Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Storskala Gene Knockdown i Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50693
Automatic Translation
1, 2, 3
1Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts, Amherst, 2Neuroscience and Behavior Program, University of Massachusetts, Amherst, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Massachusetts, Amherst

Summary

Mens dsrna fôring i C. elegans er et kraftig verktøy for å vurdere gen-funksjon, gjeldende protokoller for storskala fôrings skjermene resultere i variable knockdown effektivitet. Vi beskriver en forbedret protokoll for å utføre storskala RNAi fôring skjermer som resulterer i svært effektiv og reproduserbar knockdown av genuttrykk.

Abstract

RNA interferens ved fôring ormer bakterier uttrykker dsRNAs har vært et nyttig verktøy for å vurdere gen-funksjon i C. elegans. Selv om denne strategien fungerer godt når et lite antall gener er målrettet for knockdown, storskala fôrings skjermene viser variable knockdown effektivitet, noe som begrenser deres nytte. Vi har motbevist tidligere publiserte RNAi knockdown protokoller og fant at den primære kilden til redusert knockdown kan tilskrives tap av dsrna-koder plasmider fra bakterier matet dyrene. Basert på disse observasjonene, har vi utviklet en dsrna fôring protokoll som reduserer eller eliminerer plasmid tap for å oppnå effektiv, høy gjennomstrømming knockdown. Vi viser at denne protokollen vil produsere robust, reproduserbar knock down av C. elegans gener i flere typer vev, inkludert nerveceller, og vil tillate effektiv knockdown i store skjermer. Denne protokollen bruker en kommersielt tilgjengelig dsrna fôringbibliotek og beskriver alle trinnene som trengs for å kopiere biblioteket og utføre dsrna skjermer. Denne protokoll krever ikke bruk av noen avansert utstyr, og kan derfor utføres av en hvilken som helst C. elegans lab.

Introduction

Historisk genetiske skjermer i C. elegans har vært utført ved å behandle dyr med et kjemisk mutagen slik som etyl-metansulfonat for å skape tilfeldige mutasjoner i DNA. Avkom eller grandprogeny av mutageniserte dyrene blir deretter isolert som utviser en ønsket unormal fenotype. Mutasjonen ansvarlig for forårsaker fenotype er da identifisert gjennom en arbeidskrevende kartlegging prosedyre eller ved sekvensering av mutant orm hele genomet. Det er mange fordeler med å utføre slike kjemisk mutagenese skjermer som de skaper permanent lesjoner innenfor snekke genomet som kan føre til både forsterkningen-av-funksjon og tap-av-funksjon fenotyper, men kartleggingsprosedyren er langsom og kostbar.

Dobbel-strandet RNA interferens (dsRNAi) gir en alternativ måte å identifisere gener som er involvert i viktige biologiske prosesser. I denne fremgangsmåten, er dsRNA samsvar den kodende sekvens av et endogent gen som innføres i ormen.Den dsrna er behandlet in vivo for å generere små (21-22 nucleotide) RNA som fungerer som guider for å finne og binde de matchende endogene mRNA, rettet dem til destruksjon en. Denne fremgangsmåten er relativt rask, men fordi dsRNA rettet mRNA i stedet for DNA, blir bare reduksjon-av-funksjon fenotyper observert ved anvendelse av denne tilnærming.

Innføring av dsRNAs til et dyr kan oppnås ved direkte injeksjon av dsRNA 2, ved å dyppe dyr i dsRNA 3, eller ved å fore dyr bakterier som uttrykker dsRNA 4.. Hver av disse leveringsmåter gi systemiske knockdown effekter som de fleste cellene i dyret uttrykke SID-en, en transmembrane kanal stand til å importere dsrna fem. Opprinnelig benyttet som en revers genetikk tilnærming til knockdown ekspresjonen av individuelle gener, ett om gangen, utvikling av to mate biblioteker tillater nå store genetiske skjermer. De kommersielt tilgjengelige dsrna biblioteker inneholder bacterial kloner som representerer enten 55% eller 87% av alle C. elegans gener 6, 7.

Dessverre, storskala dsRNAi fôring skjermer ofte resultere i variable knockdown effektivitet 8-10. Mens det absolutte nivå av knockdown etter RNAi ikke lett måles, må den reduserte knockdown effektivitet observert i store skjermer være forårsaket av rest gen-spesifikk mRNA som rømmer nedbrytning av RNAi. Dette, i sin tur, kunne være et direkte resultat av dsrna plasmid tap fra bakterier fôret til dyrene i disse skjermene. Støtter denne ideen, dyr matet blandinger av bakterier, hvor bare 50% av bakteriene uttrykke dsRNAs mot en målrettet genet, viser dramatisk redusert (hvis noen) knockdown effekter i forhold til å kontrollere matet dyrene 11. Omfanget av genet knockdown blir en kritisk bekymring når du utfører dsRNAi skjermene som de fleste gener i C. elegans er haplosufficient og dermed genekspresjon må reduseres med minst 50% to føre til tap-av-funksjon fenotyper 12.

Vi har brukt tidligere publiserte fôrings protokoller for å utføre store skjermer og fant de samme variable knockdown effekter rapportert av andre 8-10. I et søk etter mulige årsaker, fant vi at nesten 60% av bakteriene matet dyrene i skjermen hadde mistet dsrna plasmid. Vi har utviklet et bibliotek duplisering og screening protokoll som dramatisk reduserer eller eliminerer plasmid tap og forbedrer knockdown effektivitet. Denne protokollen er egnet til å utføre store skjermer i C. elegans, og kan brukes til å screene enten en av de kommersielt tilgjengelige dsRNA-biblioteker. Ved hjelp av denne protokollen, finner vi som i hovedsak 100% av bakteriene matet til dyr under skjermen beholde dsrna-koding plasmid og forårsake robust og svært penetrant tap av funksjon fenotyper i alle vev undersøkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Denne protokollen kan brukes for å identifisere gener som kreves for en rekke biologiske prosesser i forskjellige vevstyper. Som et nødvendig kvalitetskontroll under skjermen, dyr blir matet både positive og negative kontroll dsRNA-uttrykkende bakterier for å demonstrere RNAi effekter i den målrettede vev.

Andre publiserte protokoller forings vokse uttrykker dsRNA-bakterier i nærvær av enten 50 ug / ml ampicillin og 25 pg / ml Carbenicillin 8-10. Vi har funnet at bakterier dyrket under begge disse betingelsene mister dsRNA plasmid ved høy frekvens. Faktisk er det funnet at selv når bakterier er dyrket over natten i meget høye konsentrasjoner (opptil 2 mg / ml) ampicillin mer enn 50% av bakteriene ikke lenger inneholder plasmid. Mens vekst Carbenicillin generelt gitt høyere retensjon av plasmid, 25 pg / ml var ikke tilstrekkelig til å forhindre tap av plasmidet. I stedet fant vi at Carbenicillin konsensjoner av 500 mikrogram / ml var nødvendig for å blokkere plasmid tap under vekst i flytende kultur og 2 mg / ml Carbenicillin var nødvendig for å blokkere plasmid tap når bakteriene ble dyrket på fast agar-substrater.

Fordi plasmid kapasiteten er kritisk for å lykkes med knockdown, er bare Carbenicillin brukes når dsrna bakterier dyrkes i denne protokollen. Vi har nøye optimalisert konsentrasjon av Carbenicillin anvendes i bakterienes vekstkulturer som er beskrevet i denne protokollen slik at bakteriene som ikke inneholder plasmid ikke vokser i disse kulturer. Men som en kvalitetskontroll måle, blir plasmid tapet bestemmes ved flere trinn i protokollen. For å sikre effektiv knockdown, må mer enn 80% av bakteriene ved hver av disse fremgangsmåtene inneholder dsRNA plasmid. Hvis mer enn 20% av bakteriene ved hvilket som helst trinn av protokollen har mistet dsRNA plasmid kontrollere kvaliteten på Carbenicillin anvendes. Carbenicillin bør være forberedt frisk den dagen det blir brukt. Forbered frisk Carbenicillin og gjenta kulturen.

En. Slik finner du ut Plasmid tap

  1. Ta en liten prøve av bakterier (som beskrevet på hver relevant trinn) og legge den til 450 mL sterilt vann.
  2. Bruk 100 ul av dette fortynnede prøven til å skape ytterligere 1:10, 1:100 og 1:1.000 serielle fortynninger ved bruk av sterilt vann, blande oppløsningene grundig mellom fortynning.
  3. Spre 100 ul av hver fortynning på LB-og LB AMP plater og inkuberes i disse plater over natten ved 37 ° C.
  4. Den neste dagen, identifisere LB plate som inneholder mellom 100 og 500 bakteriekolonier. Tell antall kolonier på denne plate, og på det tilsvarende LB AMP plate (inneholdende den samme fortynning av bakterier).
  5. Bestem plasmid tap fra disse kimtall. Den prosent av bakterier som ikke inneholder plasmidet blir beregnet ved å bruke ligning 1, og bør være mindre enn 15% for effektiv dsRNA slå ned.

</ Html"Equation en" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Making Duplicate Bibliotek Plates

Oversikt: dsrna bibliotek kommer fra produsenten (OpenBiosystems) som 10566 bakteriekloner i 96 brønners plater. Oppbevar platene umiddelbart i -80 ° C-fryseren. De opprinnelige bibliotek platene vil bli duplisert, og alle mater skjermer vil bruke den dupliserte bibliotek platene som kilde for bakterier. Det er lurt å lagre den opprinnelige og duplisere bibliotek plater i separate frysere. For enkel håndtering, duplisere bare 10 bibliotek plater per dag er anbefalt.

  1. Fjern bibliotek platen (e) fra -80 ° C fryser og fjerne folien tetning mens kulturer fremdeles frosne. Bytt biblioteket plate plastdekselet og sett platen på et jevnt underlag for å tine i romtemperatur (ikke lenger enn 30 min).

Merk: Vi har lagt merke til at en betydelig percentage av bakterier som finnes i hver brønn av det opprinnelige bibliotek platene ikke inneholder plasmid. Men fordi biblioteket bakterier er en dyrebar ressurs det ikke er anbefalt å teste for plasmid tap i det opprinnelige biblioteket kulturer.

  1. Ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 150 pl av biblioteket duplisering materiale til hver brønn av en tom 96-brønners flatbunnplate duplikat.
  2. Bland de tinte bibliotek bakteriekulturer ved pipettering opp og ned fire til fem ganger ved hjelp av en flerkanalspipette satt til 100 mL. Deretter fjernes 10 ul av hver kultur blandet og overføring til de tilsvarende brønner i duplikat plate. Fortsett å overføre kulturer fra biblioteket plate å duplisere plate gjør sikkert til å endre pipetter for hver overføring.
  3. Etter at alle kulturer fra et bibliotek plate er blitt overført, dekker brønnene av det opprinnelige biblioteket plate med nye limet folie ved hjelp av en brayer roller for å sikre en grundig forsegling. Sett på plastlokk på plate, ogplasser den stående i en -80 ° C fryser inntil kulturer har refrozen (minst 30 min). Deretter flytter de opprinnelige bibliotek platene tilbake i et bibliotek oppbevaringsboks.
  4. Rist dupliserte bibliotek plate kulturer flate for 8-10 timer ved 37 ° C (450 rpm på en microshaker, bane 3 mm).
  5. Bestem plasmid tap i hvert duplikat bibliotek plate. Vi har funnet at en høy andel av bakterier i hver brønn av det opprinnelige biblioteket platen ikke inneholder dsRNA plasmid. Det er viktig at disse bakteriene ikke bidrar til vekst i duplikat biblioteket. For å hindre deres vekst, er en høy konsentrasjon av Carbenicillin anvendes i biblioteket duplisering mediet (3 mg / ml). Etter kultur av duplisering platen ved hjelp av disse betingelsene har vi funnet at mer enn 90% av bakteriene inneholder dsRNA plasmid. Fjern 10 ul prøve fra et representativt kultur brønn av hver duplikat plate og tilsett det til 450 pl sterilt vann. Ved hjelp av disse fortynnede prøver, bestemme plasmid tap i hvert duplikat bibliotekplate i henhold til trinn 1.1 til 1.4. Hvis betydelig plasmid tap er observert (> 20% av bakterier i duplikat biblioteket ikke inneholder plasmid), remake kultur media med ferske Carbenicillin og gjenta protokoll fra trinn 2.1.
  6. Etter inkubasjon, plassere en ny folie limet ark direkte over de dupliserte platebrønnene, og plasser platen lokkene enn dette folie. Plasser de dupliserte bibliotek platene oppreist i en -80 ° C fryser (minst 30 minutter) inntil frosset. Når frosset, flytte platene til duplikat biblioteket oppbevaringsboks for langtidslagring.

Tre. Å gjøre midlertidige kopier av biblioteket på Omniplates

Oversikt: For å begynne å lage mat for en dsrna skjerm, er bakterier fra dupliserte bibliotek plater overført til fast agar omniplates og vokst over natten. For å hindre tap av plasmid på faste medier, inneholder omniplates Carbenicillin ved 2 mg / ml. Bakteriene på disse plater kan anvendes i en periodeen uke, og viser ingen plasmid tap. Vi har ikke testet for plasmid tap i bakterier dyrket på omniplates lenger enn en uke.

  1. Fjern duplikat bibliotek platen (e) fra -80 ° C fryser og ta av foliepakningen mens kulturer er fremdeles låst. Etter å ha fjernet folien, erstatte plate plastdekselet og sett den duplikat bibliotek plate på et jevnt underlag for å tine i romtemperatur (ikke lenger enn 30 min).
  2. Sterilisere Boekel 96 pin portreplikator. Pinnene på en ren replikator skylles med destillert vann og deretter sterilisert før hver bruk. Å sterilisere portreplikator, plassere den i en etanol bad (3/4 i dypt i en Pyrex parabol) og deretter brenne etanol belegg pinnene av ved hjelp av en Bunsen-brenner. La flammen å slukke og deretter gjenta.
  3. Plasser sterilisert portreplikator i brønnene i tint duplikat plate og bruke den til å forsiktig røre kulturer. Små volumer av kulturen vil følge pluggene til portreplikator.
    4. <li> Fjern forsiktig portreplikator fra brønnene i duplikat plate og legg den (pins ned) forsiktig på overflaten av omniplate, være forsiktig med å pierce agar overflaten. La replikator på overflaten av omniplate i 3-4 sekunder, slik at bakterier fra stiftene på replikator blir overført på agaroverflaten.
  4. Fjern replikator og tillater den lille volum (2-3 ul) av bakteriekultur å absorbere inn i agar. Inkuber omniplates inverterte for 15-18 timer ved 37 ° C. Disse omniplates kan brukes neste morgen for å vaksinere 96 godt flytende kulturer. Alternativt kan omniplates inneholder overnattingsbakteriekolonier lagres inntil sju dager ved 4 ° C.
  5. Å replika-overføring flere dupliserte plater, skyll replikeringssiden tips med sterilt vann og gjenta steriliseringsprosessen ved å plassere portreplikator i etanol og flammende det to ganger, som før. Når sterilisert, kan replikator brukes på den neste kopi plate.

4. Utarbeidelse av bakterier for Fôring Worms

Overview: Bakterier for fôring ormer er utarbeidet som en ml flytende kulturer (i en 96 godt format) ved hjelp av bakterier fra omniplates. Disse flytende kulturer er vokst over natten for å generere mettede nonlogarithmic bakteriekulturer. Night vekst sikrer at alle kulturer skal inneholde tilsvarende konsentrasjoner av bakterier og dermed alle ormer vil bli matet den samme mengde mat. Ingen plasmid tap i løpet av denne veksten bør følges.

  1. Tilsett 1 ml av bakterievekstmedier i hver brønn av 2 ml dyp brønn 96-brønners plate ved bruk av en gjentakelse pipette og 50 ml Combitip.
  2. Plasser sterile replikator på overflaten av omniplates inneholdende bakteriekolonier som genereres i trinn 3.1 til 3.6 å være sikker på at pinnene er i kontakt med hver av de 96 bakteriekolonier.
  3. Bevege forsiktig replikator fra overflaten av omniplate inn i dyp brønn plate og pass på at pinnene ikke kan skrape sidene av dype brønner inntil nedsenket i vekstmediet. Flyttreplikator langsomt i en firkantet bevegelse etter den innvendige veggen av dyp brønn plate for å fjerne bakteriene inn i vekstmediet. Vær forsiktig så du ikke å sprute og kryss forurense brønner.
  4. I kontroll-brønner: For hver 96-brønn dyp brønn kulturplate tilsett dsRNA-uttrykkende bakterier til en brønn som vil fungere som en positiv kontroll for den forventede fenotype knockdown og legge til bakterier som inneholder dsRNA tom vektor (pL4440) som en negativ kontroll i en annen brønn . Vi gjen strek styre dsRNA-uttrykkende bakterier gang per uke på LB-plater inneholdende tetracyklin (15 pg / ml) og Carbenicillin (2 mg / ml) slik at bakteriene forblir friskt og beholde plasmid.
  5. Ved hjelp av en steril sløyfe inokulere fjerne en enkel, godt isolert koloni fra styreplaten (omtrent den samme mengde bakterier overført replikator) og inokulere en tom brønn i en dyp brønn kulturplate. Lagre posisjonen til brønnen som har blitt vaksinert. Alternativt sløyfen med bakterier cen flyttes til et Eppendorf-rør inneholdende 250 pl vekstmedier, vortex-blandet og deretter brukt til å inokulere en rekke brønner.
  6. Rist dyp-brønners plater i en flat posisjon ved 650 rpm på microshaker (omløp: 3 mm) ved 37 ° C over natten. Kulturene blir mettet av den neste morgen. Uansett bør konsentrasjonen av Carbenicillin brukes i disse kulturene hindre plasmid tap.
  7. Bestem plasmid tap i 1 ml over natten kultur. Kulturene skal benyttes direkte til å mate ormer for skjermen. Det er viktig at mer enn 80% av bakteriene i hver kultur inneholder dsRNA plasmid. Bestem plasmid tap for to representative kulturer i henhold til trinn 01.01 til 01.04. Forventning: Mer enn 90% av bakteriene i hver kultur vil inneholde dsrna plasmid. Vi har aldri observert betydelig plasmid tap i disse overnattings kulturer selv når vokst til metning. Imidlertid, hvis større plasmid tap er observert (> 20%), gjenskape vekstmedier ved hjelp av frisk Carbenicillin og repspise protokoll fra trinn 4.1. Kulturer kan startes på nytt fra den opprinnelige omniplates så lenge omniplates er mindre enn 1-2 uker gamle.
  8. Når brukt til å starte en ml kulturer, blir omniplates lagret ved 4 ° C frem til skjermen er fullført, og kan brukes som en kilde til mat for å starte enhver retest-kulturer.
  9. Etter over natten inkubering av kulturer, bruk av en 12-kanals multikanal pipette for å fjerne 150 pl av bakteriekultur fra en dyp brønn plate og mate ut på overflaten av foringsplaten. Det er viktig ikke å stikke hull på overflaten av agaren under overføringen ormer vil grave og ikke mate på dsRNA-uttrykkende bakterier. Transfer kan gjøres fire brønner på et tidspunkt (Figur 1). For å gjøre dette, plasserer pipetter på hver tredje kanal av flerkanalspipette (så er det bare fire brønner per rad i fôring plate). Etter hvert sett av fire brønner er overført, endre til nye, sterile pipetter. Hver 96 dype brønnen kultur plate vil kreve 96 tipsfor overføring til åtte 12-brønnforingsplatene.
  10. Oppbevares seeded plater oppreist i mørket over natten slik bakterier kan absorbere i agar.

5. Generering L1 Arrested C. elegans Larver

Oversikt: L1-arrestert larvene blir brukt til å starte synkroniserte orm kulturer på de dsrna fôring plater. Disse larvene er generert ved bleking bestander av av gravid voksne å isolere friske egg og deretter la eggene klekkes i S-komplett media uten mat. I fravær av mat den klekket L1 larver vil arrestere utvikling, genererer en synkron befolkning på L1 larver. Under skjermen, forberede fersk L1-arrestert larver hver uke som disse utsultede dyrene blir syke over tid og må kastes. Valget av genetisk bakgrunn av dyrene som brukes i en dsrna fôring belastning kan variere avhengig av programmet, for nevrale skjermer eri-en; lin-15B mutanter anbefales.

  1. Plukk 10-20 L4 larvae seks separate NGM plater som inneholder en plen av OP50 bakterier og vente 6-7 dager før platene inneholder mange nylagte egg og av gravid voksne.
  2. Fjern dyr og egg fra platene ved tilsetning av 3 ml vann til overflaten av hver plate, og bruke en behansket finger for å fjerne egg, bakterier og dyr som fra overflaten av hver plate i vannet. Pass på å dekke alle områder av platen, betaler spesiell oppmerksomhet til bakteriell plenen. Fjern vannet, bakterier, ormer og egg fra hver plate ved hjelp av et glass pipette og overfør til en steril 50 ml konisk tube.
  3. Til en annen 3 ml vann til overflaten av hver plate, pipettering opp og ned over overflaten for å fjerne alle gjenværende bakterier, ormer og egg. Legg dette volumet til 50 ml konisk tube.
  4. Spin det koniske røret ved 1500 opm i 1 min i en bordsentrifuge. Ormer og egg skal pellet på bunnen av røret, og bakteriene skal forbli suspendert. Nøye aspirer alle unntatt 4 mlav væsken fra røret å være sikker på å unngå de pelleterte ormer og egg.
  5. Resuspender pelleten orm i det resterende vann, og overføres til et sterilt 15 ml konisk rør ved hjelp av en glass-pipette. Bring volumet til 10 ml med sterilt vann.
  6. Spin ved 1500 opm i 1 min som tidligere. Aspirer supernatanten forlate 200 mL vann for ikke å forstyrre orm / egg pellet.
  7. Tilsett 10 ml vann til den koniske for å vaske ormer og egg og spinn som tidligere for å fjerne flere bakterier.

Merk: I trinn 05.08 til 05.11 ormer og egg er utsatt for et blekemiddel løsning. Bleach vil ødelegge ormer og la egg relativt uskadd. Imidlertid, hvis egg er igjen i blekeløsningen for lang, vil de også bli ødelagt. Sett en timer når blekemiddel tilsettes i trinn 5.8 for å være sikker på at eggene ikke forblir eksponert for blekemiddel i mer enn 10 min.

  1. Fjern alle bortsett 200 pl av supernatanten, igjen unngår pellet, og deretter tilsettes 10ml blekemiddel og starte et tidsur.
  2. Inkuber ormer og egg i blekemiddel løsning for 3-4 min, og til å blande med inversjon. Deretter roterer ved 1500 rpm i 45 sekunder i en bordsentrifuge. Se etter en pellet i bunnen av røret, bør det være mindre og mer kompakt enn den opprinnelige pellet, og kan ta på seg et gult utseende.
  3. Aspirer kloroppløsning etterlot 200 mL bak for ikke å forstyrre pelleten.
  4. Legg til en annen 10 ml frisk blekemiddel og invertere som før. Når timeren leser 10 min, spinne igjen og aspirer blekemiddel, etterlot 200 mL bak og raskt legge til 10 ml sterilt vann. Undersøk oppløsningen under et disseksjonsmikroskop. Larvene og mange av de voksne bør ha oppløst i blekeløsning, slik at det meste egg bak.
  5. Spin som før i 45 sek, og igjen suge supernatanten for ikke å forstyrre pelleten. Denne pellet bør inneholde primært egg, og vil være meget løs.
  6. Legg anothennes 10 ml vann, invertere å blande, spinn og aspirer forlater litt vann bak. Det er viktig å fjerne så mye blekemiddel som mulig.
  7. Tilsett 4 ml S-komplette medie til konisk tube, resuspender egg og overføre til en steril 100 ml erlenmeyerkolbe. Plasser flasken i en 20 ° C inkubator på et riste sett beveger seg like raskt nok til å føre til at innholdet i kolben til å virvle. Dette vil gi tilstrekkelig lufting for å støtte L1 larvene når de klekkes. Innen 15 timers alle eggene skulle ha klekket produsere en synkron befolkning på L1 arrestert larver.

Arrestert L1 larver bør gjøres fersk hver uke i løpet av en skjerm. Når den første gruppen har blitt gjort, kan påfølgende batcher startes ved å legge 500 arrestert L1 larver (fra forrige ukes batch) til hver av fire standard, seeded 6 cm plater (som inneholder 100 mL natten kultur av OP50), og inkuberes ved 20 ° C i 4 dager. På den fjerde dagen platene bør inneholdemange egg og av gravid voksne og kan være bleket å forberede ferske egg for mer synkronisert L1 larver.

6. Overføre arrestert L1 Larver på Fôrings Plates

Oversikt: For å utføre en dsrna skjerm, er 20-30 L1 arrestert larver overført til dsrna fôring plater. Tidlig knockdown effekter som larve arrest eller dødelighet vil bli observert etter dyr har matet på dsrna-uttrykker bakterier i 2-3 dager. Avhengig av skjermen utføres, kan ønskede fenotyper holdes enten i det opprinnelige dyr plassert på foringsplaten (P0 dyr) eller i deres avkom (F1-dyr). Presentasjonen av fenotype vil avhenge av en rekke variable inkludert perdurance av proteinet som kodes av genet hvis ekspresjon blir slått ned og tiden under utvikling der genet av interesse er nødvendig. Starter dsrna fôring kulturer med bare 20-30 dyrene bør tillate observasjon av både P0 og F1 fenotyper før enimals eksos matkilde.

For enkelt å overføre 20-30 dyr til fôring plater, først bestemme konsentrasjonen av L1 arrestert dyr i arresterte L1 kultur.

  1. Bland Erlenmeyer kolbe inneholdende den pågrepne L1 larvene til å fordele dyrene.
  2. Fjern en 10 pl prøve og sted dråpevis til en unseeded 6 cm NGM plate i 4-5 dråper nedover midten av platen å sørge for at all media er utvist fra pipetten.
  3. Ved hjelp av enden av pipettespissen spre prikker av snekkesuspensjonen for å danne en enkel kontinuerlig linje av væske som strekker seg over hele diameteren av platen.
  4. Ved hjelp av et disseksjonsmikroskop, telle alle dyr som starter ved en ende av linjen for væske og fortsetter til den andre enden før at væsken absorberes i platen og dyrene spre. Dette kan kreve konstant omstilling av dissekere omfang for å være sikker på at ingen dyr er savnet.
  5. Gjenta dette for tre separate 10 mLalikvotene og gjennomsnittet de tre numrene for å bestemme den gjennomsnittlige antall ormer per mL av ormen suspensjon og skrive ned dette nummeret direkte på erlenmeyerkolben.

7. Begynn Feeding Screen

Oversikt: For å starte dsRNA-skjermen, er 20-30 arrestert L1 larver tilsatt til hver brønn på 12-brønners plater inneholdende mate en tynn plen av dsRNA-uttrykkende bakterier. Fôring plater inneholde standard nematode vekstmedier (NGM) og er supplert med 500 mikrogram / ml Carbenicillin (for å hindre plasmid tap) og en mM IPTG (å indusere dsrna uttrykk). Dyrene tillates å mate og utvikle seg i flere dager ved 20 ° C. To typiske fôringsregimer for dyr er tre dager når du utfører en P0 skjerm og 6-7 dager når du utfører en F1-skjermen. Varigheten av foring, men kan varieres avhengig av de spesifikke fenotyper søkt i skjermen.

  1. Bruk suspensjon av L1 arrestert larver og sterilt vann for å utarbeide en sliklution inneholder 2000 ormer / ml. Hver 12-vel fôring plate vil kreve 120 mL av denne ormen suspensjon. Bland grundig for å sikre en jevn fordeling av dyr og overføre dyrene til et sterilt reservoar for pipettering.
  2. Ved hjelp av flerkanals-pipette satt opp med tips på hver tredje posisjon (se figur 1) overføre 10 ul av snekke løsningen direkte på bakteriematten av foringsplatene. Pass på ikke å pierce overflaten av agar, som ormer vil hule i agar og ikke mate på dsrna-uttrykker bakterier.
  3. Å blande ormen løsningen i reservoaret (ved forsiktig sloshing det omtrent) hver to rekker av foringsplatene, som ormer avgjøre raskt. Fortsett dispenserer ormen suspensjon inntil alle fôrings platene har ormer. Undersøke noen få brønner tidlig på under dissekere omfang for å sikre at hver brønn blir 20-30 ormer.
  4. Oppbevar plater oppreist i en fuktet boks i en 20 ° C inkubator. Neste dag, etter worm suspensjon har absorbert inn i platen, snu platene og gå tilbake til humidor ved 20 ° C. Dyr på disse platene kan observeres etter 3 dager (for P0 fenotyper) og igjen etter 6 dager (for F1 fenotyper).

merk: Bakteriene som forblir på fôring plate etter 7 dager med orm vekst har blitt testet for plasmid tap og nesten 100% beholdt dsrna plasmid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P0 knockdown fenotyper vil begynne å dukke opp etter 2-3 dager med fôring dyr dsrna uttrykke bakterier. Noen tidlige fenotyper inkluderer larve arrest og dødelighet og bør observeres i 2-3% av alle fôrings brønner. De samme fenotyper vil også bli observert i F1 generasjon dyr. Tilstedeværelsen av F1 egg som ikke klarer å klekke er en annen vanlig F1 fenotype, og sammen vil disse tre fenotyper bli observert i nesten 10% av alle brønner i F1-skjermer.

Vi brukte protokollen beskrevet her for å undersøke knockdown effekter i flere gener som uttrykkes i en rekke vevstyper for både P0 og F1 fenotyper. Fordi vi ønsket også å teste for knockdown effekter i nevronale vev, brukte vi eri-en; lin-15B mutanter i skjermene våre. Mutasjoner i eri-en og lin-15B, sammen med mutasjoner i RRF-3, ble identifisert i skjermer for mutasjoner som forårsaket økt følsomhet for RNAi 8,13,14.

EGL-30, dpy-17, klapp-10, og UNC-4. To av disse genene, EGL-30 og unc-4, er uttrykt i nervesystemet 15-17, ett gen, pat-10, er uttrykt i kroppsveggen muskel 18, og det fjerde gen, dpy-17, er uttrykt i hypodermal celler 19. Når vi matet eri-en; lin-15B dyr bakterier som inneholdt den tomme pL4440 plasmid men uttrykte ikke et dsrna, gjorde vi ikke observere eventuelle morfologiske eller atferdsmessige defekter (Figur 2A, Tabell 1).

EGL-30, koder C. elegans ortholog av G protein subenheten GAQ. EGL-30 null mutanter arrest under tidlig larveutvikling, men noen null escapers og hypomorphic tap-av-funksjon EGL-30 mutanter vokse til å bli voksne stadiet og er defekte i bevegelse og egg-legging atferd 20. Nårvi matet L1 scenen eri-en; lin15B larver bakterier uttrykke EGL-30 dsrna, fant vi at larvene vokste til å bli voksne som viste tydelige defekter i bevegelse og egglegging atferd. Etter tre dager, 100% av dyrene fôres dsrna mot EGL-30 ble lammet og ute av stand til å legge egg (Tall 2B, Tabell 1). Vi gjorde ikke observere larve arrest fenotype i våre dsrna knockdown eksperimenter som er observert i EGL-30 (ad810) null dyr. Dette er antagelig fordi de L1 dyrene vi belagt på EGL-30 dsrna bakterier hadde allerede passert tidlig utviklingskravet for EGL-30. Dette fremhever en fordel fôrings skjermer: sent stadium fenotyper kan observeres etter gener som også spiller avgjørende roller under utviklingen.

dpy-17 koder for et kollagen protein nødvendig for skjellaget formasjonen i C. elegans 19. dpy-17 null mutanter er kortere og fetere enn villtype animals. Vi gjorde ikke observere noen morfologiske defekter i P0 dyr fôret dpy-17 dsrna. Men 98% av F1-dyr viste Dpy fenotype (figur 2C, tabell 1). Mangelen på korte og fett P0 dyr indikerer at dpy-17 gen-funksjon er nødvendig på tidlige larvestadier for riktig kroppsplanen. Mens dpy-17 ikke har vært målrettet i andre fôrings skjermer, ble det slått ned av dsrna injeksjon 21. Interessant nok, bare 30% av avkommet av dsRNA injiserte dyr viste Dpy fenotype, noe som tyder på at mate protokoll beskrevet her er mer effektiv enn den mer arbeidskrevende metode injeksjon, i hvert fall for noen gener.

pat-10 koder kroppsveggen muskel troponin C, et protein som inneholder fire EF Hånd motiver som binder kalsium 18. Vi fant at 100% av eri-en; lin-15B dyrene fikk klapp-10 dsrna ble lammet i tre dager, og la ingen egg ledende to en dødelig fenotype (fig. 2D, tabell 1).

unc-fire koder for et homeodomen protein uttrykt i ventral margen motoriske nevroner og er nødvendig for riktig synaptic innspill valg 22,23. Vi valgte unc-4 som en test gen fordi det har vist seg å være resistente mot tidligere dsrna fôringsstrategier 8,24. UNC-fire mutanter viser en defekt i locomotion atferd. Som en følge av mangler ved synaptisk tilkobling, unc-fire mutanter er ikke i stand til å sikkerhets 22,23. I forhold til villtype-dyrene som tilbake fritt i en sinusformet bevegelse når prodded på hodet, har unc-4 null mutanter ikke er tilbake, og i stedet trekke sitt midbody tett, forårsaker en dorsal bøyning som ofte blir så ekstrem at hodet og halen av dyr berøring, plassere legemet i en sammenrullet stilling. Vi fant at 68% av dyrene fôres unc-4 dsrna-uttrykker bakterier fra vårt bibliotek forberedelse viste defekter i BAcking. Dette er en dramatisk forbedring i knockdown effektivitet sammenlignet med 0% backing defekt observert når RRF-tre dyr fôres unc-4 dsrna hjelp tidligere publiserte protokoller 8 (Tabell 1).

Figur 1
Figur 1. Flytkart for bibliotek duplisering og storskala-skjermen. Hvert 96 eller 12 brønns plate ble generert i løpet av screeningprotokollen er angitt, sammen med den metode som brukes til å overføre bakterier mellom platene. Stjernene viser trinnene på hvilke bakterier bør testes for plasmid tap. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. dsrna knockdown fenotyper av C. elegans gener som uttrykkes i ulike vevstyper. g> a) Kontroll dyr matet bakterier som inneholder pL4440 tom vektor. Svarte pilen indikerer posisjonen til en ung voksen dyr. Hvitt pilen indikerer posisjonen til en gruppe la egg. Bildet viser fritt bevegelige dyrene som gjenspeiles av sin normale kroppsholdning. B) Dyr lei dsRNA mot EGL-30. Legg merke til at alle dyr har vedtatt en rigid utseende typisk av lammet dyr. Legg også merke til det komplette fravær av lagt egg på tallerkenen. C) Dyr lei dsRNA mot dpy-17. Merk at voksne dyr i feltet (som er merket med pil) er kortere og fetere enn den voksne dyr vist i panel A. D) Dyr matet dsrna mot pat-10. Vær oppmerksom på at alle dyr er lammet, men kan likevel flytte sine hode muskler til å mate som indikert av clearing av bakterier i nærheten av hodet, preget av pilen. Målestokk 1 mm.

dsrna plasmid eller genet målrettet av feEding Tissue uttrykk for målrettet genet Prosent dyr med terminal fenotype
pL4440 (negativ kontroll) villtype for all atferd
EGL-30 nervesystemet 100% Egl og Paralyzed
dpy-17 hypodermis 98% Dpy
pat-10 kroppsveggen muskler 100% Paralyzed
unc-4 nervesystemet 68% Bakside Defect

Tabell 1. Terminal fenotype av dyr matet dsrna mot gener som uttrykkes i ulike C. elegans vev. n = 100 for alle gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en protokoll som bruker en kommersielt tilgjengelig dsRNA forings biblioteket for å utføre store skjermer i C. elegans. Vi tilbyr alle instruksjonene for å duplisere biblioteket, og å bruke den effektivt. Vi viser at denne metode er i stand til å identifisere gener som er involvert i forskjellige biologiske prosesser i forskjellige vev av dyr. Mens fenotyper vi beskriver her er lett observer (UNC, Egl, og Dpy), kan denne protokollen tilpasses for å søke etter gener som kreves for nesten ethvert biologisk prosess. For eksempel har vi brukt denne protokollen for å identifisere gener som kreves for nevrotransmisjon i ormen 25. Når dyrene har matet på bakterier som uttrykker dsRNA (typisk 3 dager P0 skjermer, 6-7 dager for F1-skjermer), kan de bli fjernet fra foringsplaten og testet med hensyn til en hvilken som helst behavioral fenotype.

Plasmid tap:

Vi fant at de reduserte knockdown effektivitet observert understorskala dsRNA skjermene kan være direkte knyttet til tapet av dsRNA plasmid fra bakterien matet til ormer. Plasmid tap oppstår i bakterievekstkulturer fordi β-laktamase, kodet på dsRNA-bibliotek-plasmidet, virker til å forringe både ampicillin og Carbenicillin, å redusere konsentrasjonen av disse antibiotika over tid. Når konsentrasjonen av antibiotika blir tilstrekkelig lav, kan bakterier som ikke inneholder plasmidet overleve og fylle kulturen. Bruken av slike blandede bakterielle kulturer i dsRNA-skjermer må unngås, da de viser redusert knockdown-aktivitet og ofte ikke føre til tap-av-funksjon fenotyper 11.. Overraskende nok har vi funnet at høye nivåer av plasmid tap forekomme selv i bakteriekulturer dyrket i meget høye konsentrasjoner av ampicillin (opptil 2 mg / ml). Mens Carbenicillin er mer motstandsdyktig overfor nedbrytning ved β-laktamase, Vi har likevel funnet det nødvendig å anvende konsentrasjoner av Carbenicillin som var 10-40 ganger høyere enn det som erbrukt i tidligere publiserte dsRNA forings skjermer 8-10,26 å sikre at alle bakterier i kulturen beholdt dsRNA plasmid.

Fordi fleste gener i C. elegans er haplosufficient, er det kritisk viktig at alle bakterier matet til dyr uttrykke dsrna. Dette sikrer svært effektiv genet knockdown og øker sannsynligheten for å observere tap-av-funksjon fenotyper i store skjermer.

Positive og negative kontroller:

Det er viktig å inkludere både positive og negative kontroll bakterier i hver fôring plate når du utfører skjermer. Den negative kontroll er spesielt viktig dersom atferdstester vil bli brukt for å identifisere gener som er av interesse. For en negativ kontroll bruker vi bakterier inneholder den tomme vektor pL4440. For en positiv kontroll, er det best å benytte bakterier som uttrykker dsRNA mot et gen som fører til den ønskede knockdown fenotype. Imidlertid, hvis ikke slike gener er kjentN, bør en positiv kontroll for knockdown brukes som forårsaker en lett observerbar fenotype. Ved valg av et slikt gen, bør preferanse gis til gener som blir uttrykt i den vevstype rettet på skjermen. For eksempel, i dsRNA forings skjermer for neuronal fenotype, en neuronal gen bør velges som en positiv kontroll. En observerbar knockdown effekt i dyr beiter på de positive kontroll bakterier vil indikere at dsrna forstyrrelser arbeider i ønsket vevstype.

Det er best hvis personen scoring fôring plater for fenotyper er blind for plasseringen av de positive kontrollbrønner. Den screener bør være i stand til enkelt å identifisere positive godt i hver 96-brønns plate. For atferds analysene er det nyttig å score det negative vel først før du skanner de resterende brønnene.

Gjennomløp:

Ved hjelp av denne protokollen, bør en person være i stand til å sette opp og skjermen 16, 12-brønners platerper dag. Å flytte effektivt gjennom biblioteket, vi vanligvis teste hver brønn av hvert bibliotek plate bare én gang i løpet av en skjerm. Eventuelle brønner som scoret så positive blir nedskrevet og testes i tre eksemplarer. Vi krever at de positive brønner retest i alle tre retests. Plasmidet blir deretter renset fra bakterier og innsatsen blir sekvensert for positivt å identifisere genet. Hvis null mutanter er tilgjengelig for genet, vil vi bestille dem og teste null dyr for de atferdsmessige feil identifisert i skjermen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health MH097163. Noen stammer ble gitt av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure programmer (P40-OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
96-well Falcon flat bottom plate Fisher Scientific 353072 sterile
adhesive foil USA Scientific 2923-0100
Nunc omniplate Fisher Scientific 267060
2.0 ml deep 96-well polypropylene Masterblock USA Scientific 5678-0285 autoclavable
Lids for deep well plates USA Scientific 5665-6101
50 ml combitips USA Scientific 4796-5000 individually wrapped
Reservoir USA Scientific 2977-8500 autoclavable
12-well plates USA Scientific CC7682-7512 individually wrapped
dsRNA feeding library OpenBiosystems RCE1181 store -80 °C
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Tetracycline Fisher Scientific BP912-100
Carbenicillin allow 2-4 weeks for delivery www.biochemicaldirect.com
Bacteriolgical Agar Ultrapure grade A Affymetrix 10906 for worm plates
Equipment
Brayer roller USA Scientific 9127-2940
B–kel 96-pin replicator Fisher Scientific 05-450-9 autoclavable
microshaker Thomas Scientific 1231A93 3 mm orbit
12 channel multichannel pipet (0.5-10 μl) USA Scientific 7112-0510
12 channel multichannel pipet (30-300 μl) USA Scientific 7112-3300
Repeater Plus manual pipettor USA Scientific 4026-0201

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
  4. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  5. Jose, A. M., Smith, J. J., Hunter, C. P. Export of RNA silencing from C. elegans tissues does not require the RNA channel SID-1. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2283-2288 (2009).
  6. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  7. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  8. Simmer, F., et al. Genome-wide RNAi of C. elegans using the hypersensitive rrf-3 strain reveals novel gene functions. PLoS Biol. 1, 77-84 (2003).
  9. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
  10. Sieburth, D., et al. Systematic analysis of genes required for synapse structure and function. Nature. 436 (7050), 510-517 (2005).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), (2001).
  12. Hodgkin, J. Karyotype, ploidy, and gene dosage. WormBook. , 1-9 (2005).
  13. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436 (7050), 593-597 (2005).
  15. Lackner, M. R., Nurrish, S. J., Kaplan, J. M. Facilitation of synaptic transmission by EGL-30 Gqalpha and EGL-8 PLCbeta: DAG binding to UNC-13 is required to stimulate acetylcholine release. Neuron. 24 (2), 335-346 (1999).
  16. Bastiani, C. A., Gharib, S., Simon, M. I., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans Galphaq regulates egg-laying behavior via a PLCbeta-independent and serotonin-dependent signaling pathway and likely functions both in the nervous system and in muscle. Genetics. 165 (4), 1805-1822 (2003).
  17. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. J. Neurosci. 21 (6), 2001-2014 (2001).
  18. Terami, H., et al. Genomic organization, expression, and analysis of the troponin C gene pat-10 of Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 146 (1), 193-202 (1999).
  19. Novelli, J., Page, A. P., Hodgkin, J. The C terminus of collagen SQT-3 has complex and essential functions in nematode collagen assembly. Genetics. 172 (4), 2253-2267 (2006).
  20. Brundage, L., et al. Mutations in a C. elegans Gqalpha gene disrupt movement, egg laying, and viability. Neuron. 16 (5), 999-1009 (1996).
  21. Gönczy, P., et al. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408 (6810), 331-336 (2000).
  22. Miller, D. M., et al. elegans unc-4 gene encodes a homeodomain protein that determines the pattern of synaptic input to specific motor neurons. Nature. 355, 841-845 (1992).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N. Mutations in the Caenorhabditis elegans unc-4 gene alter the synaptic input to ventral cord motor neurons. Nature. 355, 838-841 (1992).
  24. Johnson, N. M., Behm, C. A., Trowell, S. C. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome. Gene. 359, 26-34 (2005).
  25. Wani, K. A., et al. D1 dopamine receptor signaling is modulated by the R7 RGS protein EAT-16 and the R7 binding protein RSBP-1 in Caenoerhabditis elegans motor neurons. PLoS One. 7 (5), e37831 (2012).
  26. Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi screening to identify postembryonic phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442 (2012).

Tags

Developmental Biology Caenorhabditis elegans (C. elegans) Gene Knockdown Teknikker, Dsrna forstyrrelser gene knockdown stor skala fôring skjerm
Storskala Gene Knockdown i<em&gt; C. elegans</em&gt; Bruke dsrna Fôrings biblioteker for å generere en solid tap-av-funksjon Fenotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maher, K. N., Catanese, M., Chase,… More

Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes. J. Vis. Exp. (79), e50693, doi:10.3791/50693 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter