Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना में Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

DsRNA सी. में खिला एलिगेंस बड़े पैमाने पर खिला स्क्रीन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल चर पछाड़ना क्षमता में परिणाम जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हम जीन अभिव्यक्ति की अत्यधिक प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पछाड़ना में यह परिणाम है कि बड़े पैमाने पर आरएनएआई खिला स्क्रीन प्रदर्शन के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

DsRNAs व्यक्त कीड़े बैक्टीरिया खिलाने से शाही सेना के हस्तक्षेप सी में जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण किया गया है एलिगेंस. जीन की एक छोटी संख्या पछाड़ना के लिए लक्षित कर रहे हैं जब यह रणनीति अच्छी तरह से काम करता है, बड़े पैमाने पर खिला स्क्रीन उनकी उपयोगिता की सीमा है, जो चर पछाड़ना क्षमता दिखा. हम पहले प्रकाशित आरएनएआई पछाड़ना प्रोटोकॉल deconstructed और कम पछाड़ना का प्राथमिक स्रोत जानवरों को खिलाया बैक्टीरिया से dsRNA एन्कोडिंग plasmids के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि मिल गया है. इन टिप्पणियों के आधार पर, हम बहुत कम कर देता है या कुशल, उच्च throughput पछाड़ना प्राप्त करने के लिए प्लाज्मिड नुकसान समाप्त कि एक dsRNA खिला प्रोटोकॉल विकसित किया है. हम इस प्रोटोकॉल सी. के नीचे मजबूत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दस्तक उत्पादन होगा दिखाना है कि एलिगेंस न्यूरॉन्स सहित कई प्रकार के ऊतकों में जीन, और बड़े पैमाने पर स्क्रीन में कुशल पछाड़ना की अनुमति होगी. इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA खिलाने का उपयोग करता हैपुस्तकालय और पुस्तकालय नकली और dsRNA स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक सभी कदम का वर्णन है. प्रोटोकॉल किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, और इसलिए किसी भी सी. द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है प्रयोगशाला एलिगेंस.

Introduction

सी. में ऐतिहासिक, आनुवंशिक स्क्रीन एलिगेंस डीएनए के भीतर यादृच्छिक म्यूटेशनों बनाने के लिए इस तरह की एथिल methanesulfonate के रूप में एक रासायनिक उत्परिवर्तजन के साथ पशुओं के उपचार के द्वारा प्रदर्शन किया गया है. Mutagenized जानवरों की संतान या grandprogeny तो है कि निशंक एक वांछित असामान्य फेनोटाइप अलग कर रहे हैं. phenotype के कारण के लिए जिम्मेदार उत्परिवर्तन तो एक श्रम प्रधान मानचित्रण प्रक्रिया के माध्यम से या उत्परिवर्ती कीड़ा के पूरे जीनोम अनुक्रमण द्वारा की पहचान की है. वहाँ वे दोनों लाभ समारोह का और नुकसान के समारोह phenotypes में परिणाम कर सकते हैं कि कीड़ा जीनोम के भीतर स्थायी घावों बनाने के रूप में इस तरह के रासायनिक mutagenesis स्क्रीन प्रदर्शन करने के कई फायदे हैं, लेकिन मानचित्रण प्रक्रिया धीमी और महंगी है.

डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (dsRNAi) महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक साधन उपलब्ध कराता है. इस विधि में, एक अंतर्जात जीन की कोडिंग अनुक्रम मिलान dsRNA कीड़ा में शुरू की है.dsRNA गाइड विनाश 1 के लिए उन्हें निशाना बनाते मिलान अंतर्जात mRNAs लगता है और बाध्य करने के लिए के रूप में सेवा है कि छोटे (21-22 न्यूक्लियोटाइड) RNAs उत्पन्न करने के लिए vivo में कार्रवाई की है. यह प्रक्रिया अपेक्षाकृत जल्दी है, लेकिन dsRNA बल्कि डीएनए से mRNA लक्ष्य है, क्योंकि केवल कमी के समारोह phenotypes इस दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं मनाया.

एक जानवर में dsRNAs का परिचय dsRNA 3 में जानवरों भिगोने से, या dsRNA 4 व्यक्त जानवरों है कि बैक्टीरिया भोजन करके, dsRNA 2 के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. पशु की सबसे कोशिकाओं सिड -1, dsRNA 5 आयात करने में सक्षम एक transmembrane चैनल व्यक्त के रूप में इन प्रसव के तरीके में से प्रत्येक प्रणालीगत पछाड़ना प्रभाव के कारण. मूल रूप से एक समय में व्यक्तिगत जीनों की अभिव्यक्ति एक पछाड़ना के लिए एक रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया, दो खिला पुस्तकालयों का विकास अब बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन परमिट. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध dsRNA पुस्तकालयों बीए होतेसभी सी. के 55% या 87% या तो का प्रतिनिधित्व cterial क्लोन एलिगेंस जीन 6, 7.

दुर्भाग्य से, बड़े पैमाने dsRNAi खिला स्क्रीन अक्सर चर पछाड़ना क्षमता 8-10 में परिणाम. आरएनएआई द्वारा पछाड़ना की पूर्ण स्तर आसानी से मापा नहीं है, वहीं बड़े पैमाने पर स्क्रीन में मनाया कम पछाड़ना दक्षता आरएनएआई द्वारा गिरावट से बच कि अवशिष्ट जीन विशिष्ट mRNAs की वजह से किया जाना चाहिए. यह, बारी में, इन स्क्रीन में पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया से dsRNA प्लाज्मिड घटाने का एक सीधा परिणाम हो सकता है. पछाड़ना प्रभाव फेड जानवरों 11 को नियंत्रित करने के लिए जब तुलना में (यदि हो तो) इस विचार का समर्थन, जानवरों बैक्टीरिया का केवल 50% एक लक्षित जीन के खिलाफ dsRNAs व्यक्त जिसमें, बैक्टीरिया का मिश्रण खिलाया, नाटकीय रूप से कम दिखा. सी. में सबसे जीन के रूप में dsRNAi स्क्रीन प्रदर्शन जब जीन पछाड़ना की हद तक एक गंभीर चिंता का विषय बन जाता है एलिगेंस haplosufficient हैं और इस तरह के जीन की अभिव्यक्ति में कम से कम 50% टी से कम किया जाना चाहिएओ घाटे का समारोह 12 phenotypes कारण.

हम बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पहले से प्रकाशित खिला प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया और दूसरों 8-10 द्वारा रिपोर्ट एक ही चर पछाड़ना प्रभाव पाया गया है. संभावित कारणों के लिए एक खोज में, हम स्क्रीन में पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया का लगभग 60% dsRNA प्लाज्मिड खो दिया था पाया. हम नाटकीय रूप से कम कर देता है या समाप्त प्लाज्मिड नुकसान और बहुत पछाड़ना दक्षता में सुधार एक पुस्तकालय दोहराव और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल विकसित किया है. इस प्रोटोकॉल सी. में बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन के लिए उपयुक्त है एलिगेंस और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA पुस्तकालयों में से एक या तो स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम स्क्रीन के दौरान पशुओं को खिलाया बैक्टीरिया का अनिवार्य रूप से 100% dsRNA एन्कोडिंग प्लाज्मिड बनाए रखने और जांच की सभी ऊतकों में समारोह phenotypes की मजबूत और अत्यधिक व्याप्ति के झड़ने का कारण हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल ऊतक प्रकार की एक किस्म में जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्क्रीन के दौरान एक आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में, जानवरों लक्षित ऊतकों में आरएनएआई प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए नियंत्रण dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया फेड दोनों सकारात्मक और नकारात्मक हैं.

