. M1 Os axônios no tronco cerebral (a) de baixa potência de uma seção de tronco cerebral coronal contendo neurônios motores CTb marcados em Amb (marrom) a partir de uma injeção nos músculos da laringe e axônios M1 (preto) de uma injeção de BDA em M1. BDA axónios marcados podem ser vistos na faixa córtico-piramidal (Pir). Abreviaturas: Amb, núcleo ambíguo; Pyr, pirâmides; MRF, rformação eticular medial directamente para Amb; DRF, reticular dorsal formação para Amb. (B) alta ampliação do BDA marcado axônio (preto, cabeças de seta) da M1 que faz contato (seta) em um Amb neurônios motores (CTB marrom). (C) M1 axônios (preto) que funciona ao longo (setas) e perto (cabeças de seta) uma grande Amb dendrito do neurônio motor que irradia a partir Amb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: no local da injecção e conexões bidirecionais adicionais reveladas por injeções BDA não vistos com traçado PRV transynaptic. (a) amina dextrano (BDA) injeções biotinilados bilaterais (preto) no córtex motor primário (M1) revelou um denso campo terminal de projeção (preto) no striatum subjacente. (b) Cortiaxônios CAL de M1 terminar no núcleo lateral ventral do tálamo (VL); Um aglomerado de células do tálamo (marrom escuro e marcado pela ponta de seta branca) que o projeto de volta à região de cantar o M1 também é observada em VL. A cápsula interna (CI) foi marcado axónios provenientes do córtex. Barras de escala: 1 mm para um; 200 mm para b. (Modificado de Arriaga et al. 2012). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma série de questões que devem ser levadas em consideração ao planejar uma experiência usando PRV152 4,21. Mais importante ainda, vírus da pseudo é letal. Como mencionado anteriormente, grandes macacos, incluindo os seres humanos não são suscetíveis à infecção, mas cuidado apropriado deve ser exercido para proteger outros animais. Ratos adultos normalmente sobreviver cinco a sete dias após a inoculação com a estirpe atenuada PRV152. Portanto, PRV152 não é adequado para experiências que requerem tempos de sobrevivência superiores a uma semana. Além disso, os animais infectados geralmente exibem sinais de doença durante o período de sobrevivência, limitando desse modo a utilidade para experiências que requerem PRV152 observação do comportamento normal.
Além disso, PRV152 desencadeia uma resposta imunitária citotóxica 22. Uma vez que a replicação e a transmissão do vírus e são titer- 4 dependente do tempo, o padrão de neurónios revelados por detecção imunoquímico de Viraproteínas L ou o gene repórter eGFP irão mudar ao longo do decurso do período de sobrevivência de células de progredir através de fases da infecção. Cinco dias após a inoculação no músculo, 3 ou 4 Rd neurónios th ordem pode ser detectável, mas os primeiros neurónios podem tornar-se infectados apoptótica. Assim, o tempo de sobrevivência óptima deve ser determinado experimentalmente para cada estudo. Recomenda-se a realização de uma análise de séries temporais para determinar a progressão da infecção através de um circuito eo melhor ponto de tempo para a rotulagem de neurônios específicos de interesse sem arriscar celular ou animal a morte.
Um dos factores mais importantes que afectam o sucesso de rotulagem com PRV é o título viral. Foram relatados redução acentuada no número de células infectadas quando diminuir a título de PRV-Bartha de 1,4 x 10 5 7 x 10 4 ufp / mL 23. Portanto, recomendamos o uso de títulos acima de 1 x 10 7 ufc / ml e manutenção de alíquota virus a -80 ° C até ser utilizado para manter a sua infecciosidade. Mesmo quando se utiliza um elevado título, deve-se ter em mente que nem todos os tipos de células pode ser permissiva para infecção. Portanto, as células identificadas por rastreio de PRV pode não ser completamente representativa das entradas para um alvo infectada.
O método centra-se descrito no utilitário de PRV para analisar alvos que regulam centrais eferentes periféricos, especificamente, por meio de músculos circuitos multi-sinápticos. Outros circuitos neurais, tais como visual e autonômica 24, são bem adequados para esta técnica, porque eles também podem ser infectados por inoculação periférica. No entanto, PRV pode ser usado efetivamente para injecção directa no sistema nervoso central, quando algumas questões são cuidadosamente considerada, como discutido extensivamente em uma avaliação prévia 3. Esses autores mencionam que PRV-Bartha e tensões relacionados extensivamente preencher os mandris dendríticas de neurônios infectados, tornando PRV152 bem adequado para identifying aferentes para dendritos distais. Esta propriedade do vírus torna a técnica descrita particularmente útil para deduzir uma lista preliminar de entradas para os dendritos distais localizadas fora da região do corpo que é tipicamente de células estudadas com marcadores convencionais.
Quando o rastreamento de alvos periféricos, inervação simpática deve ser considerada uma possível confundem. Por isso, recomendamos que, inicialmente, comparando padrões de rotulagem em animais normais e simpatectomizados para determinar se PRV rotulagem de insumos simpáticos vai afetar a interpretação dos resultados.
Sinal em células infectadas de eGFP expressas por PRV152 podem ser visualizados directamente através de microscopia de fluorescência, sem a necessidade de imuno-histoquímica; no entanto, este sinal é sujeito a foto-branqueamento e degrada ao longo do tempo. A principal vantagem da imuno-histoquímica combinada com o DAB coloração para o traçado da via é a natureza permanente dos produtos da reacção. Embora ié também possível a utilização de anticorpos contra as proteínas virais, para detectar células infectadas, diferentes elementos virais não necessariamente co-localizar uns com os outros 25 ou com o sinal de eGFP. Portanto, recomendamos o uso de anticorpos contra eGFP para preservar o padrão de marcação observado por fluorescência.
Porque todos os aferentes a uma célula infectada tendem a se tornar condutas para passagem transsináptica de vírus, incluindo aqueles que entre em contato com dendritos distais, que considerou importante para selecionar um marcador convencional que mancha de forma confiável tais dendrites para confirmação posterior de relés no circuito identificado. Nós selecionamos CTb para este fim, e descobriu que ele oferece boa coloração dos dendritos e forte contraste tanto com o neuropil circundante e os axônios descem do córtex motor. Embora seja possível inverter a coloração dos axônios coradas e corpos celulares (BDA = marrom; CTb = preto), descobrimos que preto fornece a melhor contrast para visualizar os axônios de calibre fino.
Um ponto importante a ter em mente ao interpretar padrões de rotulagem BDA é que BDA10kDa é usado principalmente como um traçador anterógrado mas também pode rotular células retrogradamente (Figura 6) 6. Além disso, BDA pode ser transportado retrogradamente em uma célula, em seguida, distribuídos ao longo de uma garantia axônio para outro site terminal. Se esses colaterais de axónios estão presentes na mesma região como o alvo de projecção da região injectada, em seguida, é difícil distingui-los de marcação anterógrada.
A nota técnica final é que o metal seringa 34 G Nanofil desempenho melhor do que uma multa calibre, puxado pipeta de vidro para injectar traçadores em músculos, mas causa muito dano mecânico quando usado para injeções intracerebrais em pequenos animais. Por isso recomendamos utilizar a seringa de metal para injecções periféricas ea pipeta de vidro para injectáveis centrais.
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Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Toshio Terashima, da Universidade de Kobe, no Japão, para o ensino da técnica de cirurgia de laringe, e Dr. Lynn Enquist da Universidade de Princeton para o fornecimento de PRV-Bartha. A pesquisa foi financiado pelo NIH prêmio pioneiro DP1 OD000448 para Erich D. Jarvis e um prêmio NSF Graduate Research Fellowship para Gustavo Arriaga. Dados do adequadamente creditado trabalho anterior são usadas sob a PLoS ONE acesso aberto licença Creative Commons (CC-BY), em conformidade com as políticas editoriais da revista.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
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