Storskalig Gene Knockdown i Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kathryn N. Maher¹, Mary Catanese², Daniel L. Chase³

¹Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, ²Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Medan dsRNA utfodring i C. elegans är ett kraftfullt verktyg för att bedöma geners funktion, löpande protokoll för storskaliga utfodring skärmar resultera i variabla knockdown effektivitet. Vi beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra storskaliga RNAi utfodring skärmar som resulterar i mycket effektiv och reproducerbar knockdown av genuttryck.

Abstract

RNA-interferens genom att mata maskar bakterier som uttrycker dsRNAs har varit ett användbart verktyg för att bedöma geners funktion i C. elegans. Även denna strategi fungerar bra när ett litet antal gener är riktade för knockdown, storskaliga utfodring skärmar visar variabla knockdown effektivitet, vilket begränsar deras användbarhet. Vi har ratas tidigare publicerade RNAi knockdown-protokoll och fann att den primära källan för det reducerade knockdown kan tillskrivas förlusten av dsRNA-kodande plasmider från bakterierna ges till djuren. Baserat på dessa observationer, har vi utvecklat en dsRNA utfodring protokoll som kraftigt reducerar eller eliminerar plasmidförlust att uppnå effektiv, hög genomströmning knockdown. Vi visar att detta protokoll kommer att producera robust, reproducerbar knock ned av C. elegans gener i olika vävnadstyper, inklusive nervceller, och kommer att möjliggöra effektiv knockdown i storskaliga skärmar. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodringbibliotek och beskriver alla steg som behövs för att duplicera biblioteket och utföra dsRNA skärmar. Protokollet kräver inte användning av någon avancerad utrustning, och kan därför utföras av alla C. elegans labb.

Introduction

Historiskt, genetiska skärmar i C. elegans har utförts genom att behandla djur med en kemisk mutagen såsom etylmetansulfonat för att skapa slumpmässiga mutationer i DNA. Progeny eller grandprogeny av muterade djur isoleras sedan som uppvisar en önskad onormal fenotyp. Mutationen som förorsakat fenotypen sedan identifieras genom en arbetsintensiv kartläggning förfarande eller genom sekvensering av mutant mask hela arvsmassa. Det finns många fördelar med att utföra sådana kemiska mutagenes skärmar eftersom de skapar permanenta skador inom masken genomet som kan resultera i både vinst-av-funktion och förlust-av-funktion fenotyper, men kartläggningen förfarandet är långsamt och dyrt.

Dubbel-RNA interferens (dsRNAi) ger ett alternativt sätt för att identifiera gener som är involverade i viktiga biologiska processer. I denna metod är dsRNA matcha den kodande sekvensen av en endogen gen införes i masken.Den dsRNA bearbetas in vivo för att generera små (21-22 nukleotider) RNA som fungerar som guider för att hitta och binda matchande endogena mRNA, rikta dem till destruktion ^1. Detta förfarande är relativt snabb, men eftersom dsRNA riktar mRNA istället för DNA, är endast minskning-av-funktion fenotyper observerats med hjälp av denna metod.

Införande av dsRNA i ett djur kan åstadkommas genom direkt injektion av dsRNA ^2, genom att blötlägga djur i dsRNA ^3, eller genom att mata djur bakterier som uttrycker dsRNA ^4. Var och en av dessa administreringsmetoder orsaka systemknockdown effekter eftersom de flesta celler i djuret uttrycka SID-1, en ​​transmembrankanal som medger import dsRNA ^5. Ursprungligen användes som en omvänd genetik tillvägagångssätt att knockdown uttrycket av enskilda gener en i taget, tillåter utveckling av två bibliotek utfodring nu storskaliga genetiska skärmar. De kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek innehåller bacterial kloner som representerar antingen 55% eller 87% av alla C. elegans gener ^{6, 7.}

Tyvärr, storskaliga dsRNAi utfodring skärmar ofta resultera i variabla knockdown effektivitet ^8-10. Medan den absoluta nivån på knockdown av RNAi inte är lätt att mäta, måste den minskade knockdown effektivitet observerats i storskaliga skärmar orsakas av kvarvarande genspecifika mRNA som undgår nedbrytning av RNAi. Detta, i sin tur, skulle kunna vara en direkt följd av dsRNA plasmidförlust från bakterier ges till djur i dessa skärmar. Stöd denna idé, djur utfodras blandningar av bakterier, i vilken endast 50% av de bakterier som uttrycker dsRNAs mot en målinriktad gen, show dramatiskt reduceras (om några) knockdown effekter jämfört med kontroll utfodrade djur ^11. Omfattningen av genen knockdown blir en viktig fråga när du utför dsRNAi skärmar som de flesta gener i C. elegans är haplosufficient och därmed genuttryck måste minskas med minst 50% to orsaka förlust-av-funktion fenotyper ^12.

Vi har använt tidigare publicerade utfodring protokoll för att utföra storskaliga skärmar och fann samma variabla knockdown som rapporterats av andra ^8-10. I ett sökande efter möjliga orsaker, fann vi att nästan 60% av de bakterier som ges till djur i skärmen hade förlorat dsRNA plasmiden. Vi har utvecklat ett bibliotek dubbelarbete och screeningprotokoll som dramatiskt minskar eller eliminerar plasmidförlust och kraftigt förbättrar knockdown effektivitet. Detta protokoll är lämpligt för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans och kan användas för att screena antingen en av de kommersiellt tillgängliga dsRNA bibliotek. Med hjälp av detta protokoll, finner vi att i huvudsak 100% av de bakterier som ges till djur under skärmen behåller dsRNA-kodande plasmiden och orsaka robust och mycket penetrerande förlorad funktion fenotyper i alla vävnader som undersökts.

Protocol

Anmärkning: Detta protokoll kan användas för att identifiera gener som krävs för en mängd olika biologiska processer i en mängd olika vävnadstyper. Som en nödvändig kvalitetskontroll under skärmen, djuren utfodras både positiva och negativa kontroll dsRNA-uttryckande bakterier att visa RNAi effekter i den riktade vävnaden.

Andra publicerade utfodringsprotokoll växa dsRNA-uttryckande bakterier i närvaro av antingen 50 ng / ml ampicillin eller 25 | ig / ml karbenicillin ^8-10. Vi har funnit att bakterierna odlas under endera av dessa betingelser förlora dsRNA plasmiden vid hög frekvens. I själva verket har vi funnit att även när bakterierna odlades över natten i mycket höga koncentrationer (upp till 2 mg / ml) ampicillin mer än 50% av de bakterier som inte längre innehåller plasmiden. Medan tillväxten i carbenicillin generellt lett till högre retention av plasmiden, inte 25 mikrogram / ml var tillräckligt för att förhindra plasmidförlust. Istället fann vi att carbenicillin koncentrationningar av 500 | ig / ml krävdes för att blockera plasmid förlust under tillväxt i flytande kulturer och 2 mg / ml karbenicillin krävdes för att blockera plasmid förlust när bakterierna odlades på fast agar-substrat.

Eftersom plasmid retention är avgörande för framgången för knockdown, endast carbenicillin används när dsRNA bakterier odlas i detta protokoll. Vi har noggrant optimerade koncentrationen av carbenicillin används i bakterietillväxtkulturer som beskrivs i detta protokoll för att säkerställa att bakterier som inte innehåller plasmiden inte växer i dessa kulturer. Men som en kvalitetskontroll åtgärd är plasmidförlust bestäms vid flera steg i protokollet. För att säkerställa en effektiv knockdown, måste mer än 80% av bakterierna vid vart och ett av dessa steg innehåller dsRNA plasmid. Om mer än 20% av bakterierna vid varje steg i protokollet har förlorat dsRNA plasmiden, kontrollera kvaliteten på carbenicillin används. Carbenicillin bör beredas på nytt samma dag den används. Förbered färsk carbenicillin och upprepa kulturen.

1. Ta reda plasmidförlust

1. Ta ett litet urval av bakterier (som beskrivs i varje relevant steg) och lägga till 450 l sterilt vatten.
2. Använd 100 pl av det utspädda provet för att skapa ytterligare 1:10, 1:100 och 1:1000 spädningar med hjälp av sterilt vatten, blanda lösningarna noggrant mellan utspädning.
3. Sprid 100 pl av varje spädning på LB-och LB-Amp-plattor och inkubera dessa plattor över natten vid 37 ° C.
4. Nästa dag, identifiera den LB-platta som innehåller mellan 100 och 500 kolonier. Räkna antalet kolonier på den här plattan och på motsvarande LB AMP platta (som innehåller samma utspädning av bakterier).
5. Bestäm plasmidförlust från dessa kolonier. I procent av bakterier som inte innehåller plasmiden beräknas enligt ekvation 1, och bör vara mindre än 15% för effektiv dsRNA slå ner.

"Ekvation 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Making Duplicate Library Plates

Översikt: dsRNA bibliotek kommer att anlända från tillverkaren (OpenBiosystems) såsom 10566 bakteriella kloner i 96-brunnsplattor. Förvara plattorna omedelbart i -80 ° C frys. De ursprungliga biblioteksplattorna kommer att dupliceras och alla utfodring skärmar kommer att använda de dubbla biblioteksplattorna såsom källa för bakterier. Det är lämpligt att för originalet och kopiera biblioteksplattor i separata frysar. För att underlätta hanteringen, duplicera endast 10 biblioteksplattor per dag rekommenderas.

1. Ta bort biblioteks skylt (ar) från -80 ° C frys och ta bort folien tätningen medan kulturer fortfarande är frysta. Byt biblioteks plattan plastlock och ställ in plåten på en plan yta för att tina i rumstemperatur (inte längre än 30 min).

OBS: Vi har märkt att en betydande percentage av bakterier som finns i varje brunn i den ursprungliga biblioteksplattorna inte innehåller plasmiden. Eftersom biblioteket bakterier är en värdefull resurs det inte rekommenderas att testa plasmidförlust i den ursprungliga bibliotekskulturer.

2. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 150 | il av bibliotek dubblering media till varje brunn i en tom 96-brunnars flatbottnad duplikat plattan.
3. Blanda de upptinade Bibliotek bakteriekulturer genom att pipettera upp och ned 4-5 gånger med hjälp av en flerkanalspipett satt till 100 | il. Avlägsna sedan 10 | il av varje blandad kultur och överföring till de motsvarande brunnarna i duplikat plattan. Fortsätt att överföra kulturer från biblioteket platta att duplicera platt göra vissa att ändra pipettspetsar för varje överföring.
4. Efter alla kulturer från ett bibliotek platta har överförts, täcka brunnarna i det ursprungliga biblioteket plattan med ny klisterfolie med hjälp av en brayer rulle för att säkerställa en grundlig tätning. Sätt tillbaka locket plast på plattan ochplacera det upprätt i en -80 ° C frys tills kulturerna har refrozen (minst 30 minuter). Flytta sedan den ursprungliga biblioteksplattorna tillbaka in i ett bibliotek förvaringsbox.
5. Skaka dubbletter biblioteksplattkulturer platta för 8 till 10 h vid 37 ° C (450 rpm på en microshaker, omlopp 3 mm).
6. Bestäm plasmidförlust i varje duplikat biblioteks platta. Vi fann att en stor andel av bakterierna i varje brunn i den ursprungliga biblioteks plattan inte innehöll dsRNA-plasmiden. Det är viktigt att dessa bakterier inte bidrar till tillväxten i två exemplar biblioteket. För att förhindra deras tillväxt, är en hög koncentration av karbenicillin används i biblioteket dubblering medier (3 mg / ml). Efter odling av dubbelplattan med hjälp av dessa förhållanden fann vi att mer än 90% av bakterier innehåller dsRNA plasmid. Avlägsna 10 pl prov från ett representativt kultur och för varje duplikat platta och lägga till 450 l sterilt vatten. Med hjälp av dessa utspädda prover, bestämma plasmidförlust i varje duplikat bibliotekplatta enligt steg 1,1-1,4. Om väsentlig plasmidförlust observeras (> 20% av bakterier i två exemplar biblioteket inte innehåller plasmid), göra om odlingsmedia med färska carbenicillin och upprepa protokoll från steg 2.1.
7. Efter inkubation, placera en ny folielim blad direkt över de dubbla brunnar, och placera plattan lock över denna folie. Placera de dubbla biblioteks plattorna upprätt i en -80 ° C frys (åtminstone 30 min) tills frusen. När frysta, flytta plattorna till de dubbla biblioteksförvaringslåda för långtidslagring.

3. Göra tillfälliga kopior av biblioteket på Omniplates

Översikt: För att börja förbereda mat för en dsRNA skärm, är bakterier från dubbla biblioteksplattor över till fasta agar omniplates och vuxit över natten. För att förhindra plasmid-förlust på fasta medier, innehåller omniplates karbenicillin vid 2 mg / ml. Bakterierna på dessa plattor kan användas under en periodav en vecka, och inte uppvisa någon plasmid förlust. Vi har inte testat för plasmidförlust i bakterier som odlats på omniplates längre än en vecka.

1. Ta bort dubbletter bibliotek skylt (ar) från -80 ° C frys och ta av folietätningen medan kulturerna fortfarande frysta. Efter att folien, byt plattans plastkåpan och ställ in två exemplar biblioteket plattan på en plan yta för att tina i rumstemperatur (inte längre än 30 min).
2. Sterilisera Boekel 96 pin replikatorn. Stiften i en ren replikator bör sköljas med destillerat vatten och sedan steriliseras före varje användning. För att sterilisera replikatorn, placera den i en etanolbadet (3/4 in djupt i en Pyrex maträtt) och sedan bränna etanolen beläggning stiften bort med en bunsenbrännare. Låt lågan slocknar och sedan upprepa.
3. Placera steriliserade replikatorn i brunnarna i upptinade dubbletter plattan och använda den för att försiktigt röra om kulturerna. Små volymer av odlingen kommer att vidhäfta till stiften i replikatorn.
<li> försiktigt bort replikatorn från brunnarna i duplikat plattan och placera den (stiften nedåt) försiktigt på ytan av omniplate, försiktigt så att inte tränga igenom agar yta. Låt replikator på ytan av den omniplate för 3-4 sek, så att bakterier från stiften i replicator överförs på agarytan.
4. Avlägsna replikator och låta den lilla volymen (2-3 | il) av bakteriekultur för att absorbera in i agar. Inkubera omniplates inverterade för 15 till 18 h vid 37 ° C. Dessa omniplates kan användas nästa morgon för att ympa 96 väl flytande kulturer. Alternativt kan omniplates innehållande över natten bakteriekolonier förvaras i upp till sju dagar vid 4 ° C.
5. Att replica-överföring ytterligare dubbla plattor, skölj replicator tips med sterilt vatten och upprepa steriliseringsprocessen genom att placera replikatorn i etanol och flammande det två gånger, som tidigare. När steriliseras, kan replika användas på nästa duplikat plattan.

4. Beredning av bakterier för Feeding Worms

Oversikt: Bakterier för utfodring maskar bereds som 1 ml flytande kulturer (i en 96 väl format) med hjälp av bakterier från omniplates. Dessa flytande kulturer odlas över natten för att generera mättade nonlogarithmic bakteriekulturer. Övernattning tillväxt ser till att alla kulturer kommer att innehålla liknande koncentrationer av bakterier och därmed alla maskar kommer att matas med samma mängd mat. Ingen plasmidförlust under denna tillväxt ska observeras.

1. Dispensera 1 ml av bakteriellt tillväxtmedium i varje brunn i 2 ml djupbrunns 96-brunnsplatta med användning av en Repetitionspipetten och 50 ml Combitip.
2. Placera steril replikator på ytan av omniplates innehållande bakteriekolonier som genererats i steg 3,1-3,6 göra så att tapparna är i kontakt med var och en av de 96 bakteriekolonier.
3. Flytta försiktigt replikatorn från ytan av omniplate i den djupa brunnar göra vissa att stiften inte skrapa sidorna av djupa brunnar tills nedsänkt i tillväxtmedier. Flyttareplicator långsamt i en fyrkant rörelse följer innervägg djupbrunnsplatta för att driva bort bakterier i tillväxtmediet. Var noga med att inte stänka och cross förorena brunnar.
4. Kontrollbrunnar: För varje 96-brunn djup brunn odlingsplatta tillsätt dsRNA-uttryckande bakterier till en brunn som kommer att fungera som en positiv kontroll för den förväntade knockdown fenotyp och lägga bakterier innehållande tom dsRNA vektor (pL4440) som en negativ kontroll till en annan brunn . Vi re-strimma kontroll dsRNA-uttryckande bakterier en gång per vecka på LB-plattor innehållande tetracyklin (15 | ig / ml) och karbenicillin (2 mg / ml) så att bakterierna förblir färsk och behålla plasmiden.
5. Med en steril inokulering slinga bort en enda väl isolerad koloni från styrplattan (ungefär samma mängd av bakterier som överförts av den replikatorn) och inokulera en tom väl i djup brunnars odlingsplatta. Spela position väl som har ympats. Alternativt slingan med bakterier cen flyttas till ett Eppendorf-rör innehållande 250 | il tillväxtmedium, virvlades och användes sedan för att inokulera flera brunnar.
6. Skaka djupbrunnsplattor i en platt position vid 650 rpm på microshaker (bana: 3 mm) vid 37 ° C över natten. Kulturerna kommer att mättas av nästa morgon. Oavsett, bör koncentrationen av karbenicillin användes i dessa kulturer förhindra plasmid förlust.
7. Bestäm plasmidförlust i en ml övernattskulturer. Kulturerna kommer att användas direkt för att mata maskar för skärmen. Det är viktigt att mer än 80% av bakterierna i varje kultur innehåller dsRNA plasmid. Bestäm plasmidförlust för två representativa kulturer enligt steg 1,1-1,4. Förväntan: Mer än 90% av bakterier i varje kultur innehåller dsRNA plasmid. Vi har aldrig observerat signifikant plasmid förlust i dessa övernattodlingar även när odlas till mättnad. Men om betydande plasmidförlust observeras (> 20%), göra om tillväxtmedier med färska karbenicillin och repäta protokoll från steg 4.1. Kulturer kan återstartas från de ursprungliga omniplates så länge omniplates är mindre än 1-2 veckor gamla.
8. En gång för att starta 1 ml kulturer, är omniplates förvaras vid 4 ° C tills skärmen är klar och kan användas som en källa till mat för att starta några retest kulturer.
9. Efter inkubation över natten av kulturer, använder en 12-kanals flerkanalspipett för avlägsnande av 150 | il av bakteriekulturen från den djupa brunnar och matas ut på ytan av matningsplattan. Det är viktigt att inte tränga igenom ytan på agar under överföring som maskar kommer att gräva och inte foder på dsRNA-uttryckande bakterier. Överlåtelse kan ske fyra brunnar åt gången (figur 1). För att göra detta placerar pipettspetsar på var tredje kanal i multikanalpipett (eftersom det bara finns fyra brunnar per rad i matningsplåt). Efter varje uppsättning av 4 brunnar överföres, ändra till nya, sterila pipettspetsar. Varje 96 djup och odlingsplatta kommer att kräva 96 tipsför överföring till åtta 12-well utfodring plattor.
10. Affär seedade tallrikar stående i mörker över natten så att bakterierna kan absorbera in i agar.

5. Generera L1 gripen C. elegans Larver

Översikt: L1-arresterad larver används för att starta synkroniserade maskkulturer på dsRNA utfodring plattorna. Dessa larver genereras genom blekning populationer av gravida vuxna att isolera friska ägg och sedan låta äggen att kläckas i S-komplett medium utan mat. I brist på mat den kläckta L1 larverna kommer att arrestera utveckling, vilket genererar en synkron befolkning på L1-larver. Under skärmen, bered nya L1-greps larver varje vecka som dessa utsvultna djur blir sjuka med tiden och måste kasseras. Valet av genetisk bakgrund av de djur som används i ett dsRNA matningsstam kan variera beroende på applikation, för neuronala skärmar eri-1, lin-15B mutanter rekommenderas.

1. Pick 10-20 L4 larvae till sex separata NGM plattor innehållande en gräsmatta av OP50 bakterier och vänta 6-7 dagar tills plattorna innehåller många färska som ägg och gravida vuxna.
2. Avlägsna djur och ägg från plattorna genom tillsats av 3 ml vatten till ytan av varje platta och använda en gloved finger för att driva bort de ägg, bakterier och djur från ytan av varje platta i vattnet. Var noga med att täcka alla delar av plattan, med särskild uppmärksamhet på bakteriemattan. Ta bort vatten, bakterier, maskar och ägg från varje platta med hjälp av ett glas pipett och för över till en steril 50 ml koniska rör.
3. Lägg till ytterligare 3 ml vatten till ytan av varje platta, pipettera upp och ner över hela ytan för att avlägsna alla kvarvarande bakterier, maskar och ägg. Lägg denna volym till 50 ml koniska rör.
4. Snurra koniskt rör vid 1500 rpm under 1 min i en bordscentrifug. Maskar och ägg bör pelletera till botten av röret och bakterierna bör förbli avbrytas. Försiktigt aspirera allt men 4 mlav vätskan från röret att vara noga med att undvika de pelleterade maskar och ägg.
5. Resuspendera masken pelleten i den återstående vatten och för över till ett sterilt 15 ml koniskt rör med hjälp av en glaspipett. Bringa volymen till 10 ml med sterilt vatten.
6. Centrifugera vid 1500 rpm under 1 min som tidigare. Aspirera supernatanten lämnar 200 | il vatten för att inte störa den mask / ägg pellet.
7. Tillsätt 10 ml vatten till den koniska att tvätta maskar och ägg och snurra som tidigare för att ta bort ytterligare bakterier.

Notera: I steg 5,8-5,11 maskar och ägg utsätts för en blekmedel. Bleach kommer att förstöra maskar och lämna äggen relativt oskadd. Om äggen är kvar i blekmedelslösningen för lång, kommer de också att förstöras. Ställ in en timer när blekmedel tillsättes i steg 5,8 för att vara säker på att äggen inte förblir exponerad för blekmedel under mer än 10 min.

8. Ta bort alla utom 200 | il av supernatanten, återigen undvikande pelleten, tillsätt sedan 10ml blekmedel och starta en timer.
9. Inkubera maskar och ägg i blekmedel lösning för 3-4 minuter, ibland blanda genom inversion. Sedan snurra vid 1500 rpm i 45 sekunder i en bordscentrifug. Leta efter en pellet i botten av röret, bör det vara mindre och mer kompakt än den ursprungliga pelleten och kan ta på en gul utseende.
10. Aspirera blekningslösning som lämnar 200 jil bakom för att inte störa pelleten.
11. Lägg till ytterligare 10 ml färsk blekmedel och invertera som tidigare. När timern läser 10 minuter, snurra igen och aspirera blekmedel, lämnar 200 ^ bakom och snabbt lägga till 10 ml sterilt vatten. Undersök lösningen under ett dissektionsmikroskop. Larver och många av de vuxna borde ha upplösts i blekmedel, vilket mestadels ägg bakom.
12. Centrifugera som tidigare under 45 sek, och igen aspirera supernatanten för att inte störa pelleten. Denna pellet bör i första hand innehålla ägg och kommer att vara mycket lös.
13. Lägg ANOThennes 10 ml vatten, invertera att blanda, spinn och aspirera lämnar lite vatten bakom. Det är viktigt att ta bort så mycket blekmedel som möjligt.
14. Tillsätt 4 ml S-komplett media till den koniska röret, resuspendera ägg och överför till en steril 100 ml E-kolv. Placera kolven i ett 20 ° C inkubator på en skakapparat rör sig precis tillräckligt snabbt för att göra innehållet i kolven att snurra. Detta kommer att ge tillräcklig luftning för att stödja L1 larverna när de kläcks. Inom 15 timmar alla äggen borde ha kläckts fram en synkron befolkning på L1 greps larver.

Arresterad L1 larver bör göras färsk varje vecka under en skärm. När den första omgången har gjorts, kan efterföljande partier startas genom att tillsätta 500 arreste L1 larver (från förra veckans batch) till var och en av fyra standard, seedade 6 cm plattor (innehållande 100 pl natten kultur OP50), och inkuberas vid 20 ° C under 4 dagar. På den fjärde dagen plattorna bör innehållamånga ägg och gravida vuxna och kan blekas för att förbereda färska ägg för mer synkroniserad L1 larver.

6. Överföra gripen L1 Larver på utfodrings Plates

Översikt: För att utföra en dsRNA skärm, är 20-30 L1 greps larver överförs till dsRNA utfodring plattor. Tidigt knockdown effekter såsom larver gripande eller dödlighet kommer att observeras efter djuren utfodras på dsRNA-uttryckande bakterier i 2-3 dagar. Beroende på skärmen utförts, kan önskade fenotyper observeras antingen i de ursprungliga djuren släpps ut på matarplattan (P0 djur) eller i deras avkomma (F1-djur). Presentationen av fenotyp kommer att bero på ett antal variabler, inklusive perdurance av proteinet som kodas av den gen vars expression slås ned och den tid under utveckling, i vilken genen av intresse är nödvändig. Starta dsRNA utfodring kulturer med bara 20-30 djur bör tillåta observation av både P0 och F1-fenotyper innan enDJUR uttömma matkälla.

För att enkelt överföra 20-30 djur till utfodring plattor, först bestämma koncentrationen av L1 greps djur i arrest L1 kulturen.

1. Blanda Erlenmeyerkolv, innehållande den arreste L1 larverna att dela ut djuren.
2. Ta en 10 pl alikvot och plats droppvis på en unseeded 6 cm NGM plattan i 4-5 droppar ner i mitten av plattan och se till att all media drivs ut ur pipetten.
3. Med användning av slutet av pipettspetsen sprida prickar av snäck suspensionen för att bilda en enda kontinuerlig linje av vätska som sträcker sig över diametern av plattan.
4. Med hjälp av ett dissektionsmikroskop, räkna alla djur med början vid en ände av raden av vätska och fortsätter till den andra änden före vätskan har absorberats in i plattan och djuren dispergera. Detta kan kräva ständig omfokusering av dissekera omfattning för att vara säker på att inga djur missas.
5. Upprepa detta i tre separata 10 plportioner och i genomsnitt de tre nummer för att bestämma det genomsnittliga antalet maskar per il mask fjädring och antecknar detta nummer direkt på Erlenmeyerkolv.

7. Börja Feeding Screen

Översikt: Till att börja dsRNA skärmen, 20-30 arrested L1 larver sattes till varje brunn i 12-brunnars utfodring plattor innehållande en tunn matta av dsRNA-uttryckande bakterier. Utfodring plattorna innehåller standard nematod tillväxtmedium (NGM) och är kompletterat med 500 | ig / ml karbenicillin (för att förhindra plasmid-förlust) och 1 mM IPTG (för att inducera dsRNA expression). Djuren får foder och utvecklas under flera dagar vid 20 ° C. Två typiska utfodringsregimer för djuren är 3 dagar när du utför en P0 skärm och 6-7 dagar vid utförande av en F1-skärm. Varaktigheten av matningen kan emellertid varieras beroende på de specifika fenotyper söks i skärmen.

1. Använd upphävandet av L1 greps larver och sterilt vatten för att bereda en sålution innehållande 2000 maskar / ml. Varje 12-väl matningsplatta kommer att kräva 120 l av denna mask fjädring. Blanda omsorgsfullt för att säkerställa en jämn fördelning av djur och överför djuren till en steril behållare för pipettering.
2. Använda flerkanalspipett ställa upp med tips på var tredje läge (se figur 1) överföra 10 ìl av masken lösningen direkt på bakteriemattan av matarplattorna. Se till att inte tränga igenom ytan av agar, som maskar kommer att gräva in i agar och inte foder på dsRNA-uttryckande bakterier.
3. Remixa snäcklösningen i behållaren (genom att försiktigt sloshing det om) efter varje två rader av matningsplattor, såsom maskar sedimentera snabbt. Fortsätt att fördela masken fjädring tills alla utfodring plattor har maskar. Undersök några brunnar tidigt på under dissekera omfattning för att säkerställa att varje brunn är att få 20-30 maskar.
4. Förvara plattorna upprätt i en fuktig låda i en 20 ° C inkubator. Nästa dag, efter worm fjädring har absorberas i plattan, vänd plattorna och återgå till humidor vid 20 ° C. Djur på dessa plattor kan observeras efter 3 dagar (för P0 fenotyper) och återigen efter 6 dagar (för F1 fenotyper).

Notera: De bakterier som finns kvar på matningsplattan efter 7 dagars mask tillväxt har testats för plasmidförlust och nästan 100% behöll dsRNA plasmiden.

Representative Results

P0 knockdown fenotyper kommer att börja visas efter 2-3 dagars mata djuren dsRNA uttrycka bakterier. Några tidiga fenotyper omfattar larv gripande och dödlighet och bör observeras i 2-3% av alla utfodring brunnar. Samma fenotyper kommer också att observeras i F1 generationen djuren. Förekomsten av F1 ägg som inte kläcks är en annan vanlig F1-fenotyp, och tillsammans kommer dessa tre fenotyper observeras i nästan 10% av alla brunnar i F1-skärmar.

Vi använde det protokoll som beskrivs här för att undersöka knockdown effekter för flera gener som uttrycks i en mängd olika vävnadstyper för både P0 och F1-fenotyper. Eftersom vi ville också testa knockdown effekter i nervvävnad, använde vi eri-1, lin-15B mutanter i våra skärmar. Mutationer i eri-1 och lin-15B, tillsammans med mutationer i RRF-3, identifierades i skärmar för mutationer som orsakat ökad känslighet för RNAi ^8,13,14.

EGL-30, Dpy-17, pat-10, och UNC-4. Två av dessa gener, egl-30 och UNC-4, uttrycks i nervsystemet ^15-17, en gen, pat-10, uttrycks i kroppen-vägg muskeln ^18, och den fjärde genen, Dpy-17, uttrycks i hypodermal celler ^19. När vi matade eri-1, lin-15B djur bakterier som innehöll den tomma pL4440 plasmiden men inte uttrycka en dsRNA, observerade vi inte några morfologiska och beteendemässiga defekter (Figur 2A, Tabell 1).

EGL-30, kodar C. elegans ortolog av G-protein-subenheten Gaq. EGL-30 null mutanter gripandet under tidig larvutveckling, men några null Escapers och hypomorphic förlust-av-funktion EGL-30 mutanter växa till att bli vuxenstadiet och är defekta i förflyttning och äggläggande beteenden ^20. Närvi matas L1 skede ERI-1; lin15B larver bakterier som uttrycker EGL-30 dsRNA, fann vi att larverna växte till att bli vuxna som visade tydliga brister i förflyttning och äggläggning beteende. Efter tre dagar, 100% av djuren utfodras dsRNA mot EGL-30 var förlamad och oförmögen att lägga ägg (figur 2B, tabell 1). Vi observerade inte larv gripandet fenotyp i våra dsRNA knockdown försök som observerats i EGL-30 (ad810) null djur. Det är förmodligen därför L1 djuren vi pläterade på EGL-30 dsRNA bakterier hade redan passerat den tidiga utvecklings kravet på EGL-30. Detta belyser en fördel för utfodring skärmar: slutskedet fenotyper kan observeras för gener som också spelar viktiga roller under utveckling.

Dpy-17 kodar en kollagenprotein som krävs för nagelband bildas i C. elegans ^19. DPY-17 null mutanter är kortare och fetare än vildtyp animals. Vi observerade inte några morfologiska defekter i P0 djur som utfodrats Dpy-17 dsRNA. Men 98% av F1-djur visade Dpy fenotypen (Figur 2C, Tabell 1). Bristen på korta och fett P0 djur indikerar att Dpy-17 genfunktionen krävs vid tidiga larvstadier för korrekt kropps morfologi. Medan Dpy-17 inte har riktat in andra utfodrings skärmar, var det pressade ned dsRNA injektion ^21. Intressant, endast 30% av avkomman av dsRNA injicerade djuren visade Dpy fenotypen, vilket tyder på att utfodring protokoll som beskrivs här är mer effektiv än den mer arbetsintensiva injektion strategi, åtminstone för vissa gener.

pat-10 kodar kroppen väggen muskler troponin C, ett protein som innehåller fyra EF Hand motiv som binder kalcium ^18. Vi fann att 100% av ERI-1, lin-15B djur som utfodrats pat-10 dsRNA blev förlamad inom 3 dagar och lade inga ägg ledande toa dödlig fenotyp (Figur 2D, Tabell 1).

unc-4 kodar en homeodomän protein som uttrycks i ventrala sladden motoriska nervceller och krävs för korrekt synaptisk input val ^22,23. Vi valde unc-4 som ett test-gen, eftersom det har visat sig vara resistent mot tidigare dsRNA utfodringsstrategier ^8,24. UNC-4 mutanter visar en defekt i rörelsebeteende. Som ett resultat av brister i synaptic anslutningar, UNC-4 mutanter inte kan backa ^22,23. Jämfört med vildtyp djur som tillbaka fritt i en sinusformad rörelse när stötte på huvudet, behöver unc-4 null mutanter inte tillbaka och i stället dra ihop deras midskeppssektion tätt, vilket leder till en dorsal böjning som ofta blir så extrem att huvudet och svansen hos djur beröring, placera kroppen i en spiral läge. Vi fann att 68% av djuren utfodras unc-4 dsRNA-uttryckande bakterier från vårt bibliotek förberedelser visade brister i backing. Detta är en dramatisk förbättring i knockdown effektivitet jämfört med 0% uppbackning defekten observeras när RRF-3 djuren utfodras unc-4 dsRNA med hjälp av tidigare publicerade protokoll ⁸ (tabell 1).

Figur 1. Flödesschema för biblioteket dubblering och storskalig skärmen. Varje 96 eller 12 brunnar genereras under screeningprotokoll indikeras, tillsammans med den metod som används för överföring av bakterier mellan plattorna. Asterisker anger de steg där bakterier bör testas för plasmidförlust. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. dsRNA knockdown fenotyper av C. elegans gener som uttrycks i olika vävnadstyper. A) Kontroll djur utfodras bakterier innehåller pL4440 tom vektor. Svart pil indikerar positionen för en ung vuxen djuret. Vita pilen indikerar positionen för en grupp som ägg. Bilden visar fritt rörliga djur som framgår av deras normala kroppshållning. B) djur utfodras dsRNA mot EGL-30. Observera att alla djur har antagit en stel utseende typiskt för förlamade djur. Notera också den totala avsaknaden av lagt ägg på plattan. C) djur utfodras dsRNA mot Dpy-17. Observera att vuxna djur i området (en markerad med pil) är kortare och fetare än den vuxna djur som visas i panel A. D) Djur matas dsRNA mot pat-10. Observera att alla djur paralyseras men kan fortfarande flytta sina huvudet muskler till foder såsom visas av clearing av bakterier i närheten av huvudet, markerad med en pil. Skala bar 1 mm.

dsRNA plasmid eller gen måltavla för feEding	Tissue expression av målgenen	Procent djur med terminal fenotyp
pL4440 (negativ kontroll)		vildtyp för alla beteenden
EGL-30	nervsystemet	100% Egl och paralyserad
Dpy-17	hypodermis	98% Dpy
pat-10	kroppen väggen muskler	100% Förlamad
unc-4	nervsystemet	68% Stöd Defekt

Tabell 1. Terminal fenotyp av djur som utfodrats dsRNA mot gener som uttrycks i olika C. elegans vävnader. n = 100 för alla gener.

Discussion

Vi har beskrivit ett protokoll som använder en kommersiellt tillgänglig dsRNA utfodring bibliotek för att utföra storskaliga skärmar i C. elegans. Vi erbjuder alla instruktioner att duplicera biblioteket och att använda den på ett effektivt sätt. Vi visar att detta tillvägagångssätt kan identifiera gener som är involverade i olika biologiska processer i olika vävnader hos djuret. Medan de fenotyper som vi beskriver här är lätt att observera (Unc, Egl och Dpy), kan detta protokoll anpassas för att söka efter gener som krävs för nästan alla biologiska process. Till exempel har vi använt detta protokoll för att identifiera gener som krävs för neurotransmission i masken ^25. När djuren har utfodrats med bakterier som uttrycker dsRNA (vanligtvis 3 dagar för P0 skärmar, 6-7 dagar för F1-skärmar), de kan tas bort från matarplattan och testas för eventuella beteende fenotyp.

Plasmid förlust:

Vi fann att de reducerade knockdown effektivitet observerades understorskaliga dsRNA skärmar kan direkt hänföras till förlusten av dsRNA plasmid från bakterierna matas till maskarna. Plasmid förlust inträffar i bakterietillväxtkulturer eftersom β-laktamas, som kodats på dsRNA bibliotek plasmiden, verkar för att bryta ned både ampicillin och karbenicillin, att minska koncentrationen av dessa antibiotika med tiden. När koncentrationen av antibiotikum blir tillräckligt låg kan bakterier som inte innehåller plasmiden överleva och befolka kultur. Användningen av sådana blandade bakteriekulturer i dsRNA skärmar måste undvikas, eftersom de visar minskad knockdown aktivitet och ofta inte orsakar förlust av funktions fenotyper ^11. Överraskande, fann vi att hög nivå av plasmid-förlust inträffar ens bakteriekulturer som odlas i mycket höga koncentrationer av ampicillin (upp till 2 mg / ml). Medan karbenicillin är mer resistent mot nedbrytning av β-laktamas, fann vi det fortfarande nödvändigt att använda koncentrationer av karbenicillin som var 10 till 40 gånger högre än deanvänts i tidigare publicerade dsRNA utfodring skärmar ^8-10,26 att säkerställa att alla bakterier i kulturen behöll dsRNA plasmiden.

Eftersom de flesta gener i C. elegans är haplosufficient, är det mycket viktigt att alla bakterier ges till djur uttrycka dsRNA. Detta säkerställer högeffektiv gen knockdown och ökar sannolikheten att observera förlust-av-funktion fenotyper i stora skärmar.

Positiva och negativa kontroller:

Det är kritiskt att innefatta både positiva och negativa kontrollbakterier i varje matningsplattan vid utförande av skärmar. Den negativa kontrollen är särskilt viktigt om beteendetester kommer att användas för att identifiera gener av intresse. För en negativ kontroll använder vi bakterier som innehåller den tomma vektorn pL4440. För en positiv kontroll, är det bäst att använda bakterier som uttrycker dsRNA mot en gen som orsakar den önskade knockdown fenotyp. Om inga sådana gener är vetn, bör en positiv kontroll för knockdown användas som orsakar en lätt observerbar fenotyp. När du väljer en sådan gen, ska företräde ges till gener som uttrycks i vävnadstyp riktade i skärmen. Till exempel i dsRNA utfodring skärmar för neuronala fenotyper, en neuronal gen bör väljas som en positiv kontroll. En observerbar knockdown effekt i djur som äter de positiva kontroll bakterier indikerar att dsRNA störningar arbetar i önskad vävnad.

Det bästa är om den som scoring matningsplattor för fenotyper är blind för placeringen av de positiva kontrollbrunnarna. Den screener bör kunna enkelt identifiera de positiva brunn i varje 96-brunnars platta. För beteendemässiga analyser är det bra att göra mål den negativa väl först innan du skannar de återstående brunnarna.

Genomströmning:

Med hjälp av detta protokoll, ska en person kunna ställa upp och skärm 16, 12-brunnars plattorper dag. För att flytta effektivt genom biblioteket, vi vanligen testar varje brunn i varje bibliotek platta endast en gång under en skärm. Alla brunnar som görs som positivt registreras och testas i tre exemplar. Vi kräver att de positiva brunnarna åter testa i alla tre retests. Plasmiden renas sedan från bakterierna och insatsen sekvenseras för att positivt identifiera genen. Om null mutanter är tillgängliga för genen, kommer vi beställa dem och testa noll djur för beteende felet identifieras på skärmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate	Fisher Scientific	353072	sterile
adhesive foil	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock	USA Scientific	5678-0285	autoclavable
Lids for deep well plates	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	individually wrapped
Reservoir	USA Scientific	2977-8500	autoclavable
12-well plates	USA Scientific	CC7682-7512	individually wrapped
dsRNA feeding library	OpenBiosystems	RCE1181	store -80 °C
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912-100
Carbenicillin			allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A	Affymetrix	10906	for worm plates
Equipment
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B–kel 96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	autoclavable
microshaker	Thomas Scientific	1231A93	3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl)	USA Scientific	7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl)	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus manual pipettor	USA Scientific	4026-0201