अन्य प्रकाशित खिला प्रोटोकॉल 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन या 25 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन 8-10 या तो की उपस्थिति में dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया बढ़ने. हम इन स्थितियों में से किसी के अधीन हो बैक्टीरिया उच्च आवृत्ति पर dsRNA प्लाज्मिड खो मिल गया है. दरअसल, हम बैक्टीरिया एम्पीसिलीन की बहुत उच्च सांद्रता (अप करने के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल) बैक्टीरिया का 50% से अधिक में रातोंरात बड़े हो रहे हैं, तब भी जब नहीं रह प्लाज्मिड होते हैं कि मिल गया है. कार्बेनिसिलिन में वृद्धि आम तौर पर प्लाज्मिड के उच्च बनाए रखने में हुई है, जबकि 25 माइक्रोग्राम / एमएल प्लाज्मिड नुकसान को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं था. इसके बजाय, हम उस कार्बेनिसिलिन concentra पाया500 माइक्रोग्राम / एमएल का माहौल तरल संस्कृतियों और बैक्टीरिया ठोस अगर substrates पर हो गया जब 2 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन प्लाज्मिड नुकसान ब्लॉक करने के लिए आवश्यक था में वृद्धि के दौरान प्लाज्मिड नुकसान ब्लॉक करने के लिए आवश्यक थे.

प्लाज्मिड प्रतिधारण पछाड़ना की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि dsRNA बैक्टीरिया इस प्रोटोकॉल में सुसंस्कृत हैं, तो केवल कार्बेनिसिलिन प्रयोग किया जाता है. हम ध्यान से प्लाज्मिड शामिल नहीं है कि बैक्टीरिया इन संस्कृतियों में जाना नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित बैक्टीरियल वृद्धि संस्कृतियों में इस्तेमाल किया कार्बेनिसिलिन की एकाग्रता अनुकूलित है. हालांकि, एक गुणवत्ता नियंत्रण के उपाय के रूप में, प्लाज्मिड नुकसान प्रोटोकॉल के कई चरणों में निर्धारित किया जाता है. कुशल पछाड़ना सुनिश्चित करने के लिए, इन चरणों में से प्रत्येक में बैक्टीरिया की 80% से अधिक dsRNA प्लाज्मिड शामिल होना चाहिए. प्रोटोकॉल के किसी भी कदम पर बैक्टीरिया का 20% से अधिक dsRNA प्लाज्मिड खो दिया है, इस्तेमाल किया कार्बेनिसिलिन की गुणवत्ता की जांच. कार्बेनिसिलिन यह प्रयोग किया जाता है ताजा दिन के लिए तैयार रहना चाहिए. तैयार करना ताजा कार्बेनिसिलिन और संस्कृति को दोहराएँ.

1. प्लाज्मिड हानि का निर्धारण कैसे करें

  1. बैक्टीरिया का एक छोटा सा नमूना निकालें (प्रत्येक प्रासंगिक कदम पर वर्णित है) और 450 μl बाँझ पानी में जोड़ें.
  2. अच्छी तरह से कमजोर पड़ने के बीच समाधान मिश्रण, बाँझ पानी का उपयोग करते हुए आगे 1:10, 1:100, और 1:1,000 धारावाहिक dilutions बनाने के लिए इस पतला नमूना के 100 μl का प्रयोग करें.
  3. लेग और लेग एएमपी प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl बिखरा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इन प्लेटों सेते
  4. अगले दिन, 100 और 500 बैक्टीरियल कालोनियों के बीच होता है कि लेग प्लेट की पहचान. (बैक्टीरिया की इसी कमजोर पड़ने से युक्त) इस प्लेट पर और इसी लेग एएमपी प्लेट पर कालोनियों की संख्या की गणना.
  5. इन कॉलोनी गिनती से प्लाज्मिड हानि का निर्धारण. प्लाज्मिड 1 समीकरण का उपयोग कर की गणना है शामिल नहीं है, और प्रभावी dsRNA नीचे दस्तक के लिए कम से कम 15% होना चाहिए कि बैक्टीरिया का प्रतिशत.

</ HTML"समीकरण 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. डुप्लिकेट लाइब्रेरी प्लेट बनाने

अवलोकन: dsRNA पुस्तकालय 96 अच्छी तरह प्लेटें में 10,566 बैक्टीरियल क्लोन के रूप में निर्माता (OpenBiosystems) से आ जाएगा. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में तुरंत प्लेटें स्टोर. मूल पुस्तकालय प्लेटें दोहराया जाएगा और सभी खिला स्क्रीन बैक्टीरिया के स्रोत के रूप में नकली पुस्तकालय प्लेटों का उपयोग करेगा. यह मूल की दुकान और अलग फ्रीजर में पुस्तकालय प्लेटें नकल करने की सलाह दी जाती है. प्रति दिन केवल 10 पुस्तकालय प्लेटें duplicating, से निपटने में आसानी सिफारिश की है के लिए.

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पुस्तकालय प्लेट (ओं) निकालें और संस्कृतियों अभी भी जमे हुए हैं जबकि पन्नी सील हटा दें. पुस्तकालय प्लेट के प्लास्टिक कवर बदलें और (अब 30 मिनट से अधिक) कमरे के तापमान पर पिघलना करने के लिए एक स्तर की सतह पर थाली सेट.

नोट: हम देखा है कि एक महत्वपूर्ण पीमूल पुस्तकालय प्लेटों के प्रत्येक कुएं में पाया बैक्टीरिया के ercentage प्लाज्मिड शामिल नहीं है. पुस्तकालय बैक्टीरिया एक बहुमूल्य संसाधन हैं तथापि, क्योंकि यह मूल पुस्तकालय संस्कृतियों में प्लाज्मिड घटाने के लिए परीक्षण करने के लिए सिफारिश नहीं है.

  1. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, एक खाली 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे डुप्लिकेट प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए पुस्तकालय दोहराव मीडिया के 150 μl जोड़ें.
  2. ऊपर pipetting द्वारा और चार 100 μl करने के लिए सेट एक multichannel विंदुक का उपयोग कर पांच गुना नीचे thawed पुस्तकालय बैक्टीरियल संस्कृतियों का मिश्रण. फिर एक मिश्रित संस्कृति के 10 μl हटाने और डुप्लिकेट प्लेट की इसी वेल्स को हस्तांतरण. प्रत्येक हस्तांतरण के लिए पिपेट सुझावों को बदलने के लिए कुछ कर रही है थाली नकल करने के लिए पुस्तकालय की थाली से संस्कृतियों स्थानांतरित करने के लिए आगे बढ़ें.
  3. एक पुस्तकालय की थाली से सभी संस्कृतियों का तबादला किया गया है, के बाद एक पूरी तरह से सील सुनिश्चित करने के लिए एक brayer रोलर का उपयोग नई चिपकने वाला पन्नी के साथ मूल पुस्तकालय थाली के कुओं को कवर किया. थाली पर प्लास्टिक के ढक्कन बदलें औरसंस्कृतियों (कम से कम 30 मिनट) refrozen है जब तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सीधा रखें. फिर एक पुस्तकालय भंडारण बक्से में वापस मूल पुस्तकालय प्लेटें चाल है.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस (एक microshaker, कक्षा 3 मिमी पर 450 आरपीएम) में 8-10 घंटे के लिए फ्लैट डुप्लिकेट पुस्तकालय थाली संस्कृतियों हिलाएँ.
  5. प्रत्येक डुप्लिकेट पुस्तकालय थाली में प्लाज्मिड हानि का निर्धारण. हम मूल पुस्तकालय थाली के प्रत्येक कुएं में बैक्टीरिया के एक उच्च अनुपात dsRNA प्लाज्मिड शामिल नहीं किया था कि पाया. यह इन जीवाणुओं डुप्लिकेट पुस्तकालय में वृद्धि करने के लिए योगदान नहीं है कि महत्वपूर्ण है. उनके विकास को रोकने के लिए, कार्बेनिसिलिन के एक उच्च एकाग्रता पुस्तकालय दोहराव मीडिया (3 मिलीग्राम / एमएल) में प्रयोग किया जाता है. इन शर्तों का उपयोग दोहराव प्लेट की संस्कृति के बाद हम बैक्टीरिया की 90% से अधिक dsRNA प्लाज्मिड होते पाया. प्रत्येक डुप्लिकेट प्लेट की एक प्रतिनिधि संस्कृति में अच्छी तरह से 10 μl नमूना निकालें और 450 μl बाँझ पानी में जोड़ें. इन पतला नमूनों का प्रयोग, प्रत्येक डुप्लिकेट पुस्तकालय में प्लाज्मिड नुकसान का निर्धारणकदम 1.1-1.4 के अनुसार थाली. महत्वपूर्ण प्लाज्मिड नुकसान मनाया जाता है (> डुप्लीकेट पुस्तकालय में बैक्टीरिया की 20% प्लाज्मिड शामिल नहीं है), ताजा कार्बेनिसिलिन का उपयोग संस्कृति मीडिया रीमेक और 2.1 कदम से प्रोटोकॉल दोहराएँ.
  6. ऊष्मायन के बाद, डुप्लिकेट प्लेट कुओं पर सीधे एक नया पन्नी चिपकने वाला पत्रक जगह है, और यह पन्नी पर थाली lids जगह है. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (कम से कम 30 मिनट) जमे हुए जब तक में ईमानदार डुप्लिकेट पुस्तकालय प्लेटें प्लेस. एक बार जम, लंबी अवधि के भंडारण के लिए डुप्लिकेट पुस्तकालय भंडारण बॉक्स के लिए प्लेटों के लिए कदम.

3. Omniplates पर लाइब्रेरी की अस्थाई प्रतियां बनाने

अवलोकन: एक dsRNA स्क्रीन के लिए भोजन तैयार करने के लिए शुरू करने के लिए, डुप्लिकेट पुस्तकालय प्लेटों से बैक्टीरिया ठोस अगर omniplates को हस्तांतरित और रात में बड़े हो रहे हैं. ठोस मीडिया पर प्लाज्मिड नुकसान को रोकने के लिए, omniplates 2 मिलीग्राम / एमएल पर कार्बेनिसिलिन होते हैं. इन प्लेटों पर बैक्टीरिया अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक सप्ताह की है, और कोई प्लाज्मिड नुकसान दिखा. हम एक सप्ताह से अधिक समय omniplates पर हो बैक्टीरिया में प्लाज्मिड घटाने के लिए परीक्षण नहीं किया है.

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से डुप्लिकेट पुस्तकालय प्लेट (ओं) निकालें और संस्कृतियों अभी भी जमे हुए हैं जबकि पन्नी सील बंद रखना. पन्नी को हटाने के बाद, थाली के प्लास्टिक कवर की जगह और (अब 30 मिनट से अधिक) कमरे के तापमान पर पिघलना करने के लिए एक स्तर की सतह पर डुप्लिकेट पुस्तकालय थाली सेट.
  2. Boekel 96 पिन प्रतिलिपिकार जीवाणुरहित. एक साफ प्रतिलिपिकार के पिन आसुत पानी से rinsed और फिर प्रत्येक का उपयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए. , प्रतिलिपिकार बाँझ एक इथेनॉल स्नान (एक Pyrex पकवान में गहरे में 3/4) में डाल दिया और फिर एक लेम्प बर्नर का उपयोग बंद पिंस कोटिंग इथेनॉल को जलाने की. आग बुझाने के लिए और फिर दोहराने की अनुमति दें.
  3. Thawed डुप्लिकेट थाली के कुओं में निष्फल प्रतिलिपिकार प्लेस और धीरे संस्कृतियों हलचल करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं. संस्कृति की छोटी मात्रा प्रतिलिपिकार के पिन का पालन करना होगा.
    4. <ली> ध्यान से डुप्लिकेट थाली के कुओं से प्रतिलिपिकार हटाने और अगर सतह बेध नहीं सावधान किया जा रहा है, धीरे omniplate की सतह पर (पिन नीचे) यह जगह. प्रतिलिपिकार के पिन से बैक्टीरिया अगर सतह पर स्थानांतरित कर रहे हैं कि इतने 3-4 सेकंड के लिए omniplate की सतह पर प्रतिलिपिकार छोड़ दें.
  4. प्रतिलिपिकार निकालें और जीवाणु संस्कृति की छोटी मात्रा (2-3 μl) अगर में अवशोषित करने के लिए अनुमति देते हैं. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-18 घंटे के लिए उल्टे omniplates सेते ये omniplates 96 अच्छी तरह से तरल संस्कृतियों टीका लगाना अगली सुबह इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, रात भर बैक्टीरियल कालोनियों युक्त omniplates 4 डिग्री सेल्सियस पर सात दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता
  5. प्रतिकृति हस्तांतरण अतिरिक्त डुप्लीकेट प्लेटें, बाँझ पानी के साथ प्रतिलिपिकार सुझावों कुल्ला और इथेनॉल में प्रतिलिपिकार रखकर और पहले की तरह, दो बार यह ज्वलंत द्वारा नसबंदी प्रक्रिया को दोहराने. एक बार निष्फल, प्रतिलिपिकार अगले डुप्लिकेट प्लेट पर इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. कीड़े को दूध पिलाने के लिए बैक्टीरिया की तैयारी

हेverview: खिला कीड़े के लिए बैक्टीरिया omniplates से बैक्टीरिया का उपयोग कर (एक साथ 96 प्रारूप में) 1 मिलीलीटर तरल संस्कृतियों के रूप में तैयार कर रहे हैं. ये तरल संस्कृतियों संतृप्त nonlogarithmic बैक्टीरियल संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए रातोंरात बड़े हो रहे हैं. रातों रात विकास सभी संस्कृतियों बैक्टीरिया के समान सांद्रता में शामिल होंगे और इसलिए सभी कीड़े भोजन का एक ही राशि खिलाया जाएगा सुनिश्चित करता है. इस विकास के दौरान कोई प्लाज्मिड नुकसान मनाया जाना चाहिए.

  1. एक दोहराने pipettor और 50 मिलीलीटर Combitip का उपयोग कर 2 मिलीलीटर गहरे अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में बैक्टीरिया विकास मीडिया के 1 एमएल बांटना.
  2. 3.1-3.6 पिंस 96 बैक्टीरियल कालोनियों में से प्रत्येक के साथ संपर्क में हैं जो कुछ कर रही है कदम में उत्पन्न बैक्टीरियल कालोनियों युक्त omniplates की सतह पर बाँझ प्रतिलिपिकार रखें.
  3. ध्यान से विकास मीडिया में डूब जब तक पिंस गहरे कुओं के पक्ष कुरेदना नहीं है कि कुछ कर रही गहरी अच्छी तरह से थाली में omniplate की सतह से प्रतिलिपिकार चाल है. हटोप्रतिलिपिकार धीरे - धीरे विकास मीडिया में बैक्टीरिया बेदखल करने के लिए गहरी अच्छी तरह से थाली के अंदर दीवार के बाद एक वर्ग गति में. छप और पार कुओं को दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  4. नियंत्रण कुओं: प्रत्येक 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से गहरी संस्कृति की थाली के लिए कि उम्मीद पछाड़ना phenotype के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य और किसी अन्य के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में खाली dsRNA वेक्टर (pL4440) युक्त बैक्टीरिया अच्छी तरह से जोड़ देगा एक अच्छी तरह से करने के लिए एक dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया जोड़ . हम फिर लकीर नियंत्रण dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया ताजा रहते हैं और प्लाज्मिड बनाए रखने के लिए इतना है कि टेट्रासाइक्लिन (15 माइक्रोग्राम / एमएल) और कार्बेनिसिलिन (2 मिलीग्राम / एमएल) युक्त लेग प्लेटों पर एक बार प्रति सप्ताह बैक्टीरिया.
  5. एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना (प्रतिलिपिकार द्वारा स्थानांतरित बैक्टीरिया का एक ही मात्रा के बारे में) नियंत्रण थाली में से एक भी अच्छी तरह से पृथक कॉलोनी को हटाने और गहरे कुएं संस्कृति की थाली में एक खाली अच्छी तरह से टीका लगाना. टीका दिया गया है कि अच्छी तरह से स्थिति रिकार्ड. वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया सी के साथ पाशएक 250 μl विकास मीडिया वाले एक Eppendorf ट्यूब में ले जाया जा, vortexed और फिर कई कुओं टीका लगाना करते थे.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर: (3 मिमी कक्षा) microshaker पर 650 rpm पर एक फ्लैट स्थिति में गहरी अच्छी तरह प्लेटें हिलाएँ. संस्कृतियों अगली सुबह से संतृप्त किया जाएगा. भले ही, इन संस्कृतियों में इस्तेमाल किया कार्बेनिसिलिन की एकाग्रता प्लाज्मिड नुकसान को रोकने चाहिए.
  7. 1 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृतियों में प्लाज्मिड हानि का निर्धारण. संस्कृतियों स्क्रीन के लिए कीड़े को खिलाने के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाएगा. यह हर संस्कृति में बैक्टीरिया की 80% से अधिक dsRNA प्लाज्मिड होते हैं कि महत्वपूर्ण है. कदम 1.1-1.4 के अनुसार दो प्रतिनिधि संस्कृतियों के लिए प्लाज्मिड हानि का निर्धारण. उम्मीद: हर संस्कृति में बैक्टीरिया की 90% से अधिक dsRNA प्लाज्मिड शामिल होंगे. हम संतृप्ति हो गई, तब भी जब इन रातोंरात संस्कृतियों में महत्वपूर्ण प्लाज्मिड नुकसान कभी नहीं देखा है. महत्वपूर्ण प्लाज्मिड नुकसान मनाया जाता है हालांकि, अगर (> 20%), ताजा कार्बेनिसिलिन और प्रतिनिधि का उपयोग कर विकास मीडिया रीमेक4.1 कदम से प्रोटोकॉल खाते हैं. संस्कृति के रूप में लंबे omniplates कम से कम 1-2 सप्ताह पुराने हैं के रूप में मूल omniplates से फिर आरंभ किया जा सकता है.
  8. स्क्रीन पूरा हो गया है और किसी भी retest संस्कृतियों शुरू करने के लिए भोजन के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब तक एक बार 1 मिलीलीटर संस्कृतियों शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया, omniplates 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है.
  9. संस्कृतियों की रात ऊष्मायन के बाद, गहरी अच्छी तरह से थाली से जीवाणु संस्कृति की 150 μl हटाने और खिला थाली की सतह पर बेदखल करने के लिए एक 12 चैनल multichannel विंदुक का उपयोग करें. यह कीड़े dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया पर फ़ीड बिल और नहीं होगा के रूप में स्थानांतरण के दौरान अगर की सतह को बेध नहीं महत्वपूर्ण है. स्थानांतरण एक समय (चित्रा 1) में चार कुओं किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, (पंक्ति में केवल 4 कुओं खिला थाली में वहाँ के रूप में) multichannel विंदुक का हर तीसरा चैनल पर विंदुक युक्तियाँ जगह है. 4 कुओं के प्रत्येक सेट का तबादला हो जाने के बाद, नया, बाँझ विंदुक युक्तियाँ करने के लिए बदल जाते हैं. प्रत्येक 96 गहरे अच्छी तरह से संस्कृति की थाली 96 सुझावों की आवश्यकता होगीआठ 12 अच्छी तरह खिला प्लेटों के स्थानांतरण के लिए.
  10. बैक्टीरिया अगर में अवशोषित कर सकते हैं तो स्टोर अंधेरे में रात भर में ईमानदार प्लेटें वरीयता प्राप्त.

5. जनरेटिंग एल 1 सी. गिरफ्तार एलिगेंस लार्वा

अवलोकन: एल 1 से गिरफ्तार लार्वा dsRNA खिला प्लेटों पर सिंक्रनाइज़ कीड़ा संस्कृतियों शुरू करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये लार्वा स्वस्थ अंडे को अलग करने के लिए गर्भवती वयस्कों की आबादी विरंजन और फिर अंडे खाना बिना एस पूरा मीडिया में पक्षियों के बच्चे की अनुमति से उत्पन्न कर रहे हैं. भोजन के अभाव में रची एल 1 लार्वा एल 1 लार्वा का एक तुल्यकालिक आबादी सृजन, विकास गिरफ्तार करेगी. इन भूखे पशुओं से अधिक समय के लिए बीमार हो जाते हैं और त्याग किया जाना चाहिए के रूप में स्क्रीन के दौरान हर हफ्ते ताजा एल 1 से गिरफ्तार लार्वा तैयार करते हैं. लिन-15B म्यूटेंट सिफारिश कर रहे हैं; neuronal स्क्रीन के लिए इरी-1 एक dsRNA खिला तनाव में प्रयुक्त जानवर की आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चुनाव, आवेदन के आधार पर भिन्न हो सकती हैं.

  1. 10-20 L4 ला उठाओOP50 बैक्टीरिया की एक लॉन युक्त और प्लेट तक 6-7 दिनों के इंतजार के छह अलग एन जी एम प्लेटों को rvae कई हौसले से रखी अंडे और गर्भवती वयस्कों होता है.
  2. प्रत्येक थाली की सतह पर पानी के 3 मिलीलीटर जोड़कर प्लेटों से जानवरों और अंडे निकालें और पानी में एक थाली की सतह से अंडे, बैक्टीरिया, और जानवरों को बेदखल करने के लिए एक दस्ताने उंगली का उपयोग करें. बैक्टीरियल लॉन पर विशेष ध्यान दे, थाली के सभी क्षेत्रों को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें. एक गिलास पिपेट का उपयोग प्रत्येक थाली से पानी, बैक्टीरिया, कीड़े और अंडे निकालें और एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण.
  3. शेष सभी बैक्टीरिया, कीड़े और अंडे को दूर करने के लिए सतह भर में नीचे और ऊपर pipetting, प्रत्येक थाली की सतह पर पानी की एक और 3 मिलीलीटर जोड़ें. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर इस मात्रा में जोड़ें.
  4. एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 1 मिनट के लिए 1500 rpm पर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन. कीड़े और अंडे ट्यूब के नीचे गोली चाहिए और बैक्टीरिया निलंबित रहना चाहिए. ध्यान से 4 मिलीग्राम लेकिन सभी महाप्राणट्यूब pelleted कीड़े और अंडे से बचने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा से तरल की.
  5. अवशिष्ट पानी में कीड़ा गोली Resuspend और एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण. बाँझ पानी के साथ 10 मिलीलीटर मात्रा लाओ.
  6. पहले के रूप में 1 मिनट के लिए 1500 rpm पर स्पिन. कीड़ा / अंडा गोली परेशान नहीं के रूप में तो 200 μl पानी छोड़ने पर तैरनेवाला aspirate.
  7. कीड़े और अंडे धोने और अतिरिक्त बैक्टीरिया को दूर करने के लिए पहले के रूप में स्पिन करने के लिए शंक्वाकार 10 मिलीलीटर पानी जोड़ें.

ध्यान दें: में 5.8-5.11 कीड़े कदम और अंडे एक ब्लीच समाधान के लिए सामने आ रहे हैं. ब्लीच कीड़े को नष्ट करने और अपेक्षाकृत अहानिकर अंडे छोड़ देंगे. अंडे भी लंबे समय ब्लीच समाधान में छोड़ दिया जाता है, तो हालांकि, वे भी नष्ट हो जाएगा. अंडे रहते हैं और अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए ब्लीच के संपर्क में नहीं है कि कुछ होने के लिए ब्लीच कदम 5.8 में जोड़ा जाता है जब एक टाइमर सेट.

  1. सतह पर तैरनेवाला के 200 μl लेकिन सभी निकालें, फिर गोली से परहेज, फिर 10 जोड़मिलीलीटर ब्लीच समाधान और एक टाइमर शुरू.
  2. कभी कभी उलटा द्वारा मिश्रण, 3-4 मिनट के लिए ब्लीच समाधान में कीड़े और अंडे सेते हैं. फिर एक tabletop अपकेंद्रित्र में 45 सेकंड के लिए 1500 rpm पर स्पिन. ट्यूब के नीचे में एक गोली के लिए देखो, यह मूल गोली की तुलना में छोटे और अधिक कॉम्पैक्ट किया जाना चाहिए और एक पीले रंग की उपस्थिति पर ले सकता है.
  3. गोली परेशान नहीं के रूप में तो पीछे 200 μl छोड़ने ब्लीच समाधान aspirate.
  4. एक और 10 मिलीलीटर ताजा ब्लीच समाधान जोड़ें और पहले की तरह पलटना. टाइमर में 10 मिनट पढ़ता है, फिर स्पिन और ब्लीच समाधान aspirate, पीछे 200 μl जा रही है और जल्दी से 10 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़ें. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे समाधान का परीक्षण करें. लार्वा और वयस्कों के कई के पीछे ज्यादातर अंडे छोड़ने, ब्लीच समाधान में भंग कर दिया जाना चाहिए.
  5. 45 सेकंड के लिए पहले के रूप में स्पिन, और फिर गोली परेशान नहीं इतनी के रूप में सतह पर तैरनेवाला aspirate. इस गोली में मुख्य रूप से अंडे को शामिल करना चाहिए और बहुत ढीला हो जाएगा.
  6. Anot जोड़ेंउसे 10 मिलीलीटर पानी, पीछे एक छोटे से पानी छोड़ने के स्पिन और महाप्राण मिश्रण को पलटना. यह जितना संभव ब्लीच समाधान निकालने के लिए महत्वपूर्ण है.
  7. , शंक्वाकार ट्यूब 4 एमएल एस पूरा मीडिया जोड़ें अंडे resuspend और एक बाँझ 100 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क को हस्तांतरण. बस काफी तेजी से कुप्पी की सामग्री चक्कर आने के लिए पैदा करने के लिए आगे बढ़ एक प्रकार के बरतन सेट पर एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें. यह वे पक्षियों के बच्चे जब एल 1 लार्वा का समर्थन करने के लिए पर्याप्त वातन प्रदान करेगा. 15 घंटा के भीतर अंडे के सभी एल 1 गिरफ्तार लार्वा का एक तुल्यकालिक आबादी उत्पादन रची किया जाना चाहिए था.

गिरफ्तार एल 1 लार्वा एक स्क्रीन के दौरान हर सप्ताह नए सिरे से बनाया जाना चाहिए. पहले बैच बनाया गया है, बाद में बैचों (OP50 के 100 μl रातोंरात संस्कृति युक्त) चार मानक, वरीयता प्राप्त 6 सेमी प्लेटों में से प्रत्येक के लिए (पिछले सप्ताह के बैच में से) 500 गिरफ्तार एल 1 लार्वा जोड़कर शुरू कर दिया, और 20 में incubated किया जा सकता है 4 दिनों के लिए सी °. चौथे दिन प्लेटें शामिल करना चाहिएकई अंडे और गर्भवती वयस्क और अधिक सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा के लिए ताजा अंडे तैयार करने के लिए प्रक्षालित किया जा सकता है.

6. दूध पिलाने की प्लेटों पर गिरफ्तार एल 1 लार्वा स्थानांतरित कर रहा है

अवलोकन: एक dsRNA स्क्रीन करने के लिए, 20-30 एल 1 गिरफ्तार लार्वा dsRNA खिला प्लेटों पर स्थानांतरित कर रहे हैं. जानवरों 2-3 दिनों के लिए dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया पर तंग आ जाने के बाद इस तरह के लार्वा गिरफ्तारी या मारक के रूप में जल्दी पछाड़ना प्रभाव मनाया जाएगा. आयोजित स्क्रीन पर निर्भर करता है, वांछित phenotypes खिला थाली पर रखा मूल जानवरों (P0 जानवरों) में या उनके वंशज (F1 जानवरों) में या तो देखा जा सकता है. phenotype की प्रस्तुति जिनकी अभिव्यक्ति नीचे गिरा दिया है जीन और ब्याज की जीन की आवश्यकता है, जिसमें विकास के दौरान समय से इनकोडिंग प्रोटीन की perdurance सहित चर की संख्या पर निर्भर करेगा. केवल 20-30 जानवरों के साथ dsRNA खिला संस्कृतियों शुरू एक से पहले P0 और F1 दोनों phenotypes के अवलोकन की अनुमति चाहिएimals खाद्य स्रोत के निकास.

आसानी से, खिला प्लेटों को 20-30 जानवरों हस्तांतरण पहले निर्धारित करने के लिए एल 1 की एकाग्रता गिरफ्तार एल 1 संस्कृति में पशुओं को गिरफ्तार कर लिया.

  1. जानवरों को वितरित करने के लिए गिरफ्तार एल 1 लार्वा युक्त Erlenmeyer फ्लास्क मिलाएं.
  2. 4-5 में एक गैरवरीय 6 सेमी एन जी एम थाली पर एक 10 μl विभाज्य और ड्रॉप के लिहाज से जगह निकालें सभी मीडिया पिपेट से निष्कासित कर दिया है कि सुनिश्चित करते हुए थाली के केन्द्र नीचे चला जाता है.
  3. पिपेट टिप के अंत का उपयोग कर प्लेट का व्यास तक फैला है कि तरल की एक सतत लाइन के लिए फार्म का कीड़ा निलंबन की डॉट्स फैल गया.
  4. तरल थाली में समाहित किया गया है और पशुओं को फैलाने से पहले एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग, तरल की रेखा के एक सिरे पर शुरू करने और दूसरे छोर के लिए जारी सभी जानवरों गिनती. यह कोई जानवर याद कर रहे हैं कि कुछ करने की विदारक गुंजाइश की लगातार refocusing आवश्यकता हो सकती है.
  5. तीन अलग 10 μl के लिए इस दोहराएँaliquots और कीड़ा निलंबन की μl प्रति कीड़े की औसत संख्या का निर्धारण और Erlenmeyer फ्लास्क पर इस नंबर पर सीधे रिकॉर्ड करने के लिए तीन नंबर औसत.

7. दूध पिलाने की स्क्रीन शुरू करें

अवलोकन: dsRNA स्क्रीन शुरू करने के लिए, 20-30 गिरफ्तार एल 1 लार्वा dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया की एक पतली लॉन युक्त 12 अच्छी तरह खिला प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं. दूध पिलाने की प्लेटें मानक निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) होते हैं और 500 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन (प्लाज्मिड नुकसान को रोकने के लिए) और 1 मिमी IPTG (dsRNA अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए) के साथ पूरक हैं. पशु 20 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए फ़ीड और विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है एक F1 स्क्रीन प्रदर्शन जब एक P0 स्क्रीन और 6-7 दिनों जब प्रदर्शन जानवरों के लिए दो विशिष्ट खिला regimens के 3 दिन हैं. खिला की अवधि, तथापि, स्क्रीन में मांग की विशिष्ट phenotypes के आधार पर अलग किया जा सकता है.

  1. एक तो तैयार करने के लिए एल 1 गिरफ्तार लार्वा और बाँझ पानी के निलंबन का प्रयोग करें2,000 कीड़े / एमएल युक्त lution. प्रत्येक 12 अच्छी तरह खिला थाली यह कीड़ा निलंबन के 120 μl की आवश्यकता होगी. जानवरों की एक भी वितरण सुनिश्चित करने और pipetting के लिए एक बाँझ जलाशय को जानवरों स्थानांतरित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं.
  2. हर तीसरे स्थान पर सुझावों के साथ स्थापित multichannel विंदुक का प्रयोग सीधे खिला प्लेटों की बैक्टीरियल लॉन पर स्थानांतरण कीड़ा समाधान के 10 μl (चित्रा 1 देखें). कीड़े dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया पर फ़ीड अगर में बिल और नहीं होगा, अगर की सतह को बेध नहीं ख्याल रखना.
  3. कीड़े जल्दी से व्यवस्थित रूप में, खिला प्लेटों के हर दो पंक्तियों के बाद (धीरे ​​बारे में यह स्लोशिंग द्वारा) जलाशय में कीड़ा समाधान रीमिक्स. सभी खिला प्लेटें कीड़े जब तक कीड़ा निलंबन वितरण जारी. प्रत्येक अच्छी तरह से 20-30 कीड़े हो रही है कि यह सुनिश्चित करने के लिए विदारक गुंजाइश के तहत जल्दी पर कुछ कुओं जांच करते हैं.
  4. एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक humidified बॉक्स में ईमानदार स्टोर प्लेटें. अगले दिन, wo के बादआरएम निलंबन थाली में समाहित किया गया है, प्लेटों को पलटना और 20 डिग्री सेल्सियस पर humidor पर लौटने इन प्लेटों पर पशु (P0 phenotypes के लिए) 3 दिनों के बाद मनाया और फिर 6 दिन बाद (F1 phenotypes के लिए) किया जा सकता है.

ध्यान दें: कीड़ा विकास के 7 दिनों के बाद खिला थाली पर बने हुए हैं कि बैक्टीरिया प्लाज्मिड घटाने के लिए परीक्षण किया गया है और लगभग 100% dsRNA प्लाज्मिड बनाए रखा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P0 पछाड़ना phenotypes dsRNA बैक्टीरिया व्यक्त जानवरों को खिलाने के 2-3 दिनों के बाद दिखाई देने लगेगा. कुछ जल्दी phenotypes लार्वा गिरफ्तारी और मारक में शामिल हैं और सभी खिला कुओं का 2-3% में मनाया जाना चाहिए. ये वही phenotypes भी F1 पीढ़ी पशुओं में मनाया जाएगा. हैच करने में विफल है कि एफ 1 अंडे की उपस्थिति एक अन्य आम F1 फेनोटाइप है, और साथ में, इन तीन phenotypes F1 स्क्रीन में सभी कुओं का लगभग 10% में मनाया जाएगा.

हम P0 और F1 phenotypes दोनों के लिए ऊतक प्रकार की एक किस्म में व्यक्त कई जीनों के लिए पछाड़ना प्रभाव की जांच करने के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया. हम भी neuronal ऊतक में पछाड़ना प्रभाव के लिए परीक्षण करना चाहते थे, इसलिए हमने इरी -1 इस्तेमाल किया, हमारे स्क्रीन में लिन-15B म्यूटेंट. इरी-1 और लिन-15B में उत्परिवर्तन, RRF-3 में परिवर्तन के साथ साथ, आरएनएआई 8,13,14 को बढ़ाकर संवेदनशीलता के कारण होता है कि परिवर्तन के लिए स्क्रीन में पहचान की गई.

EGL-30, dpy -17, पैट-10, और UNC-4: = "jove_content"> हम चार पछाड़ना के लिए जीन का परीक्षण किया. इन जीनों में से दो, EGL-30 और UNC-4, तंत्रिका तंत्र 15-17, एक जीन, पैट-10, शरीर दीवार पेशी 18 में व्यक्त किया जाता है, और चौथा जीन में व्यक्त कर रहे हैं, dpy -17, व्यक्त की है hypodermal कोशिकाओं 19 में. हम इरी-1 खिलाया; खाली pL4440 प्लाज्मिड निहित लेकिन उस लिन-15B जानवरों बैक्टीरिया एक dsRNA व्यक्त नहीं किया, हम किसी भी रूपात्मक या व्यवहार दोष (चित्रा 2A, 1 टेबल) का पालन नहीं किया.

EGL-30, सी. encodes जी प्रोटीन सबयूनिट की एलिगेंस ortholog GAQ. EGL-30 अशक्त म्यूटेंट जल्दी लार्वा के विकास के दौरान गिरफ्तारी, लेकिन कुछ अशक्त escapers और hypomorphic नुकसान के समारोह EGL-30 म्यूटेंट वयस्क मंच बन जाना और हरकत और अंडे बिछाने व्यवहार में खराब कर रहे हैं 20. जबहम एल 1 चरण इरी-1 खिलाया; lin15B लार्वा बैक्टीरिया EGL-30 dsRNA व्यक्त, हम लार्वा हरकत और अंडे बिछाने व्यवहार में स्पष्ट दोषों से पता चला है कि वयस्कों बनने के लिए बढ़ा पाया. तीन दिनों के बाद, पशुओं के लिए 100% EGL-30 के खिलाफ dsRNA खिलाया पंगु और (आंकड़े 2 बी, 1 टेबल) अंडे देना करने में असमर्थ थे. हम EGL-30 (ad810) अशक्त जानवरों में मनाया जाता है कि हमारे dsRNA पछाड़ना प्रयोगों में लार्वा गिरफ्तारी फेनोटाइप का पालन नहीं किया. हम EGL-30 dsRNA बैक्टीरिया पर चढ़ाया एल 1 जानवरों पहले ही EGL-30 के लिए प्रारंभिक विकास की आवश्यकता को पारित कर दिया था क्योंकि यह संभवतः है. यह खिला स्क्रीन के एक लाभ पर प्रकाश डाला गया: देर चरण phenotypes भी विकास के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि जीन के लिए मनाया जा सकता है.

dpy -17 सी में छल्ली गठन के लिए आवश्यक एक कोलेजन प्रोटीन encodes एलिगेंस 19. dpy -17 अशक्त म्यूटेंट जंगली प्रकार anim से छोटी और मोटी होती हैंए एल एस. हम dpy -17 dsRNA खिलाया P0 पशुओं में किसी भी रूपात्मक दोषों का पालन नहीं किया. हालांकि, F1 जानवरों का 98% Dpy फेनोटाइप (चित्रा -2, 1 टेबल) से पता चला है. छोटी और वसा P0 जानवरों की कमी dpy -17 जीन समारोह उचित शरीर आकारिकी के लिए जल्दी लार्वा चरणों में आवश्यक है कि इंगित करता है. Dpy -17 अन्य खिला स्क्रीन में लक्षित नहीं किया गया है, यह dsRNA इंजेक्शन 21 से नीचे गिरा दिया गया था. दिलचस्प है, dsRNA की संतान का केवल 30% यहाँ वर्णित खिला प्रोटोकॉल कम से कम कुछ जीनों के लिए, अधिक श्रम प्रधान इंजेक्शन दृष्टिकोण से भी अधिक कुशल है, सुझाव है कि Dpy phenotype दिखाया जानवरों इंजेक्शन.

पैट-10 शरीर दीवार मांसपेशियों ट्रोपोनिन सी, कैल्शियम 18 कि बाँध चार एफई हाथ रूपांकनों युक्त प्रोटीन encodes. पैट-10 dsRNA खिलाया लिन-15B जानवरों 3 दिन के भीतर रुक गया और टी अग्रणी अंडे नहीं रखी, हम इरी-1 की 100% में पाया गया किOA घातक phenotype (चित्रा 2 डी, 1 टेबल).

UNC-4 उदर की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त एक homeodomain प्रोटीन encodes और उचित synaptic इनपुट चुनाव 22,23 के लिए आवश्यक है. यह पिछले dsRNA खिला रणनीति 8,24 के लिए प्रतिरोधी साबित हो गया है क्योंकि हम एक परीक्षण जीन के रूप में UNC-4 चुना है. UNC-4 म्यूटेंट हरकत व्यवहार में एक दोष दिखा. Synaptic संपर्क में दोष का एक परिणाम के रूप में, UNC-4 म्यूटेंट 22,23 वापस करने में असमर्थ हैं. सिर पर prodded जब एक sinusoidal गति में स्वतंत्र रूप से वापस कि जंगली प्रकार के पशुओं की तुलना में, UNC-4 अशक्त म्यूटेंट वापस और के बजाय अक्सर तो चरम हो जाता है जो एक पृष्ठीय वंक, जिससे कसकर उनके midbody अनुबंध नहीं है कि के सिर और पूंछ एक coiled स्थिति में शरीर रखकर पशु स्पर्श,. हम जानवरों के 68% बीए में दोष से पता चला है कि हमारे पुस्तकालय तैयारी से UNC-4 dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया खिलाया पाया किcking. RRF-3 जानवरों फेड UNC-4 dsRNA हैं जब पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 8 (1 टेबल) का उपयोग कर मनाया 0% समर्थन दोष की तुलना में जब यह पछाड़ना दक्षता में एक नाटकीय सुधार है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पुस्तकालय दोहराव और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए चार्ट प्रवाह. स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दौरान उत्पन्न प्रत्येक 96 या 12 अच्छी तरह से थाली प्लेटों के बीच बैक्टीरिया हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि के साथ, संकेत दिया है. सितारे बैक्टीरिया प्लाज्मिड घटाने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, जिस पर कदम से संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. सी. के dsRNA पछाड़ना phenotypes विभिन्न प्रकार के ऊतकों में व्यक्त एलिगेंस जीन. ए) नियंत्रण जानवरों pL4440 खाली वेक्टर युक्त बैक्टीरिया खिलाया. काला तीर एक युवा वयस्क जानवर की स्थिति को दर्शाता है. सफेद तीर रखी अंडे के एक समूह की स्थिति को दर्शाता है. तस्वीर से पता चलता है कि उनके सामान्य शरीर के आसन के सबूत के रूप में स्वतंत्र रूप से जानवरों घूम रहा है. बी) पशु EGL-30 के खिलाफ dsRNA खिलाया. सभी जानवरों से रुक जानवरों की ठेठ एक कठोर उपस्थिति को गोद लिया है कि ध्यान दें. इसके अलावा थाली पर रखी अंडे का पूर्ण अभाव ध्यान दें. सी) पशु dpy-17 के खिलाफ dsRNA खिलाया. क्षेत्र में है कि वयस्क जानवरों नोट (तीर से चिह्नित एक) पैनल ए डी में दिखाया वयस्क जानवर की तुलना में कम और मोटी होती हैं) पशु पैट-10 के खिलाफ dsRNA खिलाया. सभी जानवरों रुक रहे हैं, लेकिन अभी भी तीर द्वारा चिह्नित, सिर के पास बैक्टीरिया का समाशोधन द्वारा संकेत के रूप में खिलाने के लिए उनके सिर की मांसपेशियों के लिए कदम हो सकता है. स्केल बार 1 मिमी.

फ़े द्वारा लक्षित dsRNA प्लाज्मिड या जीनeding लक्षित जीन की ऊतक अभिव्यक्ति टर्मिनल phenotype के साथ प्रतिशत जानवरों
pL4440 (नकारात्मक नियंत्रण) सभी व्यवहार के लिए wildtype
EGL-30 तंत्रिका - तंत्र 100% EGL और लकवाग्रस्त
dpy -17 हाइपोडर्मिस 98% Dpy
पैट-10 शरीर दीवार पेशी 100% रुक
UNC-4 तंत्रिका - तंत्र 68% बिछाने दोष

तालिका 1. जानवरों के टर्मिनल फेनोटाइप विभिन्न सी. में व्यक्त जीनों के खिलाफ dsRNA खिलाया ऊतकों एलिगेंस. एन = सभी जीनों के लिए 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम सी. में बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dsRNA खिला पुस्तकालय का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है एलिगेंस. हम पुस्तकालय नकल करने के लिए और प्रभावी ढंग से इस्तेमाल करने के लिए सभी निर्देश प्रदान करते हैं. हम इस दृष्टिकोण जानवर के विभिन्न ऊतकों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में शामिल जीन की पहचान करने में सक्षम है कि प्रदर्शित करता है. हम यहाँ वर्णन phenotypes (UNC, EGL, और Dpy) आसानी से नमूदार हो रहे हैं, इस प्रोटोकॉल लगभग किसी भी जैविक प्रक्रिया के लिए आवश्यक जीन के लिए खोज करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. उदाहरण के लिए, हम कीड़ा 25 में neurotransmission के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. जानवरों dsRNA व्यक्त बैक्टीरिया पर तंग आ गई है एक बार (आमतौर पर P0 स्क्रीन, F1 स्क्रीन के लिए 6-7 दिनों के लिए 3 दिन), वे खिला थाली से हटा दिया है और किसी भी व्यवहार phenotype के लिए परीक्षण किया जा सकता है.

प्लाज्मिड नुकसान:

हम कम पछाड़ना क्षमता के दौरान देखा कि पायाबड़े पैमाने पर dsRNA स्क्रीन सीधे कीड़े को खिलाया बैक्टीरिया से dsRNA प्लाज्मिड के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. DsRNA पुस्तकालय प्लाज्मिड पर इनकोडिंग β-lactamase, समय के साथ इन एंटीबायोटिक दवाओं की एकाग्रता को कम करने, एम्पीसिलीन और कार्बेनिसिलिन दोनों नीचा करने के लिए कार्य करता है क्योंकि प्लास्मिड नुकसान बैक्टीरिया विकास संस्कृतियों में होता है. एंटीबायोटिक की एकाग्रता पर्याप्त रूप से कम हो जाता है, प्लाज्मिड शामिल नहीं है कि बैक्टीरिया जीवित और संस्कृति आबाद कर सकते हैं. वे कम पछाड़ना सक्रियता दिखाई और अक्सर नुकसान के समारोह 11 phenotypes कारण नहीं है के रूप में dsRNA स्क्रीन में इस तरह के मिश्रित बैक्टीरियल संस्कृतियों के प्रयोग से बचा जाना चाहिए. हैरानी की बात है, हम प्लाज्मिड नुकसान के उच्च स्तर को भी एम्पीसिलीन (अप करने के लिए 2 मिलीग्राम / एमएल) की बहुत उच्च सांद्रता में उगाई बैक्टीरियल संस्कृतियों में हो पाया. कार्बेनिसिलिन β-lactamase से अधिक गिरावट के लिए प्रतिरोधी है, हम अभी भी यह आवश्यक 10-40 लोगों की तुलना में गुना अधिक थे कि कार्बेनिसिलिन की सांद्रता का उपयोग करने के लिए मिलासंस्कृति में सभी बैक्टीरिया dsRNA प्लाज्मिड बनाए रखा है यह सुनिश्चित करने के लिए पहले से प्रकाशित dsRNA खिला स्क्रीन 8-10,26 में इस्तेमाल किया.

क्योंकि सी. में सबसे जीन एलिगेंस यह जानवरों को खिलाया सभी बैक्टीरिया dsRNA व्यक्त कि गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है, haplosufficient हैं. यह अत्यधिक कुशल जीन पछाड़ना सुनिश्चित करता है और बड़े पैमाने पर स्क्रीन में नुकसान के समारोह phenotypes देख के संभावना बढ़ जाती है.

सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण:

यह स्क्रीन प्रदर्शन कर जब प्रत्येक खिला थाली में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रण बैक्टीरिया शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. व्यवहार परीक्षण ब्याज की जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा अगर नकारात्मक नियंत्रण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए हम खाली वेक्टर pL4440 युक्त बैक्टीरिया का उपयोग करें. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, यह वांछित पछाड़ना phenotype का कारण बनता है कि एक जीन के खिलाफ dsRNA व्यक्त कि बैक्टीरिया का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. हालांकि, ऐसी कोई जीन हैं जाननाएन, पछाड़ना के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण एक आसानी से दिखाई फेनोटाइप का कारण बनता है कि प्रयोग किया जाना चाहिए. इस तरह के एक जीन का चयन, वरीयता स्क्रीन में लक्षित ऊतक प्रकार में व्यक्त कर रहे हैं कि जीन को दी जानी चाहिए. उदाहरण के लिए, neuronal phenotypes के लिए dsRNA खिला स्क्रीन में, एक neuronal जीन एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में चुना जाना चाहिए. सकारात्मक नियंत्रण बैक्टीरिया पर खिला जानवरों में एक नमूदार पछाड़ना प्रभाव dsRNA हस्तक्षेप वांछित ऊतक प्रकार में काम कर रहा है कि संकेत जाएगा.

Phenotypes के लिए खिला प्लेटें स्कोरिंग व्यक्ति सकारात्मक नियंत्रण कुओं के स्थान पर अंधा होता है, तो यह सबसे अच्छा है. screener आसानी से एक 96 अच्छी तरह से थाली में सकारात्मक अच्छी तरह से पहचान करने में सक्षम होना चाहिए. व्यवहार assays के लिए यह शेष कुओं स्कैनिंग से पहले पहली बार नकारात्मक अच्छी तरह से स्कोर करने के लिए उपयोगी है.

Throughput:

इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, एक व्यक्ति 16, 12 अच्छी तरह प्लेटें और स्क्रीन स्थापित करने में सक्षम होना चाहिएप्रति दिन. पुस्तकालय के माध्यम से कुशलता से करने के लिए कदम, हम आम तौर पर एक स्क्रीन के दौरान केवल एक बार प्रत्येक पुस्तकालय थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से परीक्षण करें. के रूप में सकारात्मक बने कि किसी भी कुओं दर्ज कर रहे हैं और तीन प्रतियों में पुनर्परीक्षण कर रहे हैं. हम सकारात्मक कुओं सभी तीन retests में जांचना कि आवश्यकता होती है. प्लाज्मिड तो बैक्टीरिया से शुद्ध होता है और सम्मिलित सकारात्मक जीन की पहचान करने के लिए अनुक्रम है. अशक्त म्यूटेंट जीन के लिए उपलब्ध हैं, तो हम उन्हें आदेश और स्क्रीन में पहचान व्यवहार दोष के लिए अशक्त जानवरों का परीक्षण करेंगे.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य MH097163 के राष्ट्रीय संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया. कुछ उपभेदों रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर कार्यक्रम के एनआईएच कार्यालय (P40-OD010440) द्वारा वित्त पोषित है जो CGC, द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 79 Caenorhabditis एलिगेंस (सी एलिगेंस) जीन पछाड़ना तकनीक, DsRNA हस्तक्षेप जीन पछाड़ना बड़े पैमाने पर खिला स्क्रीन
बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; मजबूत घाटे का समारोह phenotypes उत्पन्न करने के लिए dsRNA दूध पिलाने पुस्तकालयों का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maher, K. N., Catanese, M., Chase,… More

Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes. J. Vis. Exp. (79), e50693, doi:10.3791/50693 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter