Summary
dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。
Abstract
dsRNAを発現するワーム細菌を供給することにより、RNA干渉は、C.での遺伝子機能を評価するための有用なツールであった虫 。少数の遺伝子がノックダウンの標的とされるときにこの戦略はうまく機能するが、大規模な給電スクリーンはそれらの有用性を制限する、可変ノックダウン効率を示している。我々は、以前に公表されたRNAiノックダウンプロトコルを解体させ、ノックダウンの主な原因は、動物に与え細菌からのdsRNAをコードするプラスミドの喪失に起因し得ることを見出した。これらの観察に基づいて、我々は非常に効率的な、ハイスループットノックダウンを達成するために、プラスミド損失を低減または排除するのdsRNA給餌プロトコルを開発した。我々は、このプロトコルはCのダウン、堅牢で再現性のあるノックを生成することを実証ニューロンを含む複数の組織タイプで遺伝子を、 線虫 、および大規模なスクリーニングにおいて効率的なノックダウンを可能にする。このプロトコルは、市販のdsRNA送りを使用していますライブラリとライブラリを複製したdsRNAの画面を実行するために必要なすべての手順を説明します。プロトコルは任意の高度な機器の使用を必要としないので、任意C.によって行うことができるラボエレガンス 。
Introduction
Cの歴史的には、遺伝子スクリーニングエレガンスは、DNA内にランダム突然変異を作成するために、例えば、エチルメタンスルホネートなどの化学変異原で動物を処理することによって行われている。変異誘発された動物の子孫またはgrandprogenyは、その展示を希望する異常な表現型を分離している。表現型を引き起こす原因となる変異は、次いで、労働集約的なマッピング手順を介して、または変異型ワームの全ゲノムを配列決定することによって同定される。そこに、彼らは両方のゲイン関数のと機能喪失型の表現型を引き起こすことができるワームゲノム内の恒久的な損傷を作成するような化学的突然変異誘発画面を実行するには多くの利点がありますが、マッピング手順が遅く、高価である。
二本鎖RNA干渉（dsRNAi）の重要な生物学的過程に関与する遺伝子を同定するための代替手段を提供する。この方法では、内因性遺伝子のコード配列に一致するdsRNAはウォームに導入される。dsRNAはガイドが破壊1のためにそれらを標的化、マッチング内因性mRNAを見つけて結合するように機能する小さな（21〜22ヌクレオチド）RNAを生成するために、 生体内で処理される。この手順は、比較的迅速であるが、dsRNAがmRNAのではなく、DNAを標的とするため、唯一の還元の機能表現型は、このアプローチを使用して観察される。
動物へのdsRNAの導入は、dsRNAの3匹の動物を浸漬することにより、またはdsRNA 4を発現する動物の細菌を供給することにより、2のdsRNAの直接注射により達成することができる。これらの送達方法はそれぞれの動物のほとんどの細胞は、SID-1は、dsRNA 5のインポートが可能な膜貫通チャネルを表現するなどの全身のノックダウン効果を引き起こす。当初の時点で、個々の遺伝子の発現のいずれかをノックダウンする逆遺伝学的アプローチとして用い、2つの給電ライブラリーの開発は、現在、大規模な遺伝子スクリーニングを可能にする。市販のdsRNAはライブラリはBAが含まれているすべてのCの 55パーセント以上87パーセントのどちらかを表現cterialクローン虫の遺伝子6、7。
残念ながら、大規模なdsRNAi送り画面は、多くの場合、変数のノックダウン効率8月10日になる。 RNAiによるノックダウンの絶対レベルは容易に測定されていないが、大規模な画面で観察減少ノックダウン効率は、RNAiによる分解を免れる残留遺伝子特異的なmRNAによって引き起こされている必要があります。これは、順番に、これらの画面で動物に供給される細菌からのdsRNAのプラスミドの損失の直接の結果であってもよい。ノックダウン効果を給餌した動物11を制御するために比較した場合、（もしあれば）は、この考えを支持する、動物は、細菌の50％のみが標的遺伝子に対するdsRNAを発現する細菌の混合物を供給し、劇的に減少を示す。 Cのほとんどの遺伝子としてdsRNAi画面を実行するときに遺伝子ノックダウンの程度は重大な関心事になるエレガンス haplosufficientであり、したがって、遺伝子発現は少なくとも50％のtだけ小さくしなければならないO機能喪失は12を表現型の原因。
我々は、大規模なスクリーニングを行うために以前に公開された給餌プロトコルを使用し、他の8〜10によって報告された同一の変数ノックダウン効果を見出した。考えられる原因の検索では、画面内の動物に与えた細菌の60％近くは、dsRNAのプラスミドを失っていたことがわかった。当社は、飛躍的に低減または排除するプラスミドの損失を大幅ノックダウン効率を改善し、ライブラリの重複やスクリーニングプロトコルを開発した。このプロトコルは、C.大規模スクリーニングを実施するのに適しているエレガンスとは、市販のdsRNAライブラリーのどれかをスクリーニングするために使用することができる。このプロトコルを使用して、我々は、画面中、動物に供給された細菌の本質的に100％がdsRNAをコードするプラスミドを保持し、試験した全ての組織における機能の表現型の堅牢で高度に浸透損失を引き起こすことを発見。
