Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Storstilet Gene Knockdown i Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Mens dsRNA fodring i C. elegans er et kraftfuldt værktøj til at vurdere gen funktion, nuværende protokoller for storstilede fodring skærme resulterer i variable knockdown effektivitetsgevinster. Vi beskriver en forbedret protokol til at udføre storstilet RNAi fodring skærme, der resulterer i meget effektive og reproducerbar knockdown af genekspression.

Abstract

RNA-interferens ved at fodre orme bakterier udtrykker dsRNAs har været et nyttigt redskab til at vurdere gen funktion i C. elegans. Mens denne strategi fungerer godt, når et lille antal gener er målrettet til knockdown, storstilet fodring skærme viser variable knockdown effektivitetsgevinster, hvilket begrænser deres anvendelighed. Vi har deconstructed tidligere offentliggjorte RNAi knockdown protokoller og fandt, at den primære kilde til den reducerede knockdown kan tilskrives tab af dsRNA-kodende plasmider fra bakterier fodret til dyrene. Baseret på disse observationer, har vi udviklet et dsRNA'et fodring protokol, der i høj grad reducerer eller eliminerer plasmid tab at opnå en effektiv, high throughput knockdown. Vi viser, at denne protokol vil producere robuste, reproducerbar knock down C. elegans gener i flere vævstyper, herunder neuroner, og vil muliggøre en effektiv knockdown i store skærme. Denne protokol bruger en kommercielt tilgængelig dsRNA fodringbibliotek og beskriver alle de nødvendige skridt for at duplikere biblioteket og udføre dsRNA skærme. Protokollen kræver ikke brug af enhver avanceret udstyr, og derfor kan udføres af enhver C. elegans lab.

Introduction

Historisk, genetiske skærme i C. elegans er blevet udført ved behandling af dyr med et kemisk mutagen, såsom ethylmethansulfonat at skabe tilfældige mutationer i DNA. Afkom eller grandprogeny af mutageniserede dyr isoleres derefter som udviser en ønsket unormal fænotype. Mutationen ansvarlig for at forårsage fænotypen identificeres derefter gennem en arbejdskrævende kortlægning procedure eller ved sekventering mutant ormens hele genomet. Der er mange fordele ved at udføre sådanne kemisk mutagenese skærme da de skaber permanente læsioner inden ormen genomet, der kan resultere i både gain-of-funktion og tab af funktion fænotyper, men kortlægning procedure er langsomt og dyrt.

Dobbelt-strenget RNA-interferens (dsRNAi) giver en alternativ måde at identificere gener involveret i vigtige biologiske processer. I denne fremgangsmåde dsRNA matcher den kodende sekvens af et endogent gen indført i ormen.DsRNA'et behandles in vivo til at generere små (21-22 nukleotider) RNA, der tjener som guider til at finde og binde de matchende endogene mRNA'eme, rettet dem til destruktion 1. Denne procedure er forholdsvis hurtig, men fordi dsRNA målrettet mRNA snarere end DNA, der kun reduktion-af-funktion fænotyper observeret ved anvendelse af denne fremgangsmåde.

Indførelse af dsRNAs i et dyr kan opnås ved direkte injektion af dsRNA 2 ved neddypning dyr i dsRNA 3 eller ved at fodre dyr bakterier, der udtrykker dsRNA 4. Hver af disse metoder til levering forårsage systemiske knockdown virkninger som de fleste celler af dyret udtrykker SID-1, et transmembrant kanal stand til at importere dsRNA 5. Oprindeligt brugt som en omvendt genetik tilgang til Knockdown udtryk for enkelte gener én ad gangen, udvikling af to fodring biblioteker tillader nu genetiske skærme store. De kommercielt tilgængelige dsRNA biblioteker indeholder bacterial kloner repræsenterer enten 55% eller 87% af al C. elegans gener 6, 7.

Desværre storstilede dsRNAi fodring skærme ofte resultere i variable knockdown effektivitetsgevinster 8-10. Mens det absolutte niveau af knockdown af RNAi ikke let måles, skal den reducerede knockdown effektivitet observeret i store skærme være forårsaget af tilbageværende gen-specifikke mRNA'er, der undslipper nedbrydning af RNAi. Dette, til gengæld kan være et direkte resultat af dsRNA plasmid tab fra bakterier fodret til dyrene i disse skærme. Støtte denne idé, fodres dyrene blandinger af bakterier, hvor kun 50% af bakterierne udtrykke dsRNAs mod en målrettet gen, udviser dramatisk reduceret (hvis nogen) knockdown virkninger sammenlignet med kontrolpatienter fodrede dyr 11. Omfanget af gen knockdown bliver en kritisk bekymring, når du udfører dsRNAi skærme som de fleste gener i C. elegans er haplosufficient og dermed genekspression skal reduceres med mindst 50% to forårsage tab af funktion Fænotypers 12.

Vi har brugt tidligere offentliggjorte fodring protokoller til at udføre store skærme og fandt den samme variabel knockdown effekter rapporteret af andre 8-10. I en søgning efter mulige årsager, fandt vi, at næsten 60% af de bakterier, der gives til dyrene i skærmen havde mistet dsRNA plasmid. Vi har udviklet et bibliotek dobbeltarbejde og screening protokol, der drastisk reducerer eller eliminerer plasmid tab og i høj grad forbedrer knockdown effektivitet. Denne protokol er egnet til at udføre store skærme i C. elegans og kan anvendes til at screene for en af de kommercielt tilgængelige dsRNA biblioteker. Ved hjælp af denne protokol, finder vi, at væsentlige 100% af de bakterier, der gives til dyr under skærmen bevarer dsRNA'et-kodning plasmid og forårsage robust og stærkt penetrant tab af funktion fænotyper i alle undersøgte væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Denne protokol kan anvendes til at identificere gener, der er nødvendige for en række biologiske processer i en række forskellige vævstyper. Som et nødvendigt kvalitetskontrol under skærmen, dyrene fodres både positiv og negativ kontrol dsRNA udtrykker bakterier at demonstrere RNAi effekter i målrettede væv.

Andre offentliggjorte fodring protokoller vokse dsRNA-udtrykkende bakterier i nærvær af enten 50 ug / ml ampicillin eller 25 pg / ml carbenicillin 8-10. Vi har fundet, at bakterier dyrket under en af ​​disse betingelser mister dsRNA plasmidet ved høj frekvens. Faktisk har vi fundet, at selv når bakterier dyrket natten over i meget høje koncentrationer (op til 2 mg / ml) ampicillin mere end 50% af de bakterier, der ikke længere indeholder plasmid. Mens væksten i carbenicillin generelt resulteret i en højere fastholdelse af plasmid, 25 mikrogram / ml ikke var tilstrækkeligt til at forhindre plasmid tab. I stedet fandt vi, at carbenicillin koncentrationtioner på 500 ug / ml var påkrævet til at blokere plasmid tab under vækst i flydende kulturer og 2 mg / ml carbenicillin blev kræves for at blokere plasmid tab, når bakterier blev dyrket på faste agar-substrater.

Fordi plasmid fastholdelse er afgørende for succes af knockdown, kun carbenicillin bruges, når dsRNA bakterier dyrkes i denne protokol. Vi har nøje optimeret koncentration af carbenicillin anvendes i bakterievæksten kulturer beskrevet i denne protokol for at sikre, at bakterier, som ikke indeholder plasmid ikke vokser i disse kulturer. Men som en kvalitetskontrol foranstaltning er plasmid tabet på flere trin i protokollen. For at sikre effektiv knockdown, må mere end 80% af bakterierne på hvert af disse trin indeholde dsRNA plasmid. Hvis mere end 20% af bakterierne på ethvert trin af protokollen har mistet dsRNA plasmid, kontrollere kvaliteten af ​​carbenicillin anvendes. Carbenicillin skal tilberedes frisk den dag, det bliver brugt. Forbered frisk carbenicillin og gentag kulturen.

1.. Sådan Bestem Plasmid Tab

  1. Fjern et lille udsnit af bakterier (som beskrevet ved hvert relevant trin) og føje den til 450 ul sterilt vand.
  2. Brug 100 pi af denne fortyndede prøve skabe yderligere 1:10, 1:100 og 1:1000 seriefortyndinger under anvendelse af sterilt vand, blanding af opløsningerne grundigt mellem fortynding.
  3. Fordel 100 pi af hver fortynding på LB og LB AMP-plader og inkuberes disse plader natten over ved 37 ° C.
  4. Den næste dag, identificere LB-plade, der indeholder mellem 100 og 500 bakteriekolonier. Tæl antallet af kolonier på denne plade og den tilsvarende LB AMP plade (indeholdende den samme fortynding af bakterier).
  5. Bestem plasmid tab fra disse Kolonitællingerne. Den procent af bakterier, som ikke indeholder plasmidet er beregnet ved hjælp af ligning 1, og skal være mindre end 15% for effektiv dsRNA vælte.

</ Html"Ligning 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Gør Duplicate Bibliotek Plates

Oversigt: dsRNA bibliotek vil ankomme fra producenten (OpenBiosystems) som 10.566 bakterielle kloner i 96-brønds plader. Opbevar pladerne straks i -80 ° C fryseren. Det oprindelige bibliotek plader vil blive kopieret, og alle fodring skærme vil bruge de dublerede bibliotekets plader som kilde til bakterier. Det er tilrådeligt at opbevare det originale og duplikere bibliotekets plader i separate frysere. For anbefales nem håndtering, duplikere kun 10 biblioteks-plader om dagen.

  1. Fjern bibliotek plade (r) fra -80 ° C fryser og fjerne folieforseglingen mens kulturer stadig er frosne. Udskift bibliotekets plade plastdæksel og sæt pladen på en plan overflade for at tø op ved stuetemperatur (ikke længere end 30 min.)

Bemærk: Vi har bemærket, at en betydelig percentage af bakterier, der findes i hver brønd i det oprindelige bibliotek pladerne ikke indeholder plasmid. Men fordi bibliotekets bakterier er en værdifuld ressource er det ikke anbefales at teste for plasmid tab i det oprindelige bibliotek kulturer.

  1. Hjælp af en multikanalpipette, tilsættes 150 pi bibliotek overlapning medier til hver brønd i en tom 96-brønds fladbundet eksemplarer plade.
  2. Bland de optøede Bibliotek bakteriekulturer ved pipettering op og ned fire til fem gange ved hjælp af en multikanalpipette sat til 100 pi. Derefter fjernes 10 ul af hver blandet kultur og overføre til de tilsvarende brønde eksemplarer plade. Fortsæt med at overføre kulturer fra biblioteket plade at duplikere plade gøre visse at skifte pipettespidser for hver overførsel.
  3. Efter at alle kulturer fra et bibliotek plade er blevet overført dække brøndene i det oprindelige bibliotek plade med nye selvklæbende folie ved hjælp af en brayer valse for at sikre en grundig tætning. Sæt plastlåg på pladen oganbring den i en -80 ° C fryser, indtil kulturerne genfryses (mindst 30 minutter). Derefter flytte det oprindelige bibliotek pladerne tilbage i et bibliotek opbevaringsboks.
  4. Ryst dublerede Bibliotek pladekulturer flade 8-10 timer ved 37 ° C (450 rpm på en microshaker, bane 3 mm).
  5. Bestem plasmid tab i hvert eksemplarer bibliotek plade. Vi fandt, at en høj andel af bakterierne i hver brønd i det oprindelige bibliotek pladen ikke indeholder dsRNA plasmid. Det er vigtigt, at disse bakterier ikke bidrage til vækst i to eksemplarer biblioteket. For at forhindre deres vækst, er en høj koncentration af carbenicillin anvendt i biblioteket dobbeltarbejde medier (3 mg / ml). Efter dyrkning af duplikeringen pladen ved hjælp af disse betingelser fandt vi, at mere end 90% af bakterierne indeholder dsRNA plasmid. Fjern 10 ul prøve fra en repræsentativ kultur brønd af hver eksemplarer plade og føje det til 450 ul sterilt vand. Ved hjælp af disse fortyndede prøver, fastlægge plasmid tab i hver eksemplarer bibliotekPlade ifølge trin 1,1-1,4. Hvis der observeres betydelige plasmid tab (> 20% af bakterier i to eksemplarer bibliotek ikke indeholder plasmid), omdannede kultur medier ved hjælp af frisk carbenicillin og gentag protokol fra trin 2.1.
  6. Efter inkubation placere en ny folieklæb ark direkte over dublerede brønde, og Pladen låg i denne folie. Placer de dublerede bibliotekets plader oprejst i en -80 ° C fryser (mindst 30 min) indtil frossen. Når frosne, flytte pladerne til to eksemplarer bibliotek opbevaringsboks til langtidsopbevaring.

3. Realiseringen af ​​midlertidige kopier af biblioteket på Omniplates

Oversigt: At begynde at forberede mad til en dsRNA skærm, er bakterier fra dublerede bibliotekets plader overføres til faste agar omniplates og dyrket natten over. For at forhindre plasmid tab på faste medier, indeholder omniplates carbenicillin ved 2 mg / ml. Bakterierne på disse plader kan bruges i en periodeen uge, og viser ingen plasmid tab. Vi har ikke testet for plasmid tab i bakterier dyrket på omniplates længere end en uge.

  1. Fjern eksemplarer bibliotek plade (r) fra -80 ° C fryser og tag folieforseglingen mens kulturerne stadig er frosne. Efter fjernelse af folie, udskifte pladen plastdæksel og sæt eksemplarer biblioteket plade på en plan overflade for at tø op ved stuetemperatur (ikke længere end 30 min.)
  2. Sterilisere Boekel 96 pin portreplikatoren. Stifterne i en ren replikator bør skylles med destilleret vand og derefter steriliseres før hver anvendelse. At sterilisere replikator, læg det i en ethanol bad (på 3/4 i dybt i en Pyrex fad), og derefter brænde ethanolen belægning benene ud ved hjælp af en bunsenbrænder. Lad flammen til at slukke og derefter gentage.
  3. Placer steriliseret replikator i brøndene i den optøede eksemplarer plade og bruge det til forsigtigt at røre kulturer. Små mængder af kulturen vil klæbe til stifter af portreplikatoren.
    4. <li> Fjern forsigtigt replikator fra brøndene i to eksemplarer pladen og placere den (ben ned) forsigtigt på overfladen af ​​omniplate, være omhyggelig med ikke at gennembore agaroverfladen. Lad replikator på overfladen af ​​omniplate i 3-4 sek, således at bakterier fra stifter af replikator overføres på agaroverfladen.
  4. Fjern replikator og tillade lille volumen (2-3 ul) bakteriekultur til at absorbere ind i agaren. Inkuber omniplates omvendte for 15-18 timer ved 37 ° C. Disse omniplates kan bruges næste morgen til at pode 96 godt flydende kulturer. Alternativt kan omniplates indeholdende overnight bakteriekolonier opbevares i op til syv dage ved 4 ° C.
  5. Til replika-transfer yderligere duplikatplader, skylles replikatoren tips med sterilt vand og gentag sterilisering proces ved at placere replikator i ethanol og flammende det to gange, som før. Når steriliseret kan replikator anvendes på næste eksemplarer plade.

4.. Udarbejdelse af Bakterier til fodring Worms

OOVERSIGT: Bakterier til fodring orme er udarbejdet som 1 ml flydende kulturer (i en 96 brønds format) ved hjælp af bakterier fra omniplates. Disse flydende kulturer dyrkes natten over for at frembringe mættede nonlogarithmic bakteriekulturer. Vækst natten sikrer, at alle kulturer indeholder lignende koncentrationer af bakterier, og derfor er alle orme vil blive fodret med den samme mængde af fødevarer. Skal observeres nogen plasmid tab under denne vækst.

  1. Doser 1 ml bakterievækst medier i hver brønd i 2 ml dybe brønd 96-brønds plade under anvendelse af en gentagelsespipetten og 50 ml Combitip.
  2. Placer steril replikator på overfladen af ​​omniplates indeholder bakteriekolonier genereret i trin 3,1-3,6 gøre sikkert, at ben er i kontakt med hver af de 96 kolonier.
  3. Flyt forsigtigt replikator fra overfladen af ​​omniplate i den dybe brønd plade gør sikker på, at benene ikke skrabe siderne af dybe brønde indtil nedsænket i vækstmedier. Flytreplikator langsomt i en firkant bevægelse efter den indvendige væg af den dybe brøndsplade at fjerne bakterier i vækstmedierne. Vær forsigtig med ikke at plaske og cross forurene brønde.
  4. Kontrol brønde: For hver 96 brønde dyb brønd kultur tallerken tilføje et dsRNA'et-udtrykkende bakterier til en brønd, der vil fungere som en positiv kontrol for den forventede knockdown fænotype og tilføje bakterier indeholdende tom dsRNA vektor (pL4440) som en negativ kontrol til en anden godt . Vi re-streak kontrol dsRNA-udtrykkende bakterier gang om ugen på LB-plader, der indeholder tetracyklin (15 ug / ml) og carbenicillin (2 mg / ml), således at bakterierne forbliver friske og fastholde plasmid.
  5. Ved hjælp af en steril pode loop fjerne en enkelt godt isoleret koloni fra kontrol plade (om den samme mængde bakterier overdrages af replikator) og vaccinere en tom godt i den dybe brønd kultur tallerken. Den position af brønden, der er blevet podet. Alternativt løkken med bakterier cen flyttes til et Eppendorf-rør indeholdende 250 pi vækstmedium, hvirvlet og derefter anvendt til at inokulere flere brønde.
  6. Ryst dybe brønde i en flad position ved 650 rpm på microshaker (omløb: 3 mm) ved 37 ° C natten over. Kulturerne bliver mættet ved næste morgen. Uanset hvad, bør koncentrationen af ​​carbenicillin anvendes i disse kulturer forhindre plasmid tab.
  7. Bestem plasmid tab i 1 ml overnatskulturer. Kulturerne vil blive anvendt direkte til at fodre orme til skærmen. Det er vigtigt, at mere end 80% af bakterierne i hver kultur indeholder dsRNA plasmid. Bestem plasmid tab for to repræsentative kulturer ifølge trin 1,1-1,4. Forventning: Mere end 90% af bakterier i hver kultur vil indeholde dsRNA plasmid. Vi har aldrig observeret betydelige plasmid tab i disse overnatskulturer selv når vokset til mætning. Men hvis der observeres betydelige plasmid tab (> 20%), genindspilning vækstmedierne med friske carbenicillin og repspise protokol fra trin 4.1. Kulturer kan genstartes fra de oprindelige omniplates så længe omniplates er mindre end 1-2 uger gamle.
  8. Når bruges til at starte 1 ml kulturer, er omniplates opbevares ved 4 ° C, indtil skærmen er fuldført og kan anvendes som en kilde af fødevarer at starte nogen retest kulturer.
  9. Efter inkubering natten over af kulturer, anvende en 12-kanals multikanalpipette at fjerne 150 pi bakteriekultur fra dyb brønd plade og skubbe på overfladen af ​​fodring plade. Det er vigtigt ikke at gennembore overfladen af ​​agar under overførslen, da orme vil grave sig ned og ikke foder på dsRNA'et-udtrykkende bakterier. Overførsel kan ske fire brønde på et tidspunkt (figur 1). For at gøre dette, skal du placere pipettespidser på hver tredje kanal i flerkanalspipette (som der er kun 4 brønde pr række i fodring plade). Efter hvert sæt af 4 brønde er overført, skifte til nye, sterile pipettespidser. Hver 96 dybe brønd kultur plade vil kræve 96 spidsertil overførsel til otte 12-brønds fodring plader.
  10. Store seedet plader opretstående i mørke natten over, så bakterier kan absorbere ind i agaren.

5.. Generering L1 Anholdt C. elegans Larver

Oversigt: L1-arresteret larver bruges til at starte synkroniserede orm kulturer på dsRNA'et fodring plader. Disse larver genereres ved blegning populationer af gravide voksne til at isolere sunde æg og derefter lade æggene at klække i S-komplet medier uden mad. I mangel af mad udklækkede L1 larver vil hæmme udviklingen, hvilket genererer en synkron population af L1 larver. During skærmen, lav en frisk L1 arresteret larver hver uge disse udsultede dyrene bliver syge med tiden, og skal kasseres. Valget af den genetiske baggrund for de dyr, der anvendes i en dsRNA'et fodring stamme kan variere afhængigt af anvendelse, for neuronale skærme ERI-1, lin-15B mutanter anbefales.

  1. Pick 10-20 L4 larvae til seks separate NGM plader, der indeholder en plæne af OP50 bakterier og vente 6-7 dage, indtil pladerne indeholder mange frisk lagt æg og gravide voksne.
  2. Fjern dyr og æg fra pladerne ved tilsætning af 3 ml vand til overfladen af ​​hver plade og bruge en behandsket finger at løsne æg, bakterier og dyr fra overfladen af ​​hver plade i vandet. Vær sikker på at dække alle områder af pladen, med særlig vægt på den bakterielle græsplæne. Fjern vand, bakterier, orme og æg fra hver plade under anvendelse af en glas pipette og overføres til et sterilt 50 ml konisk rør.
  3. Tilføje yderligere 3 ml vand til overfladen af ​​hver plade, at pipettere op og ned over overfladen for at fjerne alle resterende bakterier, orme og æg. Føj dette volumen til 50 ml konisk rør.
  4. Spin konisk rør ved 1500 rpm i 1 min i en bordcentrifuge. Orme og æg skal pelletere til bunden af ​​røret og bakterier bør forblive suspenderet. Aspirere omhyggeligt alt, men 4 mlaf væsken fra røret være sikker på at undgå de pelleterede orme og æg.
  5. Resuspender ormen pillen i det resterende vand og overføres til et sterilt 15 ml konisk rør ved hjælp af et glas pipette. Bring volumen til 10 ml med sterilt vand.
  6. Spin ved 1500 rpm i 1 minut som før. Aspirer supernatanten forlader 200 ul vand, så for ikke at forstyrre den orm / æg pellet.
  7. Der tilsættes 10 ml vand til den koniske at vaske orme og æg og spin som før for at fjerne yderligere bakterier.

Bemærk: I trin 5,8-5,11 orme og æg er udsat for en blegemiddel løsning. Bleach vil ødelægge orme og efterlade æg relativt uskadt. Men hvis æg efterlades i blegemiddelopløsning for længe, ​​vil de også blive ødelagt. Sæt en timer når blegemiddel tilsættes i trin 5.8 for at være sikker på, at æggene ikke forbliver udsat for blegemiddel i mere end 10 min.

  1. Tag alle 200 pi af supernatanten igen undgå pelleten, tilsæt derefter 10ml blegemiddel og starte en timer.
  2. Inkuber orme og æg i blegemiddel løsning for 3-4 min, lejlighedsvis blanding ved inversion. Derefter dreje ved 1500 rpm i 45 sekunder i en bordcentrifuge. Kigge efter en pellet i bunden af ​​røret, bør det være mindre og mere kompakt end den oprindelige pellet og kan tage på en gul udseende.
  3. Aspirer blegemiddelopløsningen efterlader 200 pi bag for ikke at forstyrre bundfaldet.
  4. Tilføj en anden 10 ml frisk blegemiddel og vend som før. Når timeren læser 10 min, spinde igen opsuges blegemiddelopløsningen, efterlader 200 pi bag sig og hurtigt at tilføje 10 ml sterilt vand. Undersøg opløsningen under et dissektionsmikroskop. Larverne og mange af de voksne bør have opløst i blegemiddelopløsning, efterlader det meste æg bagefter.
  5. Spin som før i 45 sekunder og igen aspireres supernatanten ikke at forstyrre bundfaldet. Denne pellet skal indeholde primært æg og vil være meget løs.
  6. Tilføj anothendes 10 ml vand, vendes til at blande, spin og aspirer efterlader lidt vand bagefter. Det er vigtigt at fjerne så meget blegemiddelopløsning som muligt.
  7. Tilsæt 4 ml S-komplette medier til den koniske rør, resuspender æggene og overføres til en steril 100 ml Erlenmeyerkolbe. Kolben anbringes i et 20 ° C inkubator på en shaker sæt bevæger sig lige hurtigt nok til at forårsage indholdet af kolben til at hvirvle. Dette vil give tilstrækkelig beluftning at understøtte L1 larverne, når de udklækkes. Inden for 15 timer alle æggene burde have udklækket producerer en synkron population af L1 anholdt larver.

Anholdt L1 larver bør gøres frisk hver uge i løbet af en skærm. Når det første parti er blevet lavet, kan de efterfølgende partier startes ved at tilsætte 500 anholdt L1 larver (fra den foregående uges batch) til hver af fire standard, seedet 6 cm plader (indeholdende 100 ul natten over kultur OP50), og inkuberes ved 20 ° C i 4 dage. På den fjerde dag pladerne bør indeholdemange æg og drægtige voksne og kan bleges for at forberede friske æg til mere synkroniseret L1 larver.

6.. Overførsel Anholdt L1 Larver på Fodring Plates

Oversigt: For at udføre en dsRNA skærm, er 20-30 L1 anholdt larver overført til dsRNA fodring plader. Tidlig knockdown effekter såsom larvernes anholdelse eller dødelighed vil blive observeret efter dyr har fodret med dsRNA-udtrykkende bakterier i 2-3 dage. Afhængigt af skærmen gennemført, kan de ønskede fænotyper observeres enten i de originale dyr placeret på fodring pladen (P0 dyr) eller i deres afkom (F1 dyr). Præsentationen af ​​fænotype, vil afhænge af en række variabler, herunder perdurance af proteinet kodet af genet, hvis ekspression er slået ned og tid under udvikling, hvor genet af interesse er påkrævet. Start dsRNA fodring kulturer med kun 20-30 dyr, bør tillade observation af både P0 og F1 fænotyper før endyr, udstødning fødekilde.

Nemt overføre 20-30 dyr til fodring plader, først bestemme koncentrationen af ​​L1 anholdt dyr i arresteret L1 kultur.

  1. Bland Erlenmeyerkolbe indeholdende den anholdte L1 larver til at distribuere dyrene.
  2. Fjern en 10 ul portion og sted dråbevis på en unseeded 6 cm NGM plade i 4-5 dråber ned i midten af ​​pladen at sikre, at alle medier er bortvist fra pipette.
  3. Brug enden af ​​pipettespidsen sprede prikker af orm suspensionen til dannelse af en enkelt kontinuerlig linie af væske, der spænder over diameteren af ​​pladen.
  4. Ved hjælp af et dissektionsmikroskop, tælle alle dyr begyndende ved den ene ende af linjen af ​​væske og fortsætter til den anden ende, før væsken er absorberet i pladen og dyrene dispergere. Dette kan kræve konstant omlægning af dissekere omfang at være sikker på, at ingen dyr er savnet.
  5. Gentag dette for tre separate 10 ulportioner og gennemsnittet i tre numre til at bestemme det gennemsnitlige antal orme pr pi orm suspension og registrere dette nummer direkte på Erlenmeyerkolben.

7.. Begynd Fodring Screen

Oversigt: Til at begynde skærmen dsRNA er 20-30 standset L1 larver tilsat til hver brønd i 12-brønds fodring plader indeholdende en tynd plæne af dsRNA-udtrykkende bakterier. Fodring plader indeholder standard nematode vækstmedier (NGM) og er suppleret med 500 ug / ml carbenicillin (for at forhindre tab af plasmid) og 1 mM IPTG (for at inducere dsRNA udtryk). Dyr får lov til foder og udvikle sig i flere dage ved 20 ° C. To typiske fodring regimer til dyr er 3 dage, hvor du udfører en P0 skærm og 6-7 dage, når du udfører en F1-skærm. Varigheden af ​​fodring, men kan varieres afhængigt af de specifikke fænotyper søgt på skærmen.

  1. Brug suspensionen af ​​L1 anholdt larver og sterilt vand til at udarbejde en sålution indeholdende 2.000 orme / ml. Hver 12-brønds fodring plade vil kræve 120 pi denne orm suspension af. Bland grundigt for at sikre en jævn fordeling af dyr og overføres dyrene til et sterilt reservoir for pipettering.
  2. Ved hjælp af multikanalpipette oprettet med tips i hver tredje position (se figur 1) overførsel 10 ul af ormen løsning direkte på den bakterielle plæne af fodring plader. Pas på ikke at gennembore overfladen af ​​agar, som orme vil grave sig ind i agar og ikke foder på dsRNA'et-udtrykkende bakterier.
  3. Remix ormen løsning i beholderen (ved forsigtigt skvulpende det om) efter hver to rækker af fodring plader, som orme bosætte hurtigt. Fortsæt dispensering ormen suspensionen, indtil alle fodring plader har orm. Undersøge et par brønde tidligt på under dissekere omfang at sikre, at hver brønd er at få 20-30 orme.
  4. Store plader opretstående i en befugtet kasse i en 20 ° C inkubator. Den næste dag, efter worm suspension har absorberet i pladen, vendes pladerne og vende tilbage til humidor ved 20 ° C. Dyr på disse plader kan observeres efter 3 dage (for P0 fænotyper) og igen efter 6 dage (til F1 fænotyper).

Bemærk: De bakterier, der forbliver på fodring plade efter 7 dages orm vækst er blevet testet for plasmid tab og næsten 100% bibeholdt dsRNA'et plasmid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P0 knockdown fænotyper vil begynde at dukke op efter 2-3 dage med at fodre dyr dsRNA udtrykke bakterier. Nogle tidlige fænotyper omfatter larvernes anholdelse og dødelighed og bør overholdes i 2-3% af alle fodringsforsøg brønde. Disse samme fænotyper vil også blive observeret i F1-generationen dyr. Tilstedeværelsen af ​​F1 æg, der undlader at klække er en anden almindelig F1 fænotype, og sammen vil disse tre fænotyper observeres i næsten 10% af alle brønde i F1 skærme.

Vi anvendte protokol er beskrevet her til at undersøge knockdown virkninger for flere gener er udtrykt i en række forskellige typer væv for både P0 og F1 fænotyper. Fordi vi ønskede også at teste for knockdown effekter i neuronal væv, vi brugte ERI-1, lin-15B mutanter i vores skærme. Mutationer i ERI-1 og lin-15B, sammen med mutationer i rrf-3, blev identificeret i skærme til mutationer, der er forårsaget øget følsomhed over for RNAi 8,13,14.

EGL-30, DPY-17, pat-10, og UNC-4. To af disse gener, EGL-30 og UNC-4 udtrykkes i nervesystemet 15-17, et gen, pat-10 udtrykkes i kroppens væg muskler 18 og den fjerde genet DPY-17 udtrykkes i hypodermal celler 19. Når vi fodres ERI-1, lin-15B dyr bakterier, der indeholdt den tomme pL4440 plasmid men ikke udtrykker en dsRNA, vi ikke observere nogen morfologiske eller adfærdsmæssige defekter (figur 2A, tabel 1).

EGL-30, koder for C. elegans ortholog af G proteinunderenheden Gaq. EGL-30 nulmutanter anholdelse under tidlig larveudvikling, men nogle nul escapers og hypomorphic tab af funktion EGL-30 mutanter vokse til at blive voksen stadie og er defekte i bevægelse og æglæggende adfærd 20.. Hvornårvi fodres L1 etape ERI-1; lin15B larver bakterier udtrykker EGL-30 dsRNA, fandt vi, at larverne voksede til at blive voksne, der viste tydelige defekter i bevægelse og æglægning adfærd. Efter tre dage, 100% af dyrene fodres dsRNA mod EGL-30 blev lammet og ude af stand til at lægge æg (figur 2B, tabel 1). Vi har ikke observere larve anholdelse fænotype i vores dsRNA Knockdown eksperimenter, der er observeret i EGL-30 (ad810) null dyr. Det er formentlig fordi L1 dyr, vi forgyldt på EGL-30 dsRNA bakterier allerede havde passeret den tidlige udviklingsmæssige krav til EGL-30. Det fremhæver en fordel for fodring skærme: sene fænotyper kan observeres for gener, der også spiller afgørende roller under udviklingen.

DPY-17 koder for et kollagen kræves for kutikula dannelse i C. elegans 19.. DPY-17 nulmutanter er kortere og federe end vildtype animals. Vi har ikke observere nogen morfologiske defekter i P0 dyr fodret DPY-17 dsRNA. Men 98% af F1-dyrene viste Dpy fænotype (figur 2C, tabel 1). Manglen på korte og fede P0 dyr indikerer, at DPY-17 gen-funktion er nødvendig på tidlige larvestadier for korrekt krop morfologi. Mens DPY-17 ikke er blevet rettet i andre fodring skærme, blev det slået ned af dsRNA injektion 21. Interessant, kun 30% af afkommet af dsRNA injicerede dyr viste Dpy fænotype, hvilket tyder på, at fodring protokollen beskrevet her er mere effektiv end den mere arbejdskrævende injektion tilgang, i det mindste for nogle gener.

pat-10 koder kropsvæggen muskel troponin C, et protein, som indeholder fire EF Hand motiver, der binder calcium 18. Vi fandt, at 100% af eri-1, lin-15B dyr fodret pat-10 dsRNA blev lammet inden for 3 dage, og der er ingen æg førende toa letal fænotype (figur 2D, tabel 1).

unc-4 koder for et homeodomain protein udtrykkes i ventrale ledning motoriske neuroner og er nødvendig for korrekt synaptiske input valg 22,23. Vi valgte unc-4 som en test-gen, fordi det har vist sig at være resistente over for tidligere dsRNA fodringsstrategier 8,24. Unc-4-mutanter viser en defekt i bevægelse adfærd. Som et resultat af fejl i synaptisk forbindelse, unc-4 mutanter er i stand til at bakke 22,23. Sammenlignet med vildtype-dyr, back frit i en sinusformet bevægelse, når prikket på hovedet, behøver unc-4 nulmutanter ikke tilbage og i stedet optage deres midterstykke stramt, forårsager en dorsal flexure som ofte bliver så ekstrem, at hoved og hale dyr touch, placerer kroppen i en sammenrullet position. Vi fandt, at 68% af dyrene fodres UNC-4 dsRNA-udtrykkende bakterier fra vores bibliotek forberedelse viste fejl i backing. Dette er en dramatisk forbedring i knockdown effektivitet sammenlignet med 0% opbakning defekt observeret, når rrf-3 dyr fodres UNC-4 dsRNA anvendelse af tidligere publicerede protokoller 8 (tabel 1).

Figur 1
Figur 1. Flowdiagram for biblioteket dobbeltarbejde og store skærm. Hver 96 eller 12 brønds plade genereres under screeningen protokollen er angivet, sammen med den metode, der bruges til at overføre bakterier mellem plader. Stjerner angiver de skridt, hvor bakterier bør testes for plasmid tab. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. dsRNA knockdown fænotyper af C. elegans gener udtrykt i forskellige vævstyper. A) Kontrol dyr fodret bakterier indeholdende pL4440 tom vektor. Sort pil angiver placeringen af ​​en ung voksen dyr. Hvide pil angiver placeringen af ​​en gruppe af lagte æg. Billedet viser frit bevægelige dyr som det fremgår af deres normale kropsholdning. B) Dyr fodret dsRNA mod EGL-30. Bemærk, at alle dyr har vedtaget en stiv udseende typisk af lammede dyr. Bemærk også den fuldstændige mangel på lagde æg på pladen. C) Dyr fodret dsRNA mod DPY-17. Bemærk, at voksne dyr i marken (én markeret med pil) er kortere og federe end det voksne dyr vist i panel A. D) Dyr fodret dsRNA mod pat-10. Bemærk, at alle dyr er lammet, men kan stadig flytte deres hoved muskler til foder som angivet af rydningen af ​​bakterier i nærheden af ​​hovedet, præget af pilen. Målestok 1 mm.

dsRNA plasmid eller gen målrettet efter feRedigering Tissue ekspression af målgenet Procent dyr med terminal fænotype
pL4440 (negativ kontrol) vildtype for alle adfærd
EGL-30 nervesystem 100% Egl og handlingslammet
DPY-17 hypodermis 98% Dpy
pat-10 kropsvæggen muskel 100% lammet
unc-4 nervesystem 68% Backing Defekt

Tabel 1. Terminal fænotype af dyr fodret dsRNA mod gener udtrykt i forskellige C. elegans væv. n = 100 for alle gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en protokol, der anvender en kommercielt tilgængelig dsRNA fodring bibliotek til at udføre store skærme i C. elegans. Vi leverer alle instruktioner til at duplikere biblioteket og at bruge det effektivt. Vi viser, at denne fremgangsmåde er i stand til at identificere gener, der er involveret i forskellige biologiske processer i forskellige væv i dyret. Mens fænotyper vi beskriver her, er let observerbare (Unc EGL, og Dpy), kan denne protokol tilpasses for at søge efter gener, der er nødvendige for næsten enhver biologisk proces. For eksempel har vi brugt denne protokol til at identificere gener, der kræves for neurotransmission i ormen 25. Når dyr er fodret med bakterier, der udtrykker dsRNA (typisk 3 dage P0 skærme, 6-7 dage for F1 skærme), kan de fjernes fra fodring plade og testet for enhver adfærdsmæssig fænotype.

Plasmid tab:

Vi fandt, at de reducerede knockdown effektivitetsgevinster observeret understorstilede dsRNA skærme kan direkte tilskrives tabet af dsRNA plasmid fra bakterier fodret til ormene. Plasmid tab forekommer i bakteriekulturer vækst, fordi β-lactamase, kodet på dsRNA bibliotek plasmid, virker til at nedbryde både ampicillin og carbenicillin at reducere koncentrationen af ​​disse antibiotika over tid. Når koncentrationen af ​​antibiotikum bliver tilstrækkelig lav, kan bakterier, som ikke indeholder plasmidet overleve og befolke kulturen. Anvendelsen af sådanne blandede bakteriekulturer i dsRNA skærme skal undgås, da de viser reduceret knockdown aktivitet og ofte ikke forårsage tab af funktion Fænotypers 11. Overraskende fandt vi, at høje niveauer af plasmid tab forekomme selv i bakterielle kulturer dyrket i meget høje koncentrationer af ampicillin (op til 2 mg / ml). Mens carbenicillin er mere modstandsdygtige over for nedbrydning af β-lactamase, vi fandt det stadig nødvendigt at anvende koncentrationer af carbenicillin, der var 10-40 gange højere end dem,anvendt i tidligere offentliggjorte dsRNA fodring skærme 8-10,26 at sikre, at alle bakterier i kulturen bevares dsRNA'et plasmid.

Fordi de fleste gener i C. elegans er haplosufficient, er det afgørende vigtigt, at alle bakterier fodret til dyrene udtrykke dsRNA. Dette sikrer meget effektiv gen knockdown og øger sandsynligheden for at observere tab af funktion fænotyper i store skærme.

Positive og negative kontroller:

Det er vigtigt at medtage både positive og negative kontrolprøver bakterier i hver fodring plade, når du udfører skærme. Den negative kontrol er især vigtigt, hvis adfærdsmæssige tests vil blive anvendt til at identificere gener af interesse. For en negativ kontrol vi bruger bakterier indeholdende tom vektor pL4440. For en positiv kontrol, er det bedst at anvende bakterier, der udtrykker dsRNA mod et gen, der forårsager den ønskede knockdown fænotype. Men hvis sådanne gener er kenden bør en positiv kontrol for knockdown anvendes der forårsager en let observerbar fænotype. Når du vælger et sådant gen, bør der gives præference til gener, der er udtrykt i vævstypen målrettet på skærmen. For eksempel i dsRNA fodring skærme for neuronale fænotyper, en neuronal gen bør vælges som en positiv kontrol. En observerbar knockdown effekt i dyr, der fodres på de positive kontrol bakterier vil indikere, at dsRNA'et indblanding arbejder i den ønskede vævstype.

Det er bedst, hvis den person udføre fodring plader til fænotyper er blind for placeringen af ​​de positive kontrolbrønde. Screener bør være i stand til nemt at identificere de positive brønd i hver 96-brønds plade. For adfærdsmæssige analyser er det nyttigt at score den negative godt først, før du scanner de resterende brønde.

Throughput:

Ved hjælp af denne protokol, skal én person være i stand til at oprette og skærm 16, 12 brøndeper dag. For at flytte effektivt gennem biblioteket, vi generelt tester hver brønd på hvert bibliotek plade kun én gang i løbet af en skærm. Eventuelle brønde, scoret som positiv registreres og gentestes i tre eksemplarer. Vi kræver, at de positive brønde genteste i alle tre retests. Plasmidet derefter oprenses fra bakterierne og insertet sekventeres til positivt at identificere genet. Hvis nulmutanter er tilgængelige for genet, vil vi bestille dem og teste nul-dyr med adfærdsmæssige konstaterede fejl på skærmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health MH097163. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40-OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).

Tags

Developmental Biology Caenorhabditis elegans (C. elegans) Gene Knockdown Techniques, gen knockdown stor målestok fodring skærm
Storstilet Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Brug dsRNA Fodring Biblioteker at skabe en robust tab af funktion fænotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maher, K. N., Catanese, M., Chase,… More

Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes. J. Vis. Exp. (79), e50693, doi:10.3791/50693 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter