Abstract
מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV) 1. PRV לא להדביק קופים גדולים, כולל בני אדם, כך שזה הוא נפוץ ביותר במחקרים על יונקים קטנים, בעיקר מכרסמים. PRV152 מתח pseudorabies מבטא את חלבון פלואורסצנטי הגן המשופר הירוק (eGFP) כתב ורק חוצה סינפסות הפונקציונלית retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 2,3. יש זני PRV אחרים מאפייני מיקרוביולוגים שונים ויכולים להיות מועברים בשני הכיוונים (PRV-בקר וPRV-קפלן) 4,5. פרוטוקול זה יעסוק באופן בלעדי עם PRV152. על ידי אספקת הווירוס באתר היקפי, כגון שרירים, ניתן להגביל את כניסתם של הווירוס לתוך tהוא המוח באמצעות סדרה ספציפית של נוירונים. הדפוס וכתוצאה מכך של אות eGFP בכל רחבי המוח אז פותר את הנוירונים הקשורים לתאים הנגועים בתחילה. כטבע חילק של מעקב transsynaptic עם pseudorabies וירוס גורם לפרש חיבורים ספציפיים בתוך רשת מזוהה קשה, אנו מציגים שיטה רגישה ואמינה המעסיקה אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB) למאשרים את הקשרים בין התאים המזוהים באמצעות PRV152. זיהוי immunochemical של BDA וCTB עם peroxidase וDAB (3, 3'-diaminobenzidine) נבחר בגלל שהם יעילים בחושפים תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 6-11.
Introduction
מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח המכרסמים על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV), במיוחד הזן המוחלש PRV-ברטה שתוארה לראשונה בשנת 1961 12 כאן., אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי הייצוג בקליפת המוח המוטורי של שרירים ספציפיים או קבוצות שרירים באמצעות מתח pseudorabies רקומביננטי וירוס (PRV152) המבטא את גן כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק המשופר (eGFP) 2. השיטה המתוארת מנצלת את ההתנהגות של וירוסי neurotropic, אשר מייצרים צאצאים זיהומיות שסינפסות הצלב להדביק נוירונים אחרים בתוך מעגל פונקציונלי 3,4,13. PRV152, שהוא isogenic עם PRV-ברטה, רק חוצה סינפסות retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 3.5 </ Sup>. על ידי שליטה מדויקת באתר ההיקפי של זיהום ניתן להגביל את הכניסה של הווירוס למוח דרך משנה ספציפי של הנוירונים מוטוריים. כרצף הווירוס מדביק רשתות של תאי עצב מחוברים, וכתוצאה מכך הדפוס של אות eGFP בכל רחבי המוח לאחר מכן לפתור את הרשת של נוירונים המחוברים לתאים הנגועים בתחילה.
יתרון נוסף של שימוש בוירוס למעקב עצבי הוא ההגברה של חלבון הכתב (eGFP במקרה זה) בתאים נגועים. הגברה אות זו מספקת רמת הרגישות המאפשרת זיהוי של תחזיות אפילו דלילות. לדוגמא, הקרנה דלילה מהקורטקס מוטורי vibrissa לתאי העצב מוטורי פנים השליטה השפם נמצאה בחולדות באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הביע באופן ויראלי 14; מחקרים קודמים לא הצליחו למצוא הקרנה זה באמצעות קליעים נותבים קלאסיים בלי ההגברה גן כתב 11,15. לרוע המזל, רבים וקטורי מעקב נגיפיים, כמו זה המשמש במחקר המצוטט, לא לחצות סינפסות, וכך להגביל את השימוש בם לאיתור מעגלים רב-סינפטי.
תוך הצגת יתרונות ברורים לזיהוי הרשת של תאים המשתתפים במעגל מנוע, הטבע ממוינות transsynaptic התחקות עם PRV-152 הופך את פרשנות חיבורים ספציפיים בתוך המעגל הקשה. לכן, אנו מציגים שיטה פשוטה לאימות חיבורים ספציפיים בתוך מעגלים זוהו באמצעות PRV-152 על ידי דו-תיוג באמצעות אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB). השימוש בשילוב של BDA וCTB הוא גישה מבוססת היטב לאיתור קשרים בין קבוצות הספציפיות של נוירונים 6-8,11. כאשר נעשה שימוש יחד, ניתן דמיינו שני קליעים נותבים אלה באותו הסעיף באמצעות DAB שני צבעים (3, 3'-diaminobenzidine) הליך 16. משקל מולקולרי גבוה BDA (BDA10kDa) נבחר לפרוטוקול זה כי זה yields תיוג מפורט של תהליכים עצביים 6,7,9. יתרונות נוספים של BDA10kDa כוללים את הבאים: זה מועבר באופן מועדף בכיוון אנטרוגרדית 6-8; זה יכול להיות מועבר על ידי iontophoretic או הזרקה בלחץ 6-8; ניתן דמיין ידי HRP-biotinylated avidin פשוט (ABC) הליך זה 17; וניתן הדמיתו על ידי אור או מיקרוסקופי אלקטרונים 6,7,18. זיהוי immunochemical של CTB עם peroxidase וDAB נבחר לתיוג מדרדר של motoneurons כי הוא יעיל לגילוי תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 10,19. לאחרונה השתמשו בגישה זו כדי לזהות את המסלול המוטורי הקולי בעכברים ולחשוף חיבור דליל מקליפת המוח מוטורי ראשונית לתאי העצב המוטוריים בגרון, שהונח בעבר להיעדר 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל נהלי בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דיוק.
וירוס 1. אחסון Pseudorabies
- אנו משיגים נגיף חי (PRV152) מהמעבדה של ד"ר לין אנקוויסט באוניברסיטת פרינסטון בכייל של 1 x 10 9 pfu / מ '. הפרוטוקול כדי ליצור את הווירוס כבר פורסם 2.
- Aliquot הווירוס ב 20 μl לכל צינור בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL-2 ולאחסן ב -80 ° C בתנאי בטיחות ביולוגית מתאימים.
- להפשיר aliquot של PRV מייד לפני הזרקה.
2. הכנת כירורגי לזריקות לתוך שריר
- לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ"ג / קילוגרם קטמין, 10 מ"ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane.
- להגן על הקרניות עם משחת עיניים.
- הכן tהוא אתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר כירורגית עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים). הקפד להשתמש בסדינים מעוקרים כדי לכסות אזורים כירורגית. הקפד לדבוק טכניקות סטרילי לאורך כל ההליכים.
- לעשות חתך בעור ולחשוף את השרירים של עניין. לדוגמא, כדי לגשת לשרירי גרון cricothyroid יש צורך להסיר את החלק ראשון שמעליה של שריר sternohyoid.
- לאטום כל שרירי transected עם דבק רקמות VetBond.
3. הזרקה של PRV לשריר
- טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון PRV מופשר טרי, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ולעגן אותה בזהירות על מכשיר stereotaxic.
- לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שיוצא קצה microsyringe. בטל נוזל כפסולת bioharzard.
- באמצעות microp stereotaxicמכשיר ositioning למקם בזהירות את קצה microsyringe לתוך השריר של עניין ולמלא לאט השריר עד נפיחות קלה גלויה. שיעור ההזרקה ישתנה בהתאם לגודל של השריר והנפח להיות מוזרק. לדוגמא, חמש זריקות של 200 NL (סה"כ μl 1) בשיעור של 4 NL / sec צריכים להיעשות בנפרד 1 דקות באותו האתר כדי למלא את שריר cricothyroid. הזז את המזרק לשריר הבא של ריבית (cricoarytenoid הרוחב במקרה זה) ולחזור על תהליך ההזרקה. לנקב כל שריר פעם אחת בלבד.
- לחזור microsyringe אחרי חמש דקות.
- חותם את ההפסקה בfascia באמצעות דבק רקמות VetBond.
- אחרי הכל הזריקות הושלמו, לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות VetBond. בהתאם להנחיות שלך המקומיות institional שימוש בבעלי חיים, תפרים או קליפים פצע ניתן להשתמש.
- צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש על ידי yההנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלנו.
- לאחר זמן הישרדות בניסוי נקבע (במקרה זה, 90 שעות לתייג 2 nd להזמין נוירונים בקליפת המוח), להקריב את בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital ותנקבנה transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS.
- הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות.
- Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות.
4. immunochemical איתור של eGFP
- חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome הזזה ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS. חלקים רזים יותר, למשל 30 מיקרומטר, ניתן להשתמש כאשר מכתימים סעיפים רכובים.
- להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור.
- לחסום אנטיגנים שאינם ספציפיים בסעיפים למשך 30 דקות ב PBS המכיל 0.3% Tween 20 עם סרום עז נורמלי מקיט VECTASTAIN העלית (VE ערכה).
- לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני עז נגד ארנב מVE ערכה ב RT.
- הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC מVE ערכה ב RT.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2.
- חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%).
- נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount.
- תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ. מוצר תגובת DAB insidדואר התאים אמורים להופיע חום. תמונות דיגיטליות יכולות להיות צבע ההפוך כדי להדגיש תהליכים בסדר.
5. הכנת כירורגי להזרקה של קליעים נותבים לאזורים במוח שהתגלו על ידי PRV איתור
- לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ"ג / קילוגרם קטמין, 10 מ"ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane.
- להגן על הקרניות עם משחת עיניים.
- תקן את הראש במסגרת stereotaxic מתאימה.
- הכן את האתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים).
- לעשות חתך בקרקפת ולחזור העור מעל האזור במוח של עניין.
- בצע craniotomy קטן בקואורדינטות stereotaxic המתאימות. לדוגמא, את הקואורדינטות לקליפת המוח מוטורי המחובר laryngeally זוהה על ידי התחקות PRV בהעכבר בוגר n הם 1.2 מ"מ לרוחב ו -0.2 מ"מ מקורי לגבחת.
6. הזרקה של אמיני Dextran Biotinylated למוח
- הכן אמינים 7.5% biotinylated dextran (BDA) על ידי המסת 25 מ"ג BDA (10,000 מגוואט) בשנת 333 μl של תמיסת מלח סטרילית.
- טען את מערכת micropipette Nanoject השנייה עם פתרון BDA מספיק לזריקות המתוכננות.
- לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שהוא יציאת קצה micropipette.
- שימוש במכשיר micropositioning stereotaxic להוריד בזהירות את קצה micropipette לאזור במוח של עניין ולהזריק לאט BDA. התאם את קצב ההזרקה תלוי בגודל של האזור כדי להיות מתויג. לדוגמא, 12 זריקות של 4.6 NL צריכים להיות הסתפקו בארבעה מקומות שונים זה מזה 0.2 מ"מ (כיוון rostro- הזנב) כדי לכסות את הקורטקס המוטורי המחובר laryngeally בעכברים בוגרים. סופי נפח ההזרקה צריך להיות מותאם לפי הגודל של האזור במוח של עניין, תוך התחשבות כי תווית עלולה להתפשט מליבת ההזרקה על ידי דיפוזיה דרך רקמת המוח ולאורך התהליכים של נוירונים שכותרתו.
- לאטום craniotomy באמצעות מלט שיניים, ולסגור את הפצע בקרקפת באמצעות דבק רקמות VetBond.
- צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך.
7. הזרקה של רעלן למקטע B כולרה לשריר
- הכן 1% ב מקטע רעלן כולרה (CTB) על ידי המסת 1 מ"ג של CTB בשל תמיסת מלח סטרילית 100 μl.
- שישה ימים לאחר הזרקת BDA לתוך המוח, לבצע הכנה כירורגית כפי שתואר לעיל לזריקות לתוך שריר PRV.
- טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון CTB, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ובזהירות לעלות אותו על מכשיר stereotaxic.
- בצע microinjections לתוך השריר (ים) של העניין כדה בעברscribed לPRV.
- צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך.
- שלושה ימים לאחר הזרקת CTB, להקריב בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital וינקב transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS.
- הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות.
- Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות.
8. איתור של BDA וCTB באותו הסעיפים
- חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS.
- להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור.
- הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC ב RT. לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine), 0.015% H 2 O 2, ושל 0.05% כלוריד ניקל. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע שחור.
- חלקי בלוק למשך 30 דקות ב PBS המכילות 0.3% Tween 20 עם סרום ארנבת רגיל מקיט VECTASTAIN העלית.
- דגירה חסמה חלקים לשעה 2 בעז אנטי CTB (1: 10,000) ב RT.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני ארנב נגד עז מVE ערכה ב RT.
- הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם למשך 30 דקות בתמיסת ABC ב RT.
- לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח לעד 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3"-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע חום.
- חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%).
- נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount.
- תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מכתים לeGFP צריך להתחיל להראות אות חלשה בנוירונים מוטוריים ראשוניים כ 72 שעות לאחר הזרקה לתוך שריר PRV152. השכפול והתחבורה transsynaptic של וירוס הם titer- ותלוי זמן 4. כ -90 שעות לאחר ההזרקה, צביעת eGFP תגלה אות חזקה בתאים נגועים כדי 2 nd. פעמים הישרדות ארוכות יותר יגלו -3 ותאים מסדר גבוהים יותר, אך פעמים הישרדות מוגבלות על ידי הקטלני של PRV בכ -5 ימים לאחר החיסון.
איור 1 א מציג נוירונים נגועים בPRV152 להביע eGFP בגרעין לא קונקרטי, שבו שוכן תאי העצב מוטוריים בגרון, 94 שעות לאחר ההזרקה של PRV152 לשתיים משבעת שרירי הגרון. מכיוון שהנגיף נכנס למוח דרך תאי עצב שמעצבב את השרירים הנגועים, בריכות אחרות הפקת קול הנוירון מוטורי, כגון גרעין hypoglossal, לא להביע eGFP (איור 1).
איור 3 מראה נוירונים הקדם-מוטורית נגועים בקליפת המוח המוטורי להביע נגדי eGFP לאתר ההזרקה ההיקפי. בגלל PRV152 מתפשט במעגלים רב-סינפטי לפגוע בתאי עצב מוטוריים בגרון בגרעין לא קונקרטי, זה יכול בהדואר להניח שרק האוכלוסייה של תאים המרכיבים את קליפת המוח המוטורי ייצוג של שרירי הגרון נדבקו. חוסר אות eGFP בשאר הסעיף המוצג (ורוב המוח הקדמי לא מוצגים) מדגים את הספציפיות של התיוג.
איור 4 מראה BDA שכותרתו האקסונים בגזע המוח ברמה של לא קונקרטי גרעין. האקסונים ליצור קשר עם הנוירונים המוטוריים CTB-החיוביים שכותרת retrogradely על ידי זריקות לשרירי גרון. האקסונים מוצגים יצירת ורידים וboutons מסוף המשוער ליד דנדריטים וסומה של הנוירונים מוטוריים בגרון. ניסויים נוספים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או אלקטרופיזיולוגיה נדרשים כדי לקבוע אם ורידים אלה מייצגים boutons סינפטי.
5a איור מראה הזרקה דו צדדית של BDA להציב לתוך הקורטקס המוטורי המחובר laryngeally כפי שזוהה על ידי transynaptic מדרדר מעקב עם PRV152. בק ause BDA הוא לא directionally ספציפי, שני חיבורים מביא וefferent עשויים להיות מתויג. לדוגמא, שני שדה הקרנה (אנטרוגרדית) וגופי תא תווית (מדרדר) נראים בתלמוס (איור 5).
איור 1: נוירונים נגועים עם PRV152 להביע EGFP (ירוק) וכולין motoneurons immunopositive acetyltransferase (אדום) ב( א) לא קונקרטי (השגריר) ו- (ב) Hypoglossal (XII) גרעינים של גזע המוח העכבר 94 שעות לאחר ההזרקה של PRV152 ל שרירי Cricothyroid ורוחב Cricoarytenoid גרון. RF = מבנה הרשתי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
g2.jpg "/>
איור 2: חלבון פלואורסצנטי (לבנים ירוקים זיהום וירוס Psuedorabies (PRV152) בגזע המוח של עכבר שעות 86 לאחר הזרקת PRV152 לשרירי Cricothyroid ורוחב Cricoarytenoid גרון (א) נוירונים המבטאים משופרים; צבעים הפוכים מתמונות brightfield מקוריות סעיפים מוכתמים. ) בipsilateral לא קונקרטי (השגריר) גרעין לשריר המוזרק, היווצרות סביב רשתי (RF) והגרעין הבודד (סול), אבל לא את גרעין hypoglossal (יב). (ב) השגריר וinterneurons רשתי בהגדלה גבוהה יותר (חיצים אדומים, גופי תא בRF). ברים סולם: 1 מ"מ ל; לב 100 מיקרומטר. (השתנה מאריאגה et al. 2012). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
tp_upload / 50,672 / 50672fig3.jpg "/>
איור 3:. בקליפת המוח פירמידת נוירונים להביע EGFP (לבן; צבעים הפוכים מתמונות מקוריות brightfield סעיפים מוכתמים) בשכבת V בקליפת המוח של M1 לאחר הזרקה של וירוס Psuedorabies (PRV152) לשרירי Cricothyroid ורוחב Cricoarytenoid גרון ברים סולם: 1 מ"מ ל לוח ראשי; 200 מיקרומטר להבלעה. (השתנה מאל אריאגה et. 2012).
איור 4:. M1 האקסונים בגזע המוח (א) צריכת חשמל נמוכה של גזע המוח סעיף העטרה המכיל תאי עצב מוטוריים שכותרת CTB בשגריר (חום) מהזרקה בשרירי גרון ואקסונים M1 (שחור) מהזרקה של BDA לM1. ניתן לראות אקסונים שכותרת BDA במסלול cortico-פירמידה (PYR). קיצורים: השגריר, לא קונקרטי גרעין; PYR, פירמידות; MRF, rהיווצרות eticular ישירות המדיאלי לשגריר; DRF, גב מבנה הרשתי לשגריר. (ב) בהגדלה גבוהה של BDA כותרת האקסון (שחור, ראשי חץ) מM1 שיוצר קשר (חץ) על הנוירונים מוטוריים השגריר (CTB חום). (ג) M1 האקסונים דנדריט הנוירון מוטורי גדול השגריר שמקרין החוצה משגריר (שחור) רץ לאורך (חיצים) וליד (ראשי חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: אתר הזרקה וקשרים דו-כיווניים נוספים נחשפו על ידי זריקות BDA לא ראו במעקב transynaptic PRV. (א) זריקות בילטראליים biotinylated האמין dextran (BDA) (שחורה) בקליפת המוח מוטורי הראשונית (M1) חשפו שדה צפוף מסוף הקרנה (שחורה) בסטריאטום הבסיס. (ב) קורטיהאקסונים קאל מM1 לסיים בגרעין לרוחב הגחון של התלמוס (VL); מקבץ של תאי התלמוס (חום כהה ומסומן על ידי ראש חץ לבן) פרויקט שיחזור לאזור שירה M1 הוא ציין גם בVL. הכמוסה הפנימית (IC) הגדירה את האקסונים המגיעים מקליפת המוח. ברים סולם: 1 מ"מ ל; 200 מיקרומטר לב. (השתנה מאריאגה et al. 2012). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש מספר נושאים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסוי באמצעות PRV152 4,21. והכי חשוב, pseudorabies הווירוס קטלני. כפי שהוזכר קודם לכן, קופים גדולים, כולל בני אדם אינם רגישים לזיהום, אך הטיפול מתאים חייב להיות מופעל כדי להגן על בעלי חיים אחרים. עכברים בוגרים לשרוד בדרך כלל 5-7 ימים לאחר חיסון עם מתח PRV152 המוחלש. לכן, PRV152 אינו מתאים לניסויים הדורשים פעמים הישרדות ארוכות יותר משבוע אחד. יתר על כן, בעלי חיים נגועים בדרך כלל להציג סימנים של מחלה בתקופת ההישרדות, וכך להגביל את השירות של PRV152 לניסויים הדורשים תצפית של התנהגות נורמלית.
בנוסף, PRV152 מפעיל תגובה חיסונית ציטוטוקסיות 22. בגלל השכפול וההעברה של הנגיף titer- ותלוי זמן 4, הדפוס של נוירונים נחשף על ידי זיהוי immunochemical של Viraחלבוני L או גן כתב eGFP ישתנו במהלך תקופת הישרדות תאי התקדמות דרך שלבים של זיהום. חמישה ימים לאחר החיסון בשריר, 3 rd או 4 תאי עצב כדי ה עשוי להיות לגילוי, אבל נוירונים הנגועים המוקדמים עלולים להפוך אפופטוטיים. כך זמן ההישרדות האופטימלי צריך להיקבע באופן ניסיוני לכל מחקר. מומלץ לבצע ניתוח בזמן סדרה כדי לקבוע את ההתקדמות של זיהום באמצעות מעגל ונקודת הזמן הטוב ביותר לתיוג נוירונים הספציפיים של עניין מבלי להסתכן במוות של תאים או בבעלי חיים.
אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על ההצלחה של תיוג עם PRV הוא כייל הנגיף. הפחתות הניכרות במספרם של תאים נגועים דווחו כאשר יורדים כייל של PRV-ברטה מ1.4 x 5-7 אוקטובר x 10 4 pfu / מיליליטר 23. לכן, אנו ממליצים titers באמצעות מעל 1 x 10 7 מיליליטר ושמירת aliquoted vi / pfuRus ב -80 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש כדי לשמור על infectivity. גם בעת שימוש בכייל גבוה, יש לזכור כי לא כל סוגי התאים יכולים להיות מתירנית לזיהום. לכן, התאים המזוהים על ידי מעקב PRV לא יכולים להיות לגמרי נציג של התשומות ליעד נגוע.
השיטה המתוארת מתמקדת בשירות של PRV לניתוח efferents המרכזי המסדיר מטרות היקפיים, במיוחד שרירים, דרך מעגלים רב-סינפטי. מעגלים עצביים אחרים, כגון חזותי ואוטונומי 24, מתאימים גם לטכניקה זו, משום שהם יכולים גם להיות נגועים על ידי חיסון היקפי. עם זאת, PRV ניתן להשתמש ביעילות להזרקה ישירה לתוך מערכת העצבים המרכזית, כאשר כמה בעיות נחשבות בזהירות, כפי שנדונו בהרחבה בביקורת לפני 3. מחברים אלה להזכיר כי PRV-ברטה וזנים הקשורים בהרחבה למלא את סוכות דנדריטים של נוירונים נגועים, מה שהופך את PRV152 גם מתאים לidentifying afferents לדנדריטים דיסטלי. מאפיין זה של הנגיף הופך את הטכניקה המתוארת שימושית במיוחד עבור הסיק רשימה ראשונית של תשומות לדנדריטים דיסטלי ממוקמים מחוץ לאזור גוף תא שלמדה בדרך כלל עם קליעים נותבים קונבנציונליים.
כאשר התחקות ממטרות היקפית, עצבוב אוהד צריך להיחשב לבלבל אפשרי. לכן, אנו ממליצים בתחילה השוואת דפוסי תיוג בבעלי חיים נורמלים וsympathectomized כדי לקבוע אם תיוג PRV תשומות אוהדות ישפיע פרשנות של התוצאות.
אות בתאים נגועים מeGFP הביעו ידי PRV152 ניתן הדמיה ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא הצורך באימונוהיסטוכימיה; עם זאת, אות זה כפוף לצילום הלבנת והמדרדרת לאורך זמן. היתרון העיקרי של אימונוהיסטוכימיה בשילוב עם DAB מכתים לאיתור דרכי הוא הטבע הקבוע של תוצרי התגובה. למרות שזה אניזה גם אפשרי להשתמש נוגדנים נגד חלבונים נגיפיים כדי לזהות תאים נגועים, אלמנטים נגיפיים שונים לא בהכרח תשתפו למקם בכל 25 אחרים או עם אות eGFP. לכן, אנו ממליצים על שימוש בנוגדנים נגד eGFP לשמר את דפוס התיוג נצפה על ידי הקרינה.
כי כל afferents לתא נגוע הן צפויות להפוך לצינורות למעבר transsynaptic של וירוס, כוללים אלה שקשר עם דנדריטים דיסטלי, אנחנו נחשבים זה חשוב כדי לבחור נותב קונבנציונלי שמכתים באופן מהימן דנדריטים כזה לאישור בדיעבד של ממסרים במעגל המזוהה. אנחנו נבחרו CTB למטרה זו, ומצאנו שהיא מספקת צביעה טובה של דנדריטים וניגוד חזק עם שתי neuropil שמסביב ואת האקסונים יורדים מקליפת המוח המוטורי. למרות שניתן להפוך את הצבע של אקסונים המוכתמים וגופי תא (BDA = חום; CTB = שחור), אנו מוצאים כי שחורים מספק שיתוף הטוב ביותרntrast הדמיה האקסונים קליבר בסדר.
נקודה חשובה שיש לזכור כאשר לפרש דפוסי תיוג BDA היא שBDA10kDa משמש בעיקר כנותבה אנטרוגרדית אלא גם יכול לתייג תאי retrogradely (איור 6) 6. יתר על כן, יכול להיות מועבר BDA retrogradely לתא אז חילק לאורך האקסון בטחונות לעוד אתר מסוף. אם בטחונות האקסון אלה נמצאים באותו האזור כיעד ההשלכה של האזור המוזרק, אז זה קשה להבדיל ביניהם לבין תיוג אנטרוגרדית.
הערה טכנית סופית היא שמזרק המתכת 34 G NanoFil מבצע טוב יותר מקליבר בסדר, משך פיפטה זכוכית להזרקת קליעים נותבים לשרירים, אבל גורם ליותר מדי נזק מכאני בעת שימוש לזריקות תוך-מוחיות בבעלי חיים קטנים. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש במזרק המתכת לזריקות היקפיים ופיפטה הזכוכית לזריקות מרכזיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר הטושים Terashima של אוניברסיטת קובה, יפן, להוראת טכניקת הניתוח בגרון, וד"ר לין אנקוויסט של אוניברסיטת פרינסטון לאספקת PRV-ברטה. מחקר נתמך על ידי הפרס חלוץ NIH DP1 OD000448 לאריך ד ג'רוויס ופרס NSF בוגר מלגת המחקר לגוסטבו אריאגה. דמויות מהעבודה קודמת זוכה כראוי משמשות תחת רישיון PLoS ONE גישה פתוחה Creative Commons (CC-BY) בהתאם למדיניות העריכה של כתב העת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoFil Microinjection System | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G option |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | 1001936060 | |
| Betadine Swab Stick | Cardinal Health | 2130-01 | 200 count |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Biotinylated dextran amines | Invitrogen | D-1956 | 10,000 MW |
| Pseudorabies virus | Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) | PRV152 | Titer >1 x 107 |
| Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) | List Biological Laboratories | 703 | |
| Cholera Toxin B Subunit | List Biological Laboratories | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D5905 | 10 mg tablets |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamine HCl & Xylazine HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml & 6 mg/ml |
| Nickel chloride | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Phosphate buffer | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 534056 | Histological grade |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat) | |
| Optixcare opthalmic ointment | Vet Depot | 1017992 |
References
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
- Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
- Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
- Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
- Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
- Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
- Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
- Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
- Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
- Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
- Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
- Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).
- Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
- Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
- Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
- Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).