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Protocol
注意：このプロトコルは、組織型の種々様々な生物学的プロセスに必要な遺伝子を同定するために使用することができる。画面の中の必要な品質対照として、動物は、標的組織におけるRNAi効果を実証するために、制御dsRNAを発現する細菌摂食の両方に正および負である。
他の公開給餌プロトコルは、50μg/ mlのアンピシリンまたは25μg/ mlのカルベニシリン8月10日のいずれかの存在下でdsRNAを発現する細菌を育てる。我々は、これらのいずれかの条件の下で成長した細菌は、高周波数でのdsRNAプラスミドを失うことを見出した。実際に、我々は、細菌をアンピシリン、非常に高い濃度（最大2 mg / ml）を、細菌の50％以上で一晩増殖させた場合であっても、もはやプラスミドを含まないことを見出した。カルベニシリンの成長は一般的に、プラスミドの高い保持をもたらしたが、25μg/ mlのプラスミドの損失を防止するのに十分ではなかった。その代わりに、我々はそのカルベニシリン濃度を発見した500μgの/ mlのtionsは、液体培養物中で成長中のプラスミドの損失を阻止するために必要とし、そして細菌を固体寒天基板上に成長したときに2 mg / mlのカルベニシリンを、プラスミド損失を阻止する必要があった。
プラスミド保持はノックダウンの成功に不可欠であるためのdsRNA細菌がこのプロトコルで培養すると、唯一のカルベニシリンが使用されます。我々は慎重に、プラスミドを含まない細菌がこれらの培養では増殖しないことを確認するには、このプロトコールに記載の細菌増殖培養において使用されるカルベニシリンの濃度を最適化しています。しかしながら、品質管理尺度として、プラスミド損失は、プロトコルのいくつかのステップで決定される。効率的なノックダウンを保証するために、これらの各ステップでの細菌の80％以上は、dsRNAプラスミドが含まれている必要があります。プロトコルのいずれかの段階での細菌の20％以上は、dsRNAのプラスミドを失った場合には、使用されるカルベニシリンの品質をチェック。カルベニシリンは、それが使用されている新鮮な一日に準備する必要があります。準備する新鮮カルベニシリンと文化を繰り返します。
1。プラスミド損失を決定する方法
- 細菌の少量のサンプルを削除します（関連する各ステップで説明したように）および450μlの滅菌水に追加します。
- 徹底的に希釈間の溶液を混合、滅菌水を使用し、さらに1:10 1:100および1:1000希釈を作成するには、この希釈された試料100μlを使用してください。
- LBとLB AMPプレートに各希釈液100μlを広げ、37℃で一晩、これらのプレートをインキュベート
- 翌日、細菌コロニー100〜500が含まれたLBプレートを識別します。 （細菌の同じ希釈を含む）は、このプレート上、対応するのLB AMPプレート上のコロニーの数を数える。
- これらのコロニー数からのプラスミドの損失を決定する。プラスミドを含まない細菌のパーセントは、式1を用いて計算され、有効なdsRNAのノックダウンのために15％未満であるべきである。
「式1」SRC = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />
2。重複ライブラリ版の作製
概要：のdsRNAライブラリは、96ウェルプレートに10566細菌クローンとして、製造業者（OpenBiosystems）から到着します。 -80℃の冷凍庫にすぐにプレートを保管してください。元のライブラリプレートが複製され、すべての給紙画面は細菌の供給源として、重複するライブラリ版を使用します。これは、元を格納し、別々の冷凍庫でのライブラリのプレートを複製することをお勧めします。一日あたりわずか10ライブラリプレートを複製、取り扱いのしやすさが推奨されています。
- -80℃の冷凍庫からライブラリプレート（複数可）を削除し、文化がまだ凍結している間にホイルシールを取り外します。図書館プレートのプラスチックカバーを取り付けて、（もはや30分以上）を室温で解凍する水平な面にプレートを設定していません。
注：我々は気づいていることは重要でP元のライブラリプレートの各ウェルで見つかった細菌のercentage、プラスミドが含まれていません。ライブラリ細菌は貴重な資源であるため、しかし、元のライブラリ培養でプラスミド損失をテストすることはお勧めしません。
- マルチチャンネルピペットを使用して、空の96ウェル平底重複プレートの各ウェルに、ライブラリの複製メディアを150μlを加える。
- ピペッティングにより四100μlに設定され、マルチチャンネルピペットを用いて5倍にまで解凍したライブラリ細菌培養を混ぜる。次に、各混合培養液10μlを削除し、重複したプレートの対応するウェルに移す。各転送用のピペットチップを変更することが一定の製版を複製するライブラリのプレートからの文化を転送し続けています。
- ライブラリのプレートからのすべての文化が転送された後は、徹底したシールを確実にするためにbrayerローラーを使用して、新しい接着ホイルで元のライブラリプレートのウェルをカバーしています。板の上にプラスチック製の蓋を交換し、培養は（少なくとも30分）再凍結するまで-80℃の冷凍庫に直立に配置します。 [ライブラリの収納ボックスに戻し、元のライブラリプレートを移動します。
- 37℃（マイクロシェーカーで450回転、3ミリメートルを周回）で8月10日時間にわたってフラットな重複ライブラリプレート培養を振る。
- 重複する各ライブラリのプレートのプラスミド損失を決定。我々は、元のライブラリープレートの各ウェル中の細菌の割合が高いのdsRNAプラスミドを含有しないことを見出した。なお、これらの細菌は、重複ライブラリーでの増殖に寄与しないことが重要である。それらの増殖を防止するために、カルベニシリン高濃度のライブラリーの複製メディア（3 mg / mlで）で使用される。これらの条件を用いて複製プレートの培養後、我々は、細菌の90％以上がdsRNAのプラスミドを含有することを見出した。重複する各プレートの代表培養ウェルから10μlのサンプルを削除し、450μlの滅菌水に追加します。これらの希釈した試料を用い、重複する各ライブラリー中のプラスミドの損失を決定するステップ1.1から1.4に従ったプレート。有意なプラスミド損失（>重複ライブラリー中の細菌の20％が、プラスミドを含まない）が観察される場合には、ステップ2.1からの新鮮カルベニシリンおよび反復プロトコルを使用して培養培地を作り直す。
- インキュベーションの後、重複したプレートウェルの真上に新しい箔粘着シートを配置し、この箔の上にプレートの蓋を置く。 -80℃の冷凍庫（少なくとも30分）凍結された時までに直立重複ライブラリプレートを置きます。凍結した後、長期保存のために重複ライブラリ格納ボックスにプレートを移動させる。
3。 Omniplatesに図書館の一時的なコピーを作成する
概要：dsRNAの画面のための食糧を準備するために開始するには、重複したライブラリのプレートからの細菌を固形寒天omniplatesに移して、一晩増殖させる。固体培地上でのプラスミドの損失を防ぐために、omniplatesは2 mg / mlのカルベニシリンで含む。これらのプレート上の細菌の期間使用することができます一週間の、プラスミドず、損失を示さない。我々は1週間以上omniplates上に成長させた細菌中でプラスミド損失をテストしていません。
- -80℃の冷凍庫から重複ライブラリプレート（複数可）を削除し、文化がまだ凍結している間にホイルシールを外す。箔を除去した後、プレートのプラスチックカバーを交換して（もはや30分以上）を室温で解凍する水平面に重複したライブラリプレートを設定します。
- Boekel 96ピンレプリケーターを滅菌する。クリーンレプリケータのピンは、蒸留水で洗浄した後、それぞれの使用前に滅菌する必要があります。 、レプリケータを殺菌エタノール浴（パイレックス皿の中の深い中3月4日）にそれを配置し、ブンゼンバーナーを使用してからピンをコーティングエタノールを燃焼させた。炎が消火した後、繰り返すことができます。
- 解凍された重複したプレートのウェルに滅菌レプリケータを置き、ゆっくりと文化を攪拌するために使用します。文化の小さなボリュームは、レプリケータのピンに付着する。 <李は>慎重重複プレートのウェルからレプリケータを削除し、寒天表面に穴を開けないように注意しながら、ゆっくりとomniplateの表面に（ピン下）に配置します。レプリケータの端子から細菌が寒天表面上に転写されるように、3〜4秒間omniplateの表面にレプリケータを残す。
- レプリケータを削除し、細菌培養の少量（2〜3μl）を寒天に吸収することができます。 37℃で15〜18時間、反転omniplatesをインキュベートこれらomniplates 96ウェル培養液に接種するために翌朝に使用することができる。代わりに、一晩細菌コロニーを含むomniplatesは4℃で7日間まで保存することができます
- レプリカ転送追加の重複プレートに、滅菌水でレプリケータのヒントをすすぎ、エタノールにレプリケーターを配置し、前と同じように、二度燃えるによる滅菌処理を繰り返します。滅菌後は、レプリケータは、次の重複プレートに使用することができます。
4。ワームを供給するための細菌の準備
Overview：給ウォームの細菌をomniplatesからの細菌を用いた（96ウェル形式）を1mlの液体培養物として調製される。これらの液体培養物を、飽和nonlogarithmic細菌培養を生成するために、一晩増殖させている。一晩成長はすべての文化が細菌の同様の濃度を含むことになるため、すべてのワームは、食品と同じ量を供給することが保証されます。この成長中のプラスミドなしの損失は観察されないはずである。
- 反復ピペッターおよび50mlのCombitipを用いて2ミリリットルディープウェル96ウェルプレートの各ウェルに細菌増殖培地1mlを分配する。
- 3.1から3.6のピンが96細菌コロニーの各々と接触していることを、あることのステップで生成された細菌のコロニーを含むomniplatesの表面に無菌レプリケーターを置きます。
- 慎重に増殖培地に浸漬するまでのピンは深井戸の側面をこすりしないことが確実せるディープウェルプレートにomniplateの表面からレプリケータを移動します。移動するレプリケータゆっくり増殖培地中に細菌を取り除くために、ディープウェルプレートの内壁以下の正方形の運動中。スプラッシュとクロスが井戸を汚染しないように注意してください。
- 対照ウェル：各96ウェルディープウェル培養プレートはよく別のネガティブコントロールとして期待ノックダウン表現型の陽性コントロールとして機能し、空のdsRNAベクターを含有する細菌を追加します1ウェル（pL4440）にdsRNAを発現する細菌を追加。私たちは再ストリークコントロールdsRNAを発現する細菌が新鮮残り、プラスミドを保持するようにテトラサイクリン（15μgの/ ml）およびカルベニシリン（2ミリグラム/ ml）を含むLBプレート上に一度週に細菌を。
- 無菌接種ループを使用して、（レプリケータによって転送された細菌の同量程度）コントロールプレートから単一の十分に単離されたコロニーを除去し、深いウェル培養プレートの空のウェルに接種する。接種されていますウェルの位置を記録します。代わりに、細菌Cでループ250μlの増殖培地を含有するエッペンドルフチューブに移動され、ボルテックスし、次いで、いくつかのウェルに接種するのに使用。
- 一晩37℃にて：（3ミリメートル軌道）マイクロシェーカーで650rpmでフラットな位置にディープウェルプレートを振る。培養は、次の朝までに飽和状態になることがあります。それにもかかわらず、これらの培養に用いられるカルベニシリンの濃度は、プラスミドの損失を防ぐべきである。
- 1ミリリットル一晩培養、プラスミド損失を決定。培養物をスクリーニングにワームを供給するために直接使用される。各培養物中の細菌の80％以上がdsRNAのプラスミドを含有することが重要である。ステップ1.1から1.4による2代表の文化のためのプラスミドの損失を決定する。期待：各培養中の細菌の90％以上は、dsRNAプラスミドが含まれています。私たちは、飽和まで増殖させても、これらの一晩培養に重要なプラスミド損失を観察したことがありません。しかしながら、有意なプラスミド損失が（> 20％）が観察された場合、新鮮なカルベニシリンおよび担当者を使用して増殖培地を作り直すステップ4.1からプロトコルを食べる。培養は、限りomniplates未満1〜2週間経過したとして、元omniplatesから再開することができます。
- 画面が完了すると、任意の再検培養を開始するために、食品の供給源として使用できるようになるまで1回、5ml培養物を開始するために使用される、omniplates 4℃で保存する。
- 文化の一晩のインキュベーションの後、ディープウェルプレートから細菌培養物150μLを削除し、供給プレートの表面に排出するために12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用しています。これは、ワームはdsRNAを発現する細菌を餌穴を掘るとしないので、転送中の寒天の表面に穴を開けないようにすることが重要である。転送は時間（ 図1）で4つのウェルを行うことができる。これを行うには、（行ごとに4ウェル供給プレートにありますように）マルチチャンネルピペットのすべての三チャンネルでピペットチップを配置します。 4ウェルの各セットが転送された後、新しい滅菌ピペットチップに変更します。各96ディープウェル培養プレートに96のヒントを必要とする8〜12 - ウェルプレートに給電するための転送。
- 細菌は寒天に吸収できるようにストアが暗い晩に直立プレートを播種した。
5。生成L1はC.を逮捕虫の幼虫
概要：L1-逮捕幼虫のdsRNA供給プレート上で同期ワーム培養を開始するために使用されています。これらの幼虫は、健康な卵を隔離するために妊娠成人の集団を漂白した後、卵は食べずに、S-完全培地中で孵化させることで生成されます。食べ物がない場合には孵化したL1幼虫は、L1幼虫の同期集団を生成する、開発を逮捕します。これらの飢えた動物が時間をかけて病気になり、廃棄しなければならないように、画面中に、毎週新鮮なL1〜逮捕幼虫を準備。 dsRNAを送り株において使用される動物の遺伝的背景の選択は、神経細胞の画面のえり-1のために、用途に応じて変更することができます。LIN-15B変異体を推奨します。
- 10月20日〜L4 LAを選ぶOP50細菌の芝生を含む6つの別々のNGMプレートにrvae、プレートは、多くたての卵や妊娠成人を含むようになるまで6〜7日待ちます。
- 各プレートの表面に水3mlを添加することにより、プレートから動物や卵を取り出して、水の中に各プレートの表面から卵、細菌、および動物を取り除くために手袋をはめた指を使用しています。細菌ローンに特別な注意を払って、プレートの全領域をカバーするようにしてください。ガラスピペットを用いて、各プレートから水、細菌、ワームや卵を取り出して、1の滅菌50ミリリットルコニカルチューブに移す。
- 残りのすべての細菌、ワームや卵を除去して表面を横切って上下し、ピペッティング、各プレートの表面に水の別の3ミリリットルを追加します。 50ミリリットルコニカルチューブにこのボリュームを追加します。
- テーブルトップ遠心機で1分間1,500 rpmでコニカルチューブを回転。ワームや卵管の底にペレット化すべきと細菌が浮遊したまま必要があります。慎重に4ミリリットルが、すべてを吸引管はペレット化し、ワームや卵を避けるようにしてくださいされてからの液体の。
- 残留水ウォームペレットを再懸濁し、ガラスピペットを用いて、滅菌15ミリリットルコニカルチューブに移す。滅菌水で10ミリリットルにボリュームを持って来る。
- 前のように1分間1,500 rpmでスピン。ワーム/卵のペレットを乱さないように、200μlの水を残して上清を吸引除去する。
- ワームや卵を洗って、追加の細菌を除去するために以前のように回転するように円錐形に10ミリリットルの水を追加します。
注意：Inは5.8から5.11ワームを段階的に説明し、卵は漂白液に晒されております。漂白剤は、ワームを破壊し、比較的無傷の卵を残す。卵が長すぎる漂白溶液中に残っている場合は、それらは破壊される。漂白剤は、卵は10分以上漂白剤に曝露残っていないことを確実にするために、ステップ5.8で追加されたときにタイマーを設定する。
- 上清200μlを残して他をすべて削除して、再度、ペレットを避け、そして10を追加ミリリットル漂白液、タイマーを開始します。
- 時折転倒混和、3〜4分間漂白溶液中のワームや卵をインキュベートする。そして、卓上遠心機で45秒間1,500 rpmでスピン。チューブの底にペレットを探し、元のペレットより小さく、よりコンパクトであるべきであり、黄色の外観にかかることがあります。
- ペレットを乱さないように、背後に200μLを残して漂白液を吸引する。
- 別の10ミリリットルの新鮮な漂白液を追加し、以前のように反転させる。タイマーは10分を読み取ると、再びスピンと漂白液を吸引、背後に200μLを残して、すぐに10ミリリットルの滅菌水を加えます。解剖顕微鏡下で溶液を調べる。幼虫と成虫の多くは、背後にある主に卵を残して、漂白液に溶解している必要があります。
- 45秒間前と同じように回転し、再度ペレットを乱さないように上清を吸引除去する。このペレットは主に卵が含まれている必要があり、非常に緩んでいるでしょう。
- anotを追加彼女の10ミリリットルの水が、背後に少量の水を残してスピンし、吸引を混在させる反転。これは、できるだけ多くの漂白剤溶液を除去することが重要である。
- コニカルチューブに4ミリリットルのS-完全なメディアを追加し、滅菌した100ミリリットルの三角フラスコに卵や転送を懸濁します。ただ十分な速フラスコの内容物を旋回させるように移動シェーカーセットで20℃のインキュベーターにフラスコを置きます。これは、彼らが孵化するときのL1幼虫をサポートするのに十分な通気を提供します。 15時間以内にすべての卵は、L1逮捕幼虫の同期集団を産生孵化している必要があります。
逮捕されたL1幼虫は、画面中に毎週新鮮なされるべきである。最初のバッチが行われた後、後続のバッチは（OP50100μlの一晩培養を含む）4つの標準、播種6cmのプレートのそれぞれに（前の週のバッチから）500逮捕されたL1幼虫を追加することで開始し、20でインキュベートすることができます4日間、Cと°。 4日目にプレートが含まれている必要があります多くの卵や妊娠大人とは、より多くの同期化のL1幼虫のために新鮮な卵を準備するために漂白することができます。
6。摂食プレートに逮捕さL1幼虫を転送
概要：dsRNAの画面を実行するには、20〜30 L1幼虫を逮捕したdsRNA給電プレート上に転写される。動物は、2〜3日間、dsRNAを発現する細菌を摂食した後にこのような幼虫停止または致死性は早くもノックダウン効果が観察される。行っ画面によって、所望の表現型は、給紙板上に載置された原稿動物（P0動物）、またはその子孫（F1動物）のいずれかで観察することができる。表現型の提示は、その発現がノックダウンされており、開発中の時間は、目的の遺伝子が必要とされる遺伝子によりコードされるタンパク質のperdurance含む変数の数に依存するであろう。 20〜30匹の動物のdsRNA供給培養を開始する前に、P0とF1の両方の表現型の観察を可能にする必要がありますimalsは食料源を排出。
簡単に、給電プレートに20から30の動物を転送する最初の決定するために、L1の濃度は、逮捕されたL1文化の中で動物を逮捕した。
- 動物を配布する逮捕L1幼虫を含有する三角フラスコを混ぜる。
- 4-5に播種されていない6cmのNGMプレートに10μlアリコートと滴下して場所を削除するには、すべてのメディアがピペットから排出されることを確認して板の中央を下に落下。
- ピペットチップの先端を使用することで、プレートの直径にまたがる液体の単一の連続線を形成するワームサスペンションのドットを広げる。
- 液体がプレートに吸収されており、動物が分散する前に、解剖顕微鏡を用いて、液体の線路の一端から始まり、他端に連続するすべての動物を数える。これは、動物が失われないことを確実にするために解剖範囲の一定の再収束が必要な場合があります。
- 3つの別々の10μlのためにこれを繰り返します分量とは、ワーム懸濁液1μl当たりワームの平均数を決定し、三角フラスコに直接この番号を記録するために3つの数字を平均。
7。給餌画面を開始
概要：dsRNAの画面を開始するには、20から30逮捕のL1幼虫をdsRNAを発現する細菌の薄い芝生を含む12ウェル送りプレートの各ウェルに加える。給プレートを標準線虫成長培地（NGM）を含有し、500μg/ mlのカルベニシリン（プラスミドの損失を防ぐため）及び1mM IPTG（dsRNA発現を誘導する）を補充している。動物を、20℃で数日間餌を発達させているF1の画面を実行するときに、P0画面と6〜7日の実行時に、動物のための2つの典型的な給餌レジメンは3日です。給の持続時間は、しかしながら、画面に求められる特定の表現型に応じて変えることができる。
- これを準備するために逮捕さL1幼虫および滅菌水の懸濁液を使用する2000ワーム/ mlを含むlution。各12ウェル供給プレートは、このワーム懸濁液120μLが必要になります。動物の均等な分配を確保し、ピペッティングのための無菌容器に動物を転送するために徹底的に混ぜる。
- すべての第3の位置にヒントを設定し、マルチチャンネルピ ペットを用いて直接給電プレートの細菌ローンへの転写ワーム溶液10μl（ 図1を参照）。ワームはdsRNAを発現する細菌を餌に寒天に穴を掘るとしませんように、寒天の表面に穴を開けないように注意してください。
- ワームはすぐに解決するように、給電プレートの各2行の後に（優しくにつきましてはスロッシングによる）リザーバ内のワームのソリューションをリミックス。すべての給紙プレートがワームになるまでのウォームサスペンションを分配し続ける。各ウェルは、20〜30ワームを取得していることを保証するために早期に解剖スコープの下にいくつかの井戸を調べる。
- 20℃のインキュベーター内の加湿ボックスで直立店舗プレート。次の日、WO後RM懸濁液をプレートに吸収した、プレートを反転し、20℃でヒュミドールに戻るこれらのプレート上の動物は（P0表現型用）3日後に観察して、再度6日後（F1の表現型の場合）することができます。
注記：ウォーム増殖の7日後に供給プレート上に残った細菌はプラスミドの損失について試験されており、ほぼ100％は、dsRNAプラスミドを保持した。
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Representative Results
P0ノックダウン表現型は、細菌を表現するdsRNA動物の飼育、2〜3日後に表示されるようになります。いくつかの初期の表現型は、幼虫の逮捕と致死性が含まれており、すべての給紙のウエル2〜3％で観察されるべきである。これらの同じ表現型はまた、F1世代の動物で観察されるであろう。孵化に失敗し、F1の卵の存在は、他の一般的なF1の表現型であり、一緒に、これらの3表現型は、F1の画面ですべてのウェルの約10％で観察されます。
我々は、P0とF1の表現型の両方の組織型の種々の発現のためのいくつかの遺伝子のノックダウン効果を調べるためにここに記載されたプロトコールを使用した。我々はまた、神経組織内のノックダウン効果をテストしたかったので、我々はえり-1を使用し、私達のスクリーンでのLIN-15B変異体。 えり-1およびLIN-15Bの変異は、RRF-3に変異を有するとともに、RNAiは8,13,14に対する感受性を引き起こした突然変異についてスクリーニングで同定された。
EGL-30、DPY-17、PAT-10、およびUNC-4：= "jove_content">我々は、ノックダウンのための4つの遺伝子をテストしました。これらの遺伝子のうちの2つ、EGL-30とのunc-4、15-17神経系で発現される、一つの遺伝子、 パット-10は 、体壁筋18で表現され、第四遺伝子、 数dpy-17が発現される19皮下細胞では。我々はえり-1を与えた場合、空のpL4440プラスミドが含まれていますが、LIN-15B動物の細菌は、dsRNAを発現しなかった、我々はすべての形態学的または行動欠陥（ 図2A、表1）を観察しませんでした。
EGL-30、Cでコード化Gタンパク質サブユニットの虫オーソログGAQ。EGL-30ヌル変異体の初期の発育中の逮捕が、いくつかのヌルescapersと低形質の機能喪失EGL-30変異体は成虫になるために成長し、移動や産卵行動に欠陥がある20。時我々は、L1ステージえり-1を与え、lin15B幼虫の細菌は、EGL-30 dsRNAを発現、我々は幼虫が移動して産卵行動に明らかな欠陥があった大人に成長したことがわかった。 3日後、動物の100％がEGL-30に対するdsRNAを給餌を麻痺さと（ 図2B、表1）の卵を産むことができませんでした。私たちは、EGL-30（AD810）ヌル動物で観察された私たちのdsRNAのノックダウン実験で幼虫逮捕表現型を観察しなかった。我々はEGL-30のdsRNA細菌上にメッキのL1動物はすでにEGL-30のための初期の発達の要件を通過したためと考えられる。これは、摂食画面の利点を強調する：後期の表現型はまた、開発中に重要な役割を果たしている遺伝子について観察することができる。
数dpy-17 C.におけるクチクラ形成に必要なコラーゲンタンパク質をコードする虫19。DPY-17ヌル変異体は、野生型アニムより短く、太っているALS。私たちは、DPY-17 dsRNAを与え、P0動物で任意の形態学的欠陥を観察しなかった。しかし、F1動物の98％がDPY表現型（ 図2C、表1）を示した。短いと脂肪P0動物の欠如は、DPY-17遺伝子の機能が適切な身体の形態について早期の幼虫の段階で必要であることを示している。 DPY-17は、他の給紙画面で対象とされていないが、これはdsRNAを注入21でノックダウンされました。興味深いことに、dsRNAの子孫のわずか30％がここで説明し、給電プロトコルは、少なくともいくつかの遺伝子について、より多くの労働集約的な注入手法よりも効率的であることを示唆し、DPYの表現型を示した動物を注入した。
パット-10は、体壁筋トロポニンC、カルシウム18に結合する4 EFハンドモチーフを含むタンパク質をコードする。 PAT-10 dsRNAを与えLIN-15Bの動物が3日以内に麻痺になったとtをリードしない卵を産んません。私たちは、 えり-1の100％があることを発見oaの致死表現型（ 図2D、表1）。
UNC-4は、腹側脊髄運動ニューロンで発現ホメオドメインタンパク質をコードし、適切なシナプス入力の選択22,23に必要です。それは以前のdsRNA送り戦略8,24に対して耐性であることが証明されたので、我々は試験遺伝子としてのunc-4を選択した。 のunc-4変異体は歩行行動の欠陥を示している。シナプス接続の欠陥の結果として、UNC-4変異体は、22,23バックすることはできません。頭の上に突いたときに正弦波運動で自由にバックアップする野生型動物と比較して、UNC-4ヌル変異体は、バックし、代わりに、多くの場合、そのように極端になり、背側のたわみが発生し、しっかりと彼らの中央体を縮小しないの頭部と尾コイル状の位置に身を置き、動物のタッチ、。私たちは、動物の68％がBAの欠陥を示した図書館準備からUNC-4 dsRNAを発現する細菌を与えたことがわかったcking。 RRF-3動物が摂食のunc-4のdsRNAである場合、以前に公表されたプロトコール8（ 表1）で観察し、0％バッキング欠陥と比較した場合、これは、ノックダウン効率の劇的な改善である。
図1。ライブラリの重複や、大規模な画面のためにフローチャートを。スクリーニングプロトコルの間に生成された各96または12ウェルプレートは、プレート間の細菌を転送するために使用される方法と一緒に、示されている。アスタリスクは、細菌が、プラスミドの損失をテストする位置のステップを示す。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2。 C.のdsRNAノックダウンの表現型様々な組織型において発現される遺伝子エレガンス 。 A）対照動物pL4440空のベクターを含む細菌を与えた。黒い矢印は、若い成体動物の位置を示している。白い矢印は産卵群の位置を示している。写真が示すその正常な体の姿勢によって証明されるように、自由に動物を移動する。B）動物は、EGL-30に対してのdsRNAを与えた。すべての動物麻痺動物のtypicalリジッド外観採用している注意します。また、プレート上に置かれた卵が完全に存在しないことを注意してください。C）動物は、DPY-17に対してのdsRNAを与えた。フィールドにその成熟動物に注意してください（矢印でマークされた1）はパネルA Dに示した成熟動物よりも短く、太っている）動物は、PAT-10に対してのdsRNAを与えた。すべての動物が麻痺しているが、それでも矢印でマークされ、頭部に近い細菌のクリアによって示されるように供給するために自分の頭の筋肉を動かすことができることに注意してください。スケールバー1ミリメートル。
| FEの標的とするdsRNAプラスミドまたは遺伝子eding | 標的遺伝子の組織発現 | ターミナル表現型とパーセントの動物 |
| pL4440（ネガティブコントロール） | すべての行動のための野生 | |
| EGL-30 | 神経系 | 100パーセントEGLと麻痺 |
| DPY-17 | 皮下組織 | 98パーセントDPY |
| PAT-10 | 体壁筋 | 100パーセント麻痺 |
| UNC-4 | 神経系 | 68％バッキング欠陥 |
表1。動物のターミナル表現型は、様々な温度で発現する遺伝子に対するdsRNAの給餌組織エレガンス 。 N =すべての遺伝子のための100。
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Discussion
我々はC.大規模スクリーニングを行うために、市販のdsRNAを送りライブラリを使用してプロトコルを記載した虫 。我々は、ライブラリを複製し、それを効果的に使用するようにすべての手順を説明します。我々は、このアプローチは、動物の異なる組織における異なる生物学的過程に関与する遺伝子を同定することができることを実証している。我々はここで説明した表現型が（UNC、EGL、およびDPY）は容易に観察可能であるが、このプロトコルは、ほとんどすべての生物学的プロセスに必要とされる遺伝子を検索するために適合させることができる。例えば、我々は、ウォーム25における神経伝達に必要な遺伝子を同定するためにこのプロトコルを使用している。動物はdsRNAを発現菌に供給した後（典型的には、P0画面、F1スクリーンのための6-7日間、3日間）は、それらが給電プレートから除去し、任意の行動表現型について試験することができる。
プラスミド損失：
我々は減少し、ノックダウン効率が中に観察されたことがわかった大規模なdsRNAスクリーンが直接ワームに供給される細菌からのdsRNAプラスミドの喪失に起因する可能性がある。たdsRNAライブラリープラスミド上にコードされβ-ラクタマーゼは、経時これらの抗生物質の濃度を低減、アンピシリンおよびカルベニシリンの両方を分解するように作用するので、プラスミド損失は、細菌増殖培養物中で起こる抗生物質の濃度が十分に低くなると、プラスミドを含まない細菌が生き残るためには、文化を移入することができます。彼らはノックダウン活性が低下し、多くの場合、機能喪失表現型11を引き起こさないように表示されたdsRNAの画面でこのような混合細菌培養物の使用は、避けなければならない。驚くべきことに、我々は、プラスミド損失は、高レベルでもアンピシリン（最大2 mg / ml）での非常に高い濃度で増殖した細菌培養物で発生することを見出した。カルベニシリンは、β-ラクタマーゼによる分解に対してより抵抗性であるが、我々はまだそれが必要な10〜40に比べて倍高かったカルベニシリンの濃度を使用することを発見文化の中ですべての細菌は、dsRNAのプラスミドを保持していたことを確実にするために、以前に公開されたdsRNAを送り画面8-10,26で使用。
なぜならCのほとんどの遺伝子虫は動物に与え、すべての細菌がdsRNAを発現することを非常に重要である、haplosufficientです。これは非常に効率的な遺伝子ノックダウンを保証し、大規模なスクリーニングにおいて機能喪失型表現型を観察する確率を増加させる。
正と負のコントロール：
これは、画面を行う際に各給電板に正と負の両方の制御の細菌を含むことが重要である。行動試験は、関心対象の遺伝子を同定するために使用される場合、ネガティブコントロールは、特に重要である。ネガティブコントロールのために我々は空のベクターpL4440を含む細菌を使用しています。ポジティブコントロールのためには、目的のノックダウン表現型を引き起こす遺伝子に対するdsRNAを表現細菌を使用することをお勧めします。しかし、そのような遺伝子がない場合知るN、ノックダウンのための肯定的な制御を容易に観察可能な表現型を引き起こすことを使用する必要があります。このような遺伝子を選択するときは、設定は、画面内の標的組織型において発現している遺伝子に与えられるべきである。例えば、ニューロン表現型のためのdsRNA送り画面で、ニューロン遺伝子が陽性対照として選択されるべきである。陽性対照菌を食べた動物において観察可能なノックダウン効果は、dsRNAの干渉が所望の組織型で動作していることを示します。
表現型の餌プレート得点者は陽性対照ウェルの場所に盲目である場合に最適です。スクリーナーは、容易に96ウェルプレートに陽性ウェルを同定できるはずである。行動アッセイのためにそれを残りのウェルをスキャンする前に、最初の負のよく得点すると便利です。
スループット：
このプロトコルを使用して、一人、16、12ウェルプレートを設定し、画面に設定することができるはず日当たり。ライブラリを介して効率的に移動するには、我々は一般的に、画面中に1回だけ、各ライブラリプレートの各ウェルをテストします。陽性として記録任意のウェルが記録され、三重に再テストされています。私たちは、陽性ウェルは、すべて3再テストで再テストしている必要があります。プラスミドを細菌から精製され、インサートは積極的に遺伝子を同定するために配列されている。ヌル変異が遺伝子のために利用可能である場合、我々はそれらを注文して、画面内で識別行動欠陥をヌル動物をテストします。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、健康MH097163の国立研究所からの資金によって支えられている。いくつかの株は、研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40-OD010440）によって資金を供給されるCGC、提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon flat bottom plate | Fisher Scientific | 353072 | sterile |
| adhesive foil | USA Scientific | 2923-0100 | |
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | autoclavable |
| Lids for deep well plates | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | individually wrapped |
| Reservoir | USA Scientific | 2977-8500 | autoclavable |
| 12-well plates | USA Scientific | CC7682-7512 | individually wrapped |
| dsRNA feeding library | OpenBiosystems | RCE1181 | store -80 °C |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetracycline | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Carbenicillin | allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com | ||
| Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A | Affymetrix | 10906 | for worm plates |
| Equipment | |||
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| B–kel 96-pin replicator | Fisher Scientific | 05-450-9 | autoclavable |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | 3 mm orbit |
| 12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| 12 channel multichannel pipet (30-300 μl) | USA Scientific | 7112-3300 | |
| Repeater Plus manual pipettor | USA Scientific | 4026-0201 | |
References
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