Fleksibel Koloskopi i mus til at vurdere sværhedsgraden af ​​colitis og Colorectal Tumorer med en valideret Endoskopisk Scoring System

Summary

I løbet af de sidste par år har en ny generation af endoskoper dukket op som vigtige diagnostiske forskning hjælpemidler til evaluering af murine colitis og kolorektale tumorer. Vi præsenterer her en detaljeret protokol til endoskopisk vurdering af inflammation og kolorektale tumorer i mus, såvel som en ny scoring system, der bruger decimaler identifikatorer for at dokumentere den endoskopiske alvoren af ​​colitis og kolorektale tumorer.

Abstract

Brugen af ​​moderne endoskopi til forskningsformål høj grad har lettet vores forståelse af gastrointestinale sygdomme. I særdeleshed har eksperimentel endoskopi været særdeles nyttigt til undersøgelser, der kræver gentagne vurderinger i et enkelt laboratorium dyr, såsom dem vurdere mekanismer kronisk inflammatorisk tarmsygdom og progression af kolorektal cancer. Men de metoder, der anvendes på tværs af undersøgelser er meget varierende. Mindst tre endoskopiske pointsystemer er blevet offentliggjort for murine colitis og offentliggjort protokoller til vurdering af kolorektale tumorer ikke fat tilstedeværelsen af ​​samtidig colon inflammation. Denne undersøgelse udvikler og validerer en reproducerbar endoskopisk scoring system, der integrerer evaluering af både inflammation og tumorer samtidigt. Denne roman pointsystem har tre hovedkomponenter: 1) vurdering af omfanget og alvoren af ​​kolorektal inflammation (baseret på perianale resultater, gennemsigtighed af wall, slimhinde blødning, og fokale læsioner), 2) kvantitativ registrering af tumor læsioner (gitter kort og bar graf), og 3) numerisk sortering af kliniske tilfælde af patologiske og forskning relevans baseret på decimaler enheder med tildelte kategorier af observerede læsioner og endoskopiske komplikationer (decimal identifikatorer). Den video og manuskript præsenteret heri var forberedt, efter IACUC-godkendte protokoller, at give efterforskerne til at score deres egne eksperimentelle mus bruger et godt valideret og meget reproducerbar endoskopisk metode, med systemet mulighed for at differentiere distalt fra proksimale endoskopisk colitis (D-PECS ).

Introduction

Murine endoskopi er udført som et nyttigt værktøj for forskningen i over et årti ^1-3. Til dato har de fleste undersøgelser anvender murine endoskopi bruges stive endoskoper, selv om nogle også har brugt fleksibel sigmoideoskopi. Murine endoskopi giver øjeblikkelige resultater og en mere objektiv vurdering af omfanget af tarm normalitet, sværhedsgraden af ​​inflammation, og tumorprogression i forhold til indirekte foranstaltninger, såsom vægttab, diarré og histologi (som er suboptimal når læsioner er pletvis), mens tilbyder indsigt om den generelle sundhed i tyktarmen. Mest bemærkelsesværdigt, endoskopi giver mulighed for gentagen vurdering af laboratoriets dyremodeller over tid, i modsætning til traditionel histologisk undersøgelse, der kræver dyr, der skal aflives og koloner til at blive høstet til analyse ^1.. På trods af disse fordele, har anvendelsen af ​​murine endoskopisk teknologi ikke været udbredt, og er begrænset af manglen på standardiserede protokoller for implementatiom og scoring af patologiske fund. Gennemføres korrekt, murine endoskopi lover godt for yderligere at lette vores forståelse og karakterisering af dyremodeller af flere kroniske gastrointestinale sygdomstilstande, herunder inflammatoriske tarmsygdomme, colitis, og kolorektale tumorer.

Nytten af ​​murine endoskopisk teknologi beror på dens reproducerbarhed og objektivitet, som kræver eksistensen af ​​standardiserede undersøgelsesprocedurer og et ensartet, ikke-redundant og pålidelig pointsystem for tarm sygdomme. Mindst tre beskrivende pointsystemer for endoskopisk vurdering af colitis ^4-6, samt for colon tumorer ^4,7,8 i mus er blevet offentliggjort. Men disse rapporterede tilgange og pointsystemer ikke umiddelbart sammenlignelige på tværs af studierne. I mange tilfælde er der ingen klar definition af de kriterier, der anvendes til klassificering af læsioner, og når kriterierne er givet, at de varierer meget. DesudenDer er ikke rapporteret pointsystemer, der integrerer en vurdering af både colitis og tumorer, to af de mest almindelige colon patologier, der kan opstå på samme tid og har interaktive effekter på resultatet, i en enkelt måling værktøj. Endelig er de endoskopiske pointsystemer, der findes for colitis har ofte inflammatoriske kategorier med begrænset diskrimination (dvs.. Smalle scoring muligheder over korte heltal skalaer, ofte 1-4) til korrekt repræsenterer sygdomsprogression scenarier og muliggøre brugen af parametrisk statistisk analyse.

I dette papir, vi beskriver anvendelsen af ​​et fleksibelt endoskop til at vurdere sværhedsgraden af ​​murin colitis og colon-tumorer og beskrive en standardiseret protokol for anvendelse af denne teknologi i den anatomiske vurdering af perianale region, endetarmen og den distale colon. Vi illustrerer effektiv fejlfinding under endoskopi for at minimere traume og billedartefakter, og vi skal beskrive en reproducerbar pointsystembaseret på validerede offentliggjorte kliniske parametre. Pointsystemet integrerer evaluering af både tarmbetændelse og svulster ved hjælp af en høj grad af diskrimination med 12 mulige grader af inflammation, tumor kortlægning og plotte muligheder, og en roman decimal enhed systemet (dvs. decimal identifikatorer) til at fremhæve resultater med specifik diagnostisk værdi ( dvs tumor udvikling, komplikationer under endoskopi, osv.). Brugen af ​​decimaler identifikatorer giver mulighed for hurtig sporing af relevante datasæt til videre nedstrøms analyse. Endelig udfører vi pålidelighed og gyldighed test af pointsystemet i flere murine modeller af colitis og colitis-associeret cancer (dextransulfatnatrium (DSS) induceret colitis, Clostridium difficile infektion, og azoxymethan / DSS-induceret colon cancer).

Protocol

1.. Opsætning af Endoskopi System

1. Opsætning af endoskopi, før bedøve musene efter producentens anvisninger. Brug en video ureteroscope designet til mennesker til denne protokol (figur 1). Den ydre diameter af indføringsrøret er 9,9 Fr (3,3 mm), dets distale ende er 8,5 Fr (2,8 mm), og den indvendige diameter af instrumentering kanal 6 Fr (1,2 mm).
2. Selv om brugen af endoskoper ikke har været knyttet til overførsel af sygdomme [9], sterilisere endoskop og objektiv med 70% ethanol ¹⁰ eller med passende teknikker, når du arbejder med sporedannende mikroorganismer. Forbered bakteriostatisk sterilt smøremiddel og ikke-skrabe tørre væv til at mætte endoskopet spids.
3. Monter en 3 ml sprøjte fyldt med luft (eller en passende gasblanding CO ₂₎ til toppen af instrumentering kanal.
4. Tænd for strømmen, og oprette hvidbalancen i normalt hvidt lys,samt snævre bånd imaging (NBI)-tilstand, når det er relevant. Siden 2001 har NBI forudsat billeddiagnostiske fordele, da det fremhæver fine strukturer blodkar på slimhinder, herunder colitis og tumorform læsioner, som har karakteristiske unormal vaskularisering ^11. NBI-filter funktionen begrænser bølgelængde fanget lys til 390-445 nm og 530-550 nm, som fremhæver strukturer med hæmoglobin.
5. Udskriv vurderingen scoring formular (Figur 2) til at registrere dine resultater. Bliv fortrolig med forventede normale og NBI billeder (figur 3A) og definitionen og kvaliteter af hvert kriterium før eksamen (se afsnit 6.1).
6. Forbered et farvestof-baseret løsning på phosphatbufret saltvand (PBS) for chromoendoscopy, hvis det ønskes. I chromoendoscopy er eksamen udføres ved hjælp af et farvestof som kontraststof for at fremhæve slimhindeforandringer. Brug methylenblåt (0,1-1%) og indigo karminrød (0,1%)-løsninger (figur 3B). Bemærkat methylenblåt er en oxidations-reduktions-middel, som kan producere oxiderende radikaler, indirekte tværbinding af aminosyrerester, og DNA-nedbrydning ^12, som kunne interferere med prøveanalyse.

2. Generel anæstesi af musen

1. Vælg bedøvelsesmidlet og indgivelsesvej. Konsultere en dyrlæge fra et dyr ressource facilitet eller Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) vedrørende potentiel interferens af medicin med immunsystemet og forskningsmæssige mål. Nogle medikamenter kan påvirke cytokinprofilen udtryk hos dyr, herunder gnavere ^13. Brug injicerbar tribromethanol for terminal procedurer eller isofluran for overlevelse endoscopies, sammen med passende kontroller.
2. Til induktion, administrere 4-5% isofluran i 100% oxygen med en hastighed på 0,2-0,5 l / min, bruge 0,5-2% for vedligeholdelse. Denne protokol er ikke hensigtsmæssigt for alle dyr. Kontakt din facilitet dyrlægefor ordentlig vejledning og uddannelse. Overholde relevante IACUC anbefalinger til at opnå de højeste standarder for dyrevelfærd. Sørg for, at musen hvis fuldt bedøvet.
3. "Strap" den bedøvede mus til en bærende overflade bord i en dorsal eller ventral position ved hjælp af laboratorie tape. Pas på de anatomiske orientering på din endoskop skærm. Sikre sine nedre ekstremiteter og hale. Et band af tape kan også placeres over brystet for at forhindre bevægelse væk fra respiratoren, men undgå at begrænse thorax ventilering bevægelser.

3. Detaljeret endoskopisk undersøgelse

1. Kig efter perianale læsioner, før du sætter endoskopet ind i endetarmen, så videre omfang gennem anus.
2. Coat endoskopet med sterilt kirurgisk smøremiddel. Vær sikker på ikke at coate overfladen af ​​CCD (charge coupled device) sensor.
3. Sæt endoskopet og starte optagelsen. Optagede videoer er nyttige for meticulous evaluering af endoskopi, hvis nødvendigt efter undersøgelsen. Forsøger at udføre endoskopi i mindst mulig tid for at minimere tarm / mucosal irritation.
4. Anvend luft ved hjælp af en sprøjte langsomt indsat tarmvæggene. Afhængig af størrelsen af ​​musen, bruge 1-2 ml luft. Undgå overdreven luft indblæsning, da det kan forårsage åndedrætsbesvær og død for den bedøvede mus.
5. Advance endoskopet frem, som du rydde vejen med luft eller blid rotation af anvendelsesområdet. Må ikke rykke endoskopet hvis du ikke kan se det intestinale lumen. Perforeringer eller rektale / colon tårer kan forekomme på dette stadium, især hos unge mus (<8-10 uger gamle). Tag billeder som nødvendigt.
6. Da rækkevidden fremskridt, vurdere, om der er spontan blødning (defineret som naturligt forekommende slimhinde hemorrhaging ikke forbundet med traumatisk endoskopi). Spontane blødninger kan observeres som endoskopet ind i endetarmen og tyktarmen.
7. Somderer gennemsigtigheden af ​​colon væggen. Gennemsigtighed er defineret som evnen til at visualisere murene blodkar i tyktarmen og de ​​øvrige omgivende organer (figur 4). Skånsom bevægelse af anvendelsesområdet (back-forward, med uret, mod uret) vil hjælpe med at afgøre, om blodkarrene kan ses i sammenhæng med andre indvolde. Mesenterial fedtvæv kan også ses. Bemærk hvis endetarmen inde bækkenhulen ser mindre gennemskueligt end colon væggen i bughulen.
8. Undersøg at bestemme typen og antallet af fokale læsioner (ødematøse områder, erosioner, sår, svulster). Dette vil blive registreret i scoring formular ved hjælp colon inflammation score og decimal identifikatorer der er blevet udviklet.
9. Når det område, hvor tyktarmen bøjer caudally i den proksimale kolon er nået, trække endoskopet langsomt og ser for tilstedeværelsen af ​​kontakt blødning (som opstår på grund mucosal skørhed efterendoskop er avanceret eller fjernet). Det er ikke nødvendigt at skrabe tyktarmen overflade forsætligt. Sund kolorektal slimhinde ikke bløder efter korrekt endoskopisk undersøgelse.

4.. Biopsi

1. Når der er behov for biopsier, indsætte biopsitang gennem endoskopet kanal dedikeret til instrumentering. Overvåg fremrykning af tang på endoskopet skærmen for at forhindre intestinal perforering.
2. Åbn biopsi kopper pincet til omkring en 60-80 ° kop til kop-vinkel og lede dem til området af interesse. Udpræget åbnet tang eller tryk kan gribe ekstra lag af tarmvæv, hvilket resulterer i en biopsi-induceret perforering af sunde gennemsigtige tarmvæggene. Hvis perforering sker, aflive dyret under anæstesi efter dine IACUC anbefalinger. Perforeringer resultere i endotoxæmi og peritonitis.
3. Luk biopsi kopper, og trække dem ud og samtidig holde tangen lukket.
4. Remove prøven fra tangen ved at skylle vævet med en løsning, der er skånsom for vævet og pincet. RNA senere og PBS er fælles arbejdsmetoder løsninger, hvis det er nødvendigt, bruge nålen for at fjerne prøven. Undgå at udhule pincetspidser kopper eller skære kanter.

5.. Recovery fra Anæstesi

1. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen, giver et varmt miljø til musen, indtil den kommer sig. Brug enten en elektrisk lys eller en varm pad ved 37 ° C. Undgå overophedning, perifer vasodilation kompromiser dyr opsving. Overvåg musen tæt indtil fuld helbredelse.

6.. Integreret Endoskopisk Scoring System of Colorectal sundhed med Decimal Identifikatorer

1. Brug scoring formularen (Figur 2) og parameteren definitionerne nedenfor (Endoskopisk Vurdering af murine kolorektal Inflammation og tumorer med en Decimal-vægtet Scoring System: parameterdefinitioner, og protokol) foreksempler og den valgfri "Distal-proksimal Endoskopisk Colitis scorer system« (D-PECS) som retningslinjer for nonbiased vurdering og detaljeret journalføring.
2. Score de fire parametre for kolorektal betændelse beskrevet på pointsystemet formular (Figur 2). Omhyggeligt vurdere perianale region, intestinal gennemsigtighed, type af intestinal blødning (hvis den findes), og tilstedeværelse og mængde af fokale læsioner (eroderende, colitis, og / eller tumorform).
3. Ved vurderingen tumorer til forskningsformål, undersøge mængde, placering og størrelse, og beskrive dem ved hjælp af colon kort og søjlediagram på scoring formular. Den numeriske sum af de opnåede scorer og antallet af læsioner (hvis relevant) vil afgøre baggrunden colon inflammation, den mest fremherskende type læsion, og antallet af læsioner.

Representative Results

Protokollen og billeder præsenteres i denne undersøgelse blev forberedt med et Olympus URF-V fleksibel endoskop ¹⁴ og NBI ^11,15. Video billeder blev gemt i MPEG-2 format og billeder i JPG, TIF, PNG, eller DICOM format med maksimalt 1.280 x 1.024 pixels, der kan overføres til standard USB-flash-bærbare minder. NBI forbedrer den visuelle kontrast af hæmoglobin-holdige væv. Normal lys og NBI billedbehandling er centrale funktioner til at illustrere den normale anatomi kolorektal slimhinde og forskellene mellem normal og unormal vaskularisering under sårdannelse og tumor udvikling (figur 3A og 6A). Billeder med methylenblåt som kontraststof under chromoendoscopy vise sine fordele for close-up billeder, afslører antenne normal honeycomb udseende colonkrypter (se tæt op i figur 3B).

Til dato har vi gennemført over 500 murine endoskopier Follofløj denne protokol, med omkring 10%, der repræsenterer gentagen undersøgelse. Generelt procedure kræver 10-15 minutter at udfylde, ligeligt fordelt mellem administration af anæstesi, endoskopi, og genrejsning efter anæstesi. Undersøgelsen omfatter fra anus til milten bøjning af den distale colon. Vi har også med held gennemført postmortem endoskopiske undersøgelser af den proximale colon, coecum og ileum i nogle tilfælde efter obduktion dissektion af væv umiddelbart før høst væv til histologi (figur 6B). I et tilfælde har vi også observeret og bekræftet mistænkt ventrikel dilatation i en mus påvirket med svær duodenal striktur og sammenpresning grund tarm sammenvoksninger. Den unormale billede blev observeret transmurally fra den mest kranielle aspekt af et mildt betændt distal colon, obduktion viste udspilet mave var sammenstillet til tyktarmen.

Vi har udviklet et gyldigt og pålideligt decimal-vægtede sudkerning system til at forbedre en standardiseret anvendelse af murine endoskopi tværs offentliggjorte forskningsundersøgelser. Tre pointsystemer har tidligere været ansat, og tjente som grundlag for udviklingen af vores decimal-vægtede systemet ^4-6. Selv om disse systemer giver mulighed for kategorisering af forskellige kriterier og niveauer af læsion sværhedsgrad, de mangler ordentlige kriterier definitioner, hvoraf nogle er vanskeligt at vurdere fra endoskopiske billeder. I nogle tilfælde tvetydige parametre, der indgår i scoring systemer har tvivlsom relevans for endoskopisk undersøgelse i mus. Et resumé af elleve offentliggjorte parametre ^4-6 og deres endoskopiske fordele, begrænsninger og fysiologiske relevans præsenteres i tabel 1.

Da den foreslåede murine colon endoskopi pointsystem vil blive brugt til forskningsformål, dens anvendelighed til at udføre statistisk inferens var afgørende. For at sikre, at pointsystemet havdehøj konstruktion gyldighed, vi først udviklet en begrebsramme til at identificere relevante parametre, grupperet disse parametre til færre kriterier (n = 3), og vurderet deres colinearitets og korrelation med faktiske tilstedeværelse af inflammation og heling (figur 7). Dernæst har vi tilføjet perianale fund bruge diskrete heltal til at repræsentere ordenstal niveauer af sværhedsgrad, og integreret begrebet tumorinduktion og udvikling ved hjælp af decimaltal identifikatorer. Derudover har vi tilføjet 'strikturer' som en anden parameter, der ikke tidligere blev betragtet / rapporteret i murine tarm endoskopi. De resulterende output scoringer producere høj validitet og er egnet til parametrisk statistisk analyse. Endelig har vi tilføjet kortlægning og numeriske Plotte kapaciteter til overvågning detaljeret sygdom.

For at vurdere konvergerende gyldigheden af ​​vores evalueringssystem, blev scores opnået fra tre offentliggjorte parametre for 36 mus colonoscopies sammenlignet med de scores obtaineret af den samme person blindt at bruge tre tidligere pointsystemer ^4-6. Enhver sammenligning viste god, positiv korrelation, hvilket indikerer høj konvergent validitet for vores integreret pointsystem (Pearson p <0,0001, Figur 8). Analysen støtter inddragelsen af ​​perianale undersøgelsesresultater som en del af de kliniske kriterier til vurdering kolorektal sundhed, som det var almindeligt til stede i tilfælde af alvorlig colitis og forbedret data spredning (P = 0,0351 mellem score 0 og 1, P = 0,0086 mellem score 2 og 3, figur 8B). Når det integrerede pointsystem (efter tilsætning perianale resultater) blev sammenlignet med de andre tilgængelige systemer, var det tydeligt, at 2 af de 3 andre systemer har stor inferential begrænsning på grund af ophobning af tilfælde til en af ​​de fire mulige heltal, vil en større angivelse af metode fejltarifering bias (figur 8C) ^16. Med decimaler identifikatorer, vores nye pointsystem har den laveste sandsynlighed for klyngergistrering datapunkter i heltal kategorier.

Figur 1. Instrumenter. Fleksibel endoskop, video kontrolsystem, lyskilde, videooptager, og indånding anæstesiapparatet anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Decimal pointsystem formular til vurdering af colitis og kolorektale tumorer i mus. Systemet har en kerne, inflammatorisk bestanddel fire ikke-co-lineære parametre, grafik til tumor information og decimaltal enheder til bemærkelsesværdige læsioner eller komplikationer. Se detaljerede kriterier og eksempler i afsnittet nedenfor (Endoskopisk Vurdering af murine kolorektal Inflammation og tumorer med en Decimal-vægtet Scoring System). Klik her for at se større billede .

Figur 3. Forbundne billeder af normal slimhinde i normal endoskopisk lys-tilstand, NBI-tilstand og med chromoendoscopy. Arborization af blodkar er normalt mindre udbredt i endetarmen. Klik her for at se større billede .

fo: content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4.. Tværsnitsafbildning af intestinale sløjfer til illustrere princippet af endoskopisk gennemsigtighed af tarmvæggen i mus. Endoskopisk visualisering af vægmaleri intestinale fartøjer og mesenterial fedt, og af mesenteriske fartøjer og fedt fra tilstødende sunde indvoldene er muligt gennem væggen i et sund kolon. Betændelse og fortykkelse af tarmvæggen i bughulen sektioner af den distale colon forhindrer visualisering af murene og transmurale strukturer fra andre indvolde, selvom andre tarmsegmenter er sunde. Klik her for at se større billede .

3/50843fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50843/50843fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Fejlfinding. Løsning lav sigtbarhed forårsaget af tarmindhold, slørede billeder og peristaltiske bevægelser. Klik her for at se større billede .

Figur 6. Forbundne billeder (almindelig lys vs smalbåndet billedbehandling, NBI) af sygt colorectal slimhinde og andre proksimale tarmsegmenter. NBI hjælper med at identificere colitis og tumorform læsioner. Nogle sår vises brunlig med NBI, andre, dækket med fibrinøs materiale ser tyk og hvid. AOM / DSS tumorer er bedre karakteriseres med NBI, især i de tidlige stadier, når de ikke errager ind i hulrummet. Stjerner (*) at fremhæve endoskopisk artefakt (slimhinde korrugering) i tyktarmen fyldt med PBS, ikke er observeret i alle andre billeder, hvor kolon er udspilet med luft. Klik her for at se større billede .

Figur 7. Teoretisk korrelation og co-linearitet mellem sværhedsgraden af tarmbetændelse og evnen til visuelt at skelne og lønklasse forskellige offentliggjorte kriterier for colon inflammation (se tabel 1). Klik her for at se større billede .

Figur 8. Sammenligning af resultater mellem vores pointsystem og tidligere offentliggjorte pointsystemer. Data fra parret blinde analyser af 36 mus video endoscopies. A) Sammenligning af System A (5 parametre) til de inflammatoriske parametre, med undtagelse af perianal læsioner (3 parametre). B) Betydningen af bl.a. perianale fund i pointsystemet. perianal undersøgelse konsekvent givet yderligere statistisk signifikant information i tilfælde af moderat / svær colitis hos mus C) Ydelse af pointsystemet efter herunder perianale resultater i forhold til tidligere rapporterede systemer (36 mus video endoskopier blev scoret med hver metode). Bemærk, at systemerne B og C har en stor begrænsning på grund af ophobning af tilfælde i en af ​​deres fire kategorier, der fører til misclassification bias (Systems B-og C klynge sager i nonequivalent kategorier). Ved at tilføje decimale identifikatorer, vi også sænket chancen for klyngedannelse i heltal kategorier, samtidig med at spore nu meningsfulde numeriske scoringer. Klik her for at se større billede .

Tabel 1.. Kliniske parametre, der er offentliggjort som endoskopiske kriterier til bedømmelse tarmbetændelse hos mus. Klik her for at se større billede .

Endoskopisk VURDERINGnt af murine kolorektal Inflammation og tumorer med en Decimal-vægtet Scoring System: Parameter Definitioner og protokol

Vores integrerede endoskopisk pointsystem for tyktarms sundhed har tre hovedkomponenter: 1) vurdering af omfanget og alvoren af ​​kolorektal inflammation, med fire parametre og 12 mulige numeriske kvaliteter, 2) registrering af placering, størrelse og antal af tumorøse læsioner, og 3 ) decimal enheder med tildelte typer af primære eller fremherskende læsioner og endoskopiske komplikationer for at fremhæve resultaterne af særlig betydning for forskeren, heri benævnt "decimal identifikationer". Placeringen og størrelsen af ​​tumorer registreres på en virtuel colon kort, og antallet af tumorer i hver procent fremspring (obstruktion) i lumen registreres på en graf. Disse to diagrammer giver tumor oplysninger, der kan integreres i tre dimensioner. De decimaler enheder for læsion kategorier spænder fra 0,0 til 0,9. Hvis number af læsioner for en bestemt kategori er relevant, andet og tredje decimaler kan bruges til at angive antallet af læsioner. For eksempel, hvis tre læsioner observeres, tilføjer 0,003 ville give forskeren til at vide, at der var tre læsioner, hvis der er 12 læsioner, så 0,012 ville blive anvendt. Denne tracking system er af særlig fordel, hvis der forventes gentagne endoskopiske undersøgelser. Detaljerede definitioner af de kriterier, inflammation og sværhedsgrad kvaliteter er angivet nedenfor.

A. Vurdering af kolorektal infammation med fire kliniske parametre - definition af endoskopiske kriterier

1.. Perianale fund: Vurder dette aspekt, før de påbegynder områdeafgrænsning at undgå forveksling med post-endoskopi blødning. Sundhedsministre perianale regionen er en proxy for sundhedstilstanden i tyktarmen, hud og dyrets holdning i almindelighed, og indgår som en del af endoskopisk undersøgelse, fordi nogle læsioner ikke kan og should ikke undersøges nøje med det blotte øje. Udvis biosikkerhed foranstaltningerne. Bemærk, at sunde grooming vaner af musene kan fjerne blod / udledning, men vil ikke fjerne hudlæsioner fra den perianale region. Scoring:

0. Normal. Ingen blod, diarré, revner, fistler eller udledning overholdes.
1. Klumper af fækalt materiale eller diarré observeres.
2. Blodpropper / klumper af blodige udledning, løse afføring (diarré), pus eller mindre ulcerationer observeret.
3. Granulationsvæv eller læsioner observeret, der involverer de fleste af den omgivende hud, og angiver, at dyret har markeret irritation eller inflammation i perianale region rektalprolaps.

2. Gennemsigtighed i tyktarmen: defineres som evnen til at visualisere blodkar eller extramural organer gennem colon væggen som kolon-endoskop forsigtigt flyttes. Bemærk, at endetarmen er naturligvis mindre gennemsigtigt på grund af de muskulære lag end fordi det er i bækken hulrum, hvor der findes mindre kontrast. Dette er en af ​​de fysiologisk mest omfattende parametre, da det afspejler den samlede betændelsestilstand eller helbred i det murine kolon. Bemærk, at det er muligt at have en ikke-betændt colon mucosa erosioner / sår i tidlige stadier af infektion eller toksiske virkninger på epitel. Pas på, fysiologisk isotonisk opløsning bør anvendes til skylning under endoskopi, som hypotoniske løsninger, såsom vand, forårsage ændringer med kridtning og sammentrækning af slimhinden i mus, hvis brug i længere perioder (se Stjernerne i figur 6).

0. Normal. Store og små blodkar i tyktarmen og de omkringliggende indvolde er klart synlige. Bevæg endoskopets lidt (frem og tilbage, ur / mod uret). Kan også observeres Hvid mesenterial fedt eller mørk indhold af andre organer.
1. Små skibe er delvist usynlige, men store skibe er synlige.
2. Lille vessels er usynlige og store fartøjer er ikke klare. Slimhinden vises ikke fortykket.
3. Tilsyneladende fortykkelse af tarmvæggen og / eller slimhinde ødem / generaliseres. Blodkar er ikke synlige. Få udspilet / åreknuder fartøjer kan være synlige i nogle tilfælde.

3. Slimhinde blødning: Differentiere kontakt blødning fra spontane blødninger. Rutinemæssige standard endoskopiske procedurer i raske mus bør ikke fremkalde blødning. Hvis der er inflammation, kan den forøgede mucosale vaskularisering og væv skrøbelighed føre til mucosal erosion og blødning. Der er ingen grund til forsætligt skrabe tyktarmen til at vurdere denne parameter.

0. Normal, ingen blødning.
1. Fælles kontakt blødning. Denne traumatisk blødning er defineret som kontakt blødning, og det bør kun vurderes efter tilbagetrækning af endoskop.
2. Ikke relevant. Bevidst ikke er tildelt til at tvinge eksaminator at afgøre nature for blødning.
3. Spontan blødning, defineres som en ikke-traumatisk og naturligt forekommende blødning, der er observeret som endoskopet ind i tyktarmen. Undertiden luft insufflation inducerer spontan blødning under alvorlig colitis.

4.. Fokale læsioner: For at imødekomme fragmentarisk, uforudsigelige kolorektale sygdomme, er denne integreret pointsystem giver grading for tilstedeværelse af fokale læsioner (for det meste colitis i naturen) af sværhedsgraden af inflammation. Da tyktarmen er en kort, lige rørformet segment i mus, blev det anset for unødvendigt at beskrive placeringen af ​​læsioner. I stedet registreres antallet af læsioner og lægges til den samlede score ved hjælp af systemet af decimaler identifikatorer. Men hvis der er behov for fokus på placeringen af ​​læsionerne, vi har en indstilling, der hedder 'Distal-proksimal Endoskopisk Colitis Scoring System' (D-PECS) beskrevet nedenfor i afsnit F. Yderligere strømlinede programmer kan værestammer fra vores decimal pointsystem. Fordi tumorer sjældent findes uden at fremkalde en form for betændelse i kolorektal region i mus, har vi inkluderet tumorer i decimal identifikatorer sektion til entydigt at tillade undersøgelse af tumorer i forbindelse med tarmsystemet (se nedenfor).

0. Normal, ingen fokale læsioner.
1. Veldefinerede områder af lille flad elevation er omfattet af normal slimhinde overholdes. Dette er for at behandle de lokale ødematøse områder eller potentielle områder for celleinfiltration / spredning, som findes i mild colitis.
2. Rødmede eller eroderende områder overholdes.
3. Ulceration eller strikturer. Sår er identificeret ved rødme og deformitet (uregelmæssige kanter med tegn på abnorm vaskularisering) på grund af ødematøse eller fibrotisk sår reparation. NBI endoskopi er nyttigt at skelne afsløring eller observation af ulcerationer. Strikturer anerkendes som områder unormalt smalle, cirkulære eller uregelmæssige og statiske form, der ikke kontrakten eller udvide som exforventet. Ofte strikturer inddrage områder af unormal slimhinde krypter, eller villi i ileum. I tilfælde af fleksible endoskoper (udvendig diameter = 3,3 mm) omhyggelig manglende evne til at fremme anvendelsesområde i flere proximale områder af tyktarmen er konsekvent forbundet med unormale strikturer verificerede post mortem.

B. Tumor diagrammer for optagelse placering, størrelse og antal

1.. Virtuel colon kort: Dette kort er et virtuelt perspektivisk billede af den distale colon og rektum, der er lavet ved at skære den øverste del af hulrummet (0 °) og rulle den ud. Toppen og bunden af ​​diagrammet er tildelt proximalt af colon (bøjning), og anus, hhv. Midterlinien (180 °) angiver bunden af ​​hulrummet (ventrale aspekt af dyr) og højre og venstre halvdele af halvcirkler angiver højre og venstre væg af lumenet. Kortet kan bruges til at beskrive placeringen og vandrette størrelse af tumorer, samtsom ulcerationer.

2. Tumor numre for hver grad af tumor besættelse: Skønt colon kort giver kun to-dimensionelle oplysninger, i hvilket omfang svulster vokser ind i tarmlumen er et vigtigt element i tumorer, da fremspring kan forårsage intestinal stenose eller obstruktion. For at indfange denne information har vi tilføjet en optagelse grafen for procent fremspring ind i lumen, der dokumenterer antallet af tumorer i hver procent rækkevidde, så en tre-dimensionel perspektiv til at vurdere omfanget af colon tumorer.

C. Decimal identifikatorer for at gøre numeriske scoringer meningsfuld og hurtige relevante sager

Vores scoring system bruger en roman decimal identifikator system til registrering af tilstedeværelsen af ​​relevante læsioner eller komplikationer. Disse identifikatorer til beskrivende formål og er beregnet til at lette fortolkningen af ​​pointtal og hurtige tilfælde af endoskopisk interesse. Men de også tjene til numerisk vægt fremherskende typer af læsioner, og tillade generering af datasæt medgørlige til parametrisk statistik. Når du bruger den udviklede scoring formular, markere læsioner er relevant, og vælg én decimal identifikator skal lægges til den inflammatoriske score.

0. Ingen særlige resultater.
1. Perianal fistel eller overdreven perianal inflammation, rektal prolaps.
2. Primært eroderende læsioner med mindre væg involvering.
3. Delvis ulcerøse læsioner, nogle dækket med fibrin, blødning eller store med uregelmæssige former på grund af sammensmeltning af små sår (antallet af sår kan registreres som 0,301 for en tumor, 0.302 to tumorer, 0,311 elleve tumorer osv.).
4. Intestinal striktur (valgfri fordi forsnævring er en alvorlig inflammatorisk komplikation i colitis, tilsættes 2 point til den samlede inflammatoriske score).
5. Veldefineret plak (tyk / uigennemsigtig væv i tarmvæggen, fx & #160; en flad lav højde tumor). Antallet af plaques kan optages som beskrevet for læsioner (dvs. 0,401, 0,402, ... 0.411, osv.). De kan vises som en flad ikke udvides overflade, der kan synes at rage op til ca 5-10%, som ændrer omkredsen udseende tarmlumen.
6. Fremspringende masse eller tumorform læsion. Antallet af masserne kan optages som beskrevet for læsioner (dvs. 0,601, 0,602, 0,611 ... osv.). De er tydeligvis svulmende, men kan forekomme flad, men rager> 15% af den udspilet omkredsen af ​​tarmlumen.
7. Provokeret tåre / perforering under endoskopi.
8. Død af dyr under endoskopi.
9. Andet: _____________ (fx svær proksimal endoskopisk colitis, se Distal-proksimal Endoskopisk Colitis Scoring System nedenfor).

D. Eksempler og anvendelser

Den murine endoskopi pointsystem præsenteres i dette papir er specifically designet til at integrere indsamling og analyse af data om colon inflammation og kolorektale tumorer. Med hensyn til tumorer, kan data analyseres ved hjælp af flere statistiske metoder, herunder areal under kurven, median, modus, eller principal komponent analyse. På det individuelle plan kan pointsystem hjælpe forskerne overvåger colon sundhed i en enkelt mus over tid. Efter at summere de inflammatoriske underresultater og tilføje den rette decimal identifikator for type og antallet af læsioner i givet fald vil den samlede score give forskere til numerisk kvantificere omfanget af colon inflammation, den mest fremherskende type læsion, og antallet af læsioner. For eksempel en score på 12,609 indikerer, at denne mus har alvorlige colorectal betændelse og ni fremspringende svulster, en sund mus med en normal perianal region og kolorektal slimhinde, der blev perforeret under endoskopi ville have en samlet score på 0,7. Den decimal identifikator vil systemetgive forskere til at katalogisere og nemt søge store datalagre af ridsede mus. For eksempel kan en forsker indstilles søgekriterier for at identificere alle scoringer, der ender i "0.6" og hente alle sager, der har fremstående tumorer. Flere eksempler er illustreret i supplerende figurer S1-S3.

E. Distal-proksimal endoskopisk colitis pointsystem (D-PECS)

Dette er en valgfri ændring af vores decimal identifikator pointsystem til at skelne tilfælde med alvorlig / omfattende proksimale colitis. Fordi endoskopiske tegn på colitis og kolorektale tumorer hos mus synes at udvikle konsekvent i de distale dele af tyktarmen anbefaler vi:

• At score kolon efter de kriterier, der er beskrevet, med særlig vægt på de distale to tredjedele af tyktarmen og ignorere det proximale segment, hvis det er tilsyneladende sundt. Derved undgås forvirring og øger diskriminerende magt endoskopi til differentiate dyr med forskellige grader af omfattende colitis.
• Hvis der observeres inflammatoriske eller tumor ændringer i den proximale tredjedel, anbefaler vi at tilføje et punkt til den samlede score (1.0) og tildele decimal identifikator som '0 .9 - Andre ', som kunne mærkes som svær proksimal endoskopisk colitis. Plot resultaterne i kortet nettet og søjlediagram.
• Monitor dyr med endoskopiske abnormiteter i den proximale tredjedel af tyktarmen. Vær særlig opmærksom obduktion, da sygdommen kan være usædvanlig alvorlig eller kan strække sig ud over milt bøjning mod den proksimale kolon.
• Hvis denne anbefaling blev fulgt, registrere denne tilgang i 'observationer afsnittet' af evalueringsskema, og følge denne tendens på tværs af eksperimenter. Bedes citeret i dit endelige publikation, at vurderingen blev foretaget efter vores 'distal-proksimal endoskopisk colitis pointsystem "eller D-PECS, der spænder fra 0 til 13,9. Bemærk, at denne ændring ikke har nogen s TATISTISKE effekt på vores pointsystem, hvis de anvendes i dyr uden omfattende / svær proksimal colitis.

Supplerende tal.

Figur s1. Eksempel på endoskopisk vurdering af en mus med kolorektale tumorer. Dyrene blev behandlet med AOM og DSS forudgående endoskopi. A) Repræsentant billede i normal og NBI tilstand, hhv. B) Scoring udfyldt med endoskopiske fund. Bemærk, at selv om der er to relevante resultater, forskeren har valgt at tildele decimal identifier 0,6 baseret på klinisk sværhedsgrad og forskningsmæssige mål. En række af parametrisk statistisk analyse kan udføres med de data, der er registreret i den »Kort af tumorer / sår« og »Record of tumor fremspring 'diagrammer. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur S2. Eksempel på en mus med en colon forsnævring og en endoskopisk komplikation. Bemærk indsnævring af tarmlumen, og at en nonperforating, slimhinde tåre blev induceret under endoskopi lige distalt for forsnævring site. Indsnævring og svækkelse af den betændte tyktarm kan resultere i mucosale tårer. Dyret var under fuld narkose. Bemærk, at pointsystemet har givet os mulighed for at overvåge og reducere proceduremæssige komplikationer. Klik her for at se større billede .

43/FigureS3.jpg "width =" 500px "/>
Figur s3. Eksempel på tidsforløb for inflammation og endoskopisk scoring i en DSS-behandlede mus Bemærk. At tallene kan være selvforklarende og viser, at colon inflammation skred (1-5 og 8), og at erosioner udviklet af dag 8 (decimal 0.2 ) og sår ved dag 11 (decimal 0.3). Klik her for at se større billede .

Discussion

Der er flere overvejelser om ændring og fejlfinding af den endoskopiske teknik i mus. Kritiske aspekter af proceduren, som skal beherskes under brug af fleksibel endoskopi omfatte justering af luftmængden nødvendig for at forhindre abdominal udspiling og respiratorisk kompromis på musen, og mindre tekniske aspekter af view kontrol med koordinering af vinkling og drejningsmoment kontrol . Moment er vigtig for at minimere risikoen for intestinal perforation. Når håndteres korrekt, murine fleksibel endoskopi bliver en meget sikker, hurtig procedure, der giver mulighed for direkte visualisering og biopsi prøvetagning af intestinale forskningsområder interesse.

For at løse view forhindringer på grund af fækalt materiale (figur 5), er det vigtigt at forstå, at fækalpellets normalt observeres selv efter faste eller brug af afføringsmidler. Når der forekommer kan afføring nemt flyttes proksimalt med blide luft insufflation. I omkring 11% af tilfældene, er det nødvendigt også at anvende 1 ml PBS lavement. Forud for gennemførelsen af ​​lavement, udvise forsigtighed, når behandlingen af ​​dyr, der synes at have abdominal udspilning, eller som er gravid. For peristaltiske bevægelser er det vigtigt at vente et par sekunder, indtil peristaltiske bølge passerer da luft insufflation ikke stopper peristaltikken.

Hidtil har de fleste endoskopiske vurdering systemer, der anvendes til at evaluere murine tarmsygdom er specifikke for enten colitis eller cancer. Da disse to betingelser opstår ofte samtidig og kan interagere med hinanden, et standardiseret pointsystem, der tager hensyn til både inflammation og tumor dannelse ville i høj grad lette tværfaglig kommunikation og dermed øge anvendeligheden af ​​oplysninger opnået under gastrointestinal forskning ved kræftforskere, og vice versa. Fordi tumorer sjældent eksistere uden at fremkalde en form for inflammatorisk ændring i kolorektal region in mus, har vi inkluderet tumorer i decimal identifikatorer del af vores pointsystem til entydigt at tillade undersøgelse af tumorer i forbindelse med tarm sundhed. For at øge gyldigheden og pålideligheden af pointsystemet og lette dens anvendelse i langtidsforsøg eller kliniske forsøg, har vi også udviklet en standardiseret rapport formular til brug sammen med pointsystemet (figur 2), som systematisk gemmer data, der kræves til beregne murine tarmbetændelse scoringer, baseret på præcise definitioner for hver klassificeringskriterier.

Den tidligere tilgængelighed af flere murine endoskopi pointsystemer af begrænset gyldighed hindrer fortolkning af resultater på tværs af studier. For at minimere forvirringen opleves af laboratorie-personalet at afgøre, hvilken publiceret metode til at bruge, anbefaler vi udfører endoskopisk vurdering, brug af kriterier, der kan udledes fra to-dimensionelle billeder (fx undgå kriterier that refererer til tekstur eller konsistens - af afføring. opmærksom på, at nogle mus, herunder kim-fri, kan have blød afføring), og som ikke er co-lineær (dvs. der er fysiologisk og tidsligt drevet af samme inflammatoriske kontekst) Da de kardinale tegn af inflammation er sekventiel grund kronologiske inflammatoriske begivenheder, anbefaler vi følgende kriterier: 1) tarm gennemsigtighed, først beskrevet af Becker et al ^4, som en afspejling af godstykkelse, 2) blødning, som en indikator for slimhinde og blodkar integritet. 3) perianale resultater, som en indikator for colon integritet og hudirritation eller prædisposition for overdreven inflammation, og 4) fokale læsioner, til karakteren alvorligheden af ​​inflammatoriske læsioner (som i mus primært colitis). Til dato har vi ikke set tumorform læsioner i de typiske modeller for 3% DSS-induceret muse colitis. Den murine endoskopisk pointsystem er beskrevet i dette papir giver for første gang, at vores videnen kvantitativ mekanisme til evaluering af tilstedeværelsen og induktion af tumorøse læsioner i forbindelse med colon inflammation.

For første gang, vi fremhæver også betydningen af at medtage strikturer som en parameter i løbet af murine endoskopi, da de synes at være almindeligt til stede i visse dyremodeller for tarmbetændelse, fx SAMP / Yit / Fc. Strikturer repræsenterer (semi) perifere områder af submukøst kronisk inflammation, med tab af tarm-elasticitet på grund af øget fibrose, som er vanskelige at vurdere endoskopisk for nybegyndere. Vi har bemærket i endoskopisk definerede striktur-ramte mus, at der er mere inflammation i segmenter, der er proximalt til forsnævring i forhold til de distale segmenter (som skal behandles endoskopisk), sandsynligvis på grund af langsommere intestinal transit. Til forskningsformål, er det tilrådeligt at følge op dyr histologisk ved afslutningen af ​​forsøgene til bedre at karakterisere betændelsesreaktionermatory reaktioner, der flankerer kandidat striktur regioner.

Uden ordentlig uddannelse og ekspert feedback, kan enhver pointsystem have variation på ethvert givet tidspunkt. Det er vigtigt at understrege, at endoskopiske uddannelsesprocedurer udført på mus bør overvåges af en uddannet veterinær medicinsk professionel til at sikre: i) passende uddannelse af andre forskere eller teknikere, og ii) at sikre, at dyrene ikke fejldiagnosticeret eller uforvarende såret under procedure. Konsultere dyrlæge ansvaret for din dyreforskning facilitet for ekspertrådgivning før man går videre til at gennemføre denne procedure for at sikre de bedst mulige praksis og dyrevelfærd. Det er tilrådeligt at rutinemæssigt overvåge effektiviteten af ​​uddannede endoscopists. Brug de billeder, vi har præsenteret heri som retningslinjer, randomisere den rækkefølge, som dyr evalueres, og vurdere hvert dyr i en blindet måde. Rådfør parameterdefinitioner og protokol kriterier periodisk og kEEP dem ved hånden under endoskopi og scoring afsnit 6).

Sammenfattende som et team af medicinske og veterinære gastroenterologer, præsenterer vi en standardiseret protokol og semi-kvantitativ pointsystem for endoskopisk evaluering af murine modeller af colitis og tumorer. Disse forskning værktøjer vil gøre det muligt for forskerne at gennemføre rutinemæssige murine endoscopies, og vil tillade forskning personale på alle niveauer af erfaring til at skabe reproducerbare og sammenlignelige foranstaltninger af tarmbetændelse og tumor dannelse på tværs af laboratorier og mellem discipliner. Vi har udviklet systemet til at udarbejde meningsfulde numeriske scores med høj validitet, og forudsat kapacitet til hurtig sporing af bestemte resultater, som kan være tilpasses til intern brug inden for de enkelte laboratorier. Vi beskriver også en diskriminerende scoring alternativ, der tager hensyn til forskelle i regional modtagelighed for sygdomme i tyktarmen (se afsnit E, ̵6, Distal-proksimal endoskopisk colitis pointsystem, akronym D-PECS). De data rapport form og nogle tal kan bruges som væg plakater til støtte uerfarne forskere (figur 1, 3, 5, 6). En vellykket gennemførelse af murine endoskopi hængsler på at blive fortrolig med den normale anatomi mukokutan krydset i anus, endetarm, tyktarm, og de ​​omkringliggende organer, som anatomiske forskelle tegner sig for subtile endoskopiske forskelle ^17.

Selv på nuværende tidspunkt selv de mindste, mest fleksible, og fineste endoskopiske teknologier ikke kan nå den proksimale colon in vivo, hurtig bevægelse teknologiske fremskridt inden for kapslen og enkelt fiber endoskopi kan blive tilgængelige for mus i den nærmeste fremtid. Den standardiserede protokol og endoskopiske pointsystem præsenteres i dette papir udgør værdifulde værktøjer til at visualisere og vurdere status for den murine tarmmiljøet i levende dyr. Disse værktøjer vil lettetate sammenlignelighed af resultater mellem papirer og på tværs af fag, og vil have anvendelighed til nye og kommende murine endoskopiske teknologier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